CN111704648B - 以氧桥双环庚烯类化合物为雌激素受体配体的蛋白水解靶向嵌合体化合物及制备方法与应用 - Google Patents

以氧桥双环庚烯类化合物为雌激素受体配体的蛋白水解靶向嵌合体化合物及制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了以氧桥双环庚烯类化合物为雌激素受体配体的蛋白水解靶向嵌合体化合物及制备方法与应用。采用两种合理的合成方式，以VHL配体或CRBN配体作为E3连接酶配体部分，通过不同长度烷基侧链连接氧桥双环庚烯类磺酸酯或磺酰胺雌激素受体配体，合成得到一系列目标产物Protac分子。这类Protac分子与现有的抗乳腺癌药物他莫昔芬的作用方式有所不同，是一类靶向雌激素下调剂。此类化合物不仅保留一定与雌激素受体结合的能力，而且具有与氟维司群相当的良好的雌激素受体α下调活性，可以实现事件驱动型靶向雌激素受体降解，有望通过该法来克服ER阳性乳腺癌传统内分泌治疗带来的耐药。

Description

以氧桥双环庚烯类化合物为雌激素受体配体的蛋白水解靶向 嵌合体化合物及制备方法与应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，涉及一类以氧桥双环庚烯类化合物为雌激素受体配体的靶向蛋白水解嵌合体及其制备方法和在靶向雌激素受体治疗乳腺癌中的应用。
背景技术
乳腺癌作为全球女性最常见的癌症，其高发病率及死亡率严重威胁女性健康。其中，雌激素受体(ER)阳性乳腺癌占全部乳腺癌的70％左右，针对ER信号通路的内分泌疗法是目前临床治疗的主要手段之一。然而，内分泌治疗，例如其代表药物他莫昔芬对雌激素受体同时具有激动和拮抗活性，长期使用会引起耐药。内分泌治疗的耐药性已成为ER阳性乳腺癌治疗中亟待解决的问题，然而近年来，靶向蛋白降解的PROTAC技术的发展，为药物耐药的治疗提供了新的思路。PROTAC技术的关键点在于，其分子的两端分别识别靶蛋白和E3泛素连接酶并形成靶蛋白-PROTAC-E3的三元复合物。接着靶蛋白被泛素标记后，最终通过泛素-蛋白酶体的途径被降解。这种直接让靶蛋白降解的策略并不依赖于和靶蛋白活性口袋结合发挥抑制作用，所以可以克服现有的靶蛋白点突变带来的耐药性。
蛋白降解并不仅仅取决于二元目标蛋白与配体的亲和力，而是取决于三联体的活性，而PROTAC的连接的构象和位点，连接链的长度和组成的修饰以及浓度等都会对三联体的活性产生影响，因此调控起来更加有难度。PROTAC技术现在需要探究的问题主要包括优化其设计，合成与评价，同时扩大可用E3泛素连接酶的范围，选择和验证靶点以及最终靶向无成药性的蛋白。PROTAC在近二十年的发展中，随着对各种E3连接酶的进一步认识，E3连接酶配体部分也经历了从多肽到小分子的跨越性发展。这个进步也为PROTAC的多样性设计开辟了新的思路，同时也为PROTAC临床成药性打下了坚实的基础。
因此，为了克服雌激素受体(ER)阳性乳腺癌传统内分泌治疗带来的耐药，需要基于靶向蛋白降解的PROTAC技术，获得蛋白降解活性更好的可以进行模式化设计合成的新型靶向降解ER的活性化合物，并且通过该法来克服ER阳性乳腺癌传统内分泌治疗带来的耐药。
发明内容
为了克服现有技术存在的不足，本发明的首要目的是提供一种以氧桥双环庚烯类化合物为雌激素受体配体的蛋白水解靶向嵌合体化合物。在本申请发明人研究团队之前的研究中，发现具有特殊三维立体结构的氧桥双环-[2.2.1]-庚烯磺酰胺结构OBHSA类化合物(式1、2所示)具有一定的ERα下调活性。目前发现的E3连接酶有600多种，它们在不同组织和细胞中表达不同，结合研究团队之前研究发现的少数靶向ER蛋白的PROTAC分析，本申请把目光主要放在拥有特异性小分子配体的CRBN和VHL连接酶上。因此，以研究团队多年研究发现的靶向ER的OBHSA类优势骨架为基础，选择两种E3连接酶配体作为三元复合物的另一组成部分，以简单烷基侧链连接这两个部分合成目标化合物。
Figure GDA0002612956640000021
本发明的第二目的，是提供蛋白水解靶向嵌合体化合物的制备方法，在合成中，利用不同路线高效获得目标化合物，总结出了一条适用性强、产率高的合成路线。
本发明第三目的，是提供蛋白水解靶向嵌合体化合物的应用。相比于先前文献中报道的使用雌二醇或者选择性雌激素受体调节剂作为ER配体部分，本发明所得化合物首次阐明了雌激素受体下调剂作为ER配体部分设计所得蛋白水解靶向嵌合体(Protac)分子对ER降解能力的正向作用。获得了蛋白降解活性更好的可以进行模式化设计合成的新型靶向降解ER的活性化合物，并且有望通过该法来克服ER阳性乳腺癌传统内分泌治疗带来的耐药。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
第一方面，提供一种以氧桥双环庚烯类化合物为雌激素受体配体的蛋白水解靶向嵌合体化合物，具有以下通式结构：
Figure GDA0002612956640000031
优选地，所述的以氧桥双环庚烯类化合物为雌激素受体配体的蛋白水解靶向嵌合体化合物选自以下任意一种：
(2S,2R)-1-((2S)-2-(6-(4-((N-乙基-5,6-双(4-羟苯基)-7-氧杂双环[2.2.1]-5-庚烯)-2-磺酰胺基)苯氧基)己酰胺)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-羧酰胺(26b)、
(2S,2R)-1-((2S)-2-(7-(4-((N-乙基-5,6-双(4-羟苯基)-7-氧杂双环[2.2.1]-5-庚烯)-2-磺酰胺基)苯氧基)庚酰胺)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-羧酰胺(26c)、
(2S,2R)-1-((2S)-2-(5-(4-((N-乙基-5,6-双(4-羟苯基)-7-氧杂双环[2.2.1]-5-庚烯)-2-磺酰胺基)苯氧基)戊酰胺)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)吡咯烷-2-羧酰胺(26g)、
(2S,2R)-1-((2S)-2-(6-(4-((N-乙基-5,6-双(4-羟苯基)-7-氧杂双环[2.2.1]-5-庚烯)-2-磺酰胺基)苯氧基)己酰胺)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)吡咯烷-2-羧酰胺(26h)、
(2S,2R)-1-((2S)-2-(7-(4-((N-乙基-5,6-双(4-羟苯基)-7-氧杂双环[2.2.1]-5-庚烯)-2-磺酰胺基)苯氧基)庚酰胺)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)吡咯烷-2-羧酰胺(26i)、
(2S,2R)-1-((2S)-2-(6-(4-((5,6-双(4-羟苯基)-N-(2,2,2-三氟乙基)-7-氧杂双环[2.2.1]-5-庚烯)-2-磺酰胺基)苯氧基)己氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-羧酰胺(26k)、
(2S,2R)-1-((2S)-2-(6-(4-((5,6-双(4-羟苯基)-N-(2,2,2-三氟乙基)-7-氧杂双环[2.2.1]-5-庚烯)-2-磺酰胺基)苯氧基)己氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-((S)-1-4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)吡咯烷-2-羧酰胺(26l)、
2-氯-4-((6-((((S)-1-((2S，4R)-4-羟基-2-(((4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)氨基甲酰基)吡咯烷-1-基)-3,3-二甲基-1-氧丁烷-2-基)氨基)-6-氧己基)氧基)-5,6-双(4-羟基苯基)-7-氧杂双环[2.2.1]-5-庚烯-2-磺酸酯(26m)、
2-氯-4-((6-((((S)-1-((2S，4R)-4-羟基-2-(((4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)氨基甲酰基)吡咯烷-1-基)-3,3-二甲基-1-氧丁烷-2-基)氨基)-6-氧己基)氧基)-5,6-双(4-羟基苯基)-7-氧杂双环[2.2.1]-5-庚烯-2-磺酸酯(26n)。
第二方面，提供上述以氧桥双环庚烯类化合物为雌激素受体配体的蛋白水解靶向嵌合体化合物在制备抗乳腺癌药物中的应用。
第三方面，提供上述以氧桥双环庚烯类化合物为雌激素受体配体的蛋白水解靶向嵌合体化合物的制备方法，通过下面所示反应，合成Boc-叔亮氨酸羟脯氨酸噻唑类衍生物9、带长侧链的E3配体12a-i和15、带己酸侧链的ER配体部分18,21a-b和24，具体包含以下步骤：
1)、叔丁基((S)-1-((2S,4R)-4-羟基-2-((4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)氨基甲酰基)吡咯烷-1-基)-3,3-二甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基甲酸酯9a和叔丁基((S)-1-((2S,4R)-4-羟基-2-(((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯乙基)氨基甲酰基)吡咯丁-1-基)-3,3-二甲基-1-氧丁丁-2-基)氨基甲酸酯9b的合成：
Figure GDA0002612956640000051
试剂和反应条件：(a)二碳酸二叔丁酯，二氯甲烷，三乙胺，25℃，12小时；(b)二甲基乙酰胺，醋酸甲，二甲基乙酰胺，150℃，回流，反应过夜；(c)三氟乙酸，二氯甲烷，25℃，0.5小时；(d)2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯，N,N-二异丙基乙胺，Boc-L-羟脯氨酸，N,N-二甲基甲酰胺，25℃，1小时；(e)1.三氟乙酸，二氯甲烷，25℃，0.5小时；2.2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯，N,N-二异丙基乙胺，Boc-L-叔亮氨酸，N,N-二甲基甲酰胺，25℃，0.5小时。
(1)、(4-溴苄基)氨基甲酸叔丁酯4a和(R)-(1-(4-溴苯基乙基)氨基甲酸叔丁酯4b的合成:
分别称取化合物4-溴苄胺3a(1.99g，10.75mmol)或其类似物(R)-1-(4-溴苯基)乙-1-胺3b(2.14g，10.75mmol)置于两个50mL双口瓶中，抽真空导氩气，依次加入10mL二氯甲烷，三乙胺(2.26mL，16.13mmol)，冰浴10分钟后缓慢加入溶有二碳酸二叔丁酯(2.82g，12.9mmol)的二氯甲烷(10mL)溶液，5分钟加完，室温下反应过夜。TLC确认反应完全后，加水淬灭，二氯甲烷萃取，有机相无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩旋干后，经硅胶柱层析分离纯化得到白色固体化合物4a(产率为97％)或4b(产率为93％)；
4a:1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.43(d,J＝6.9Hz,2H),7.14(d,J＝7.6Hz,2H),4.93(s,1H),4.24(d,J＝5.2Hz,2H),1.44(s,9H).
4b:1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.52(d,J＝8.1Hz,2H),7.33(d,J＝8.2Hz,2H),4.94(s,1H),4.70(q,J＝6.5Hz,1H),1.45(s,9H),1.36(d,J＝6.6Hz,3H).
(2)、(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)氨基甲酸叔丁酯6a和(R)-(1-(4-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)氨基甲酸酯叔丁基6b的合成:
在氩气保护下，分别称取4a(3.04g，10.0mmol)或4b(3.18g，10.0mmol)，4-甲基噻唑(1.98g，20.0mmol)，醋酸钯(225mg，1.0mmol)，醋酸钾(3.93g，40.0mmol)置于100mL圆底烧瓶中，加入25mL溶剂N,N-二甲基乙酰胺，150℃下反应过夜。TLC确认反应完全后，加水淬灭，二氯甲烷萃取，有机相经过水洗后，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩旋干，经硅胶柱层析分离纯化得到白色固体化合物6a(产率为93％)或6b(产率为95％)。
6a:1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.63(s,1H),7.37(d,J＝8.1Hz,2H),7.31(d,J＝8.0Hz,2H),5.17(s,1H),4.32(d,J＝5.7Hz,2H),2.49(s,3H),1.44(s,9H).
6b:1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.59(s,1H),7.51(d,J＝8.1Hz,2H),7.43(d,J＝8.2Hz,2H),4.94(s,1H),4.70(q,J＝6.5Hz,1H),2.48(s,3H),1.45(s,9H),1.33(d,J＝6.6Hz,3H).
脱Boc反应通法:将化合物置于适合容量的单口瓶中，加入二氯甲烷使其溶解，冰浴下滴加与二氯甲烷等体积的三氟乙酸，并在此温度下反应1小时。旋干后再多次加入二氯甲烷旋干除去三氟乙酸。
氨基化合物和羧酸化合物缩合成酰胺的反应通法：在氩气的保护下，称取氨基化合物于两口瓶中，少量无水N,N-二甲基甲酰胺溶解后，依次加入羧酸化合物，缓慢滴加N,N-二异丙基乙胺，室温搅拌5分钟后加入2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)。TLC检测反应完全后加水淬灭，乙酸乙酯(3×30mL)萃取，有机层用饱和食盐水洗三次以上除去反应溶剂N,N-二甲基甲酰胺，有机层用无水硫酸钠干燥，减压蒸馏除去溶剂，柱层析纯化得产物。
(3)、化合物6a或6b经过脱Boc反应得到化合物7a或7b后，其氨基部分再与Boc-L-羟脯氨酸中的羧基发生缩合得到化合物8a或8b。随后，再经过一步脱Boc反应后，与N-Boc-L-叔亮氨酸进行缩合反应得到黄色固体化合物9a(产率为58％)或9b(产率为55％)。
9a:1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.87(s,1H),7.45(d,J＝8.1Hz,2H),7.40(d,J＝8.2Hz,2H),4.60(t,J＝8.3Hz,1H),4.53(d,J＝15.5Hz,2H),4.35(d,J＝15.5Hz,1H),4.30(s,1H),3.92–3.74(m,2H),2.47(s,3H),2.28–2.17(m,1H),2.12–2.05(m,1H),1.43(s,9H),1.01(s,9H).
9b:1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.66(s,1H),7.36(s,4H),5.09–5.02(m,1H),4.75(t,J＝7.9Hz,1H),4.43(s,1H),3.74(d,J＝11.0Hz,1H),3.58(d,J＝8.3Hz,2H),2.50(s,3H),2.24(s,1H),2.16–2.09(m,1H),1.48(d,J＝6.8Hz,3H),1.35(s,9H),1.00(s,9H).
2)、带长侧链的E3配体12a-i和15的合成：
Figure GDA0002612956640000071
试剂和反应条件：(a)三氟乙酸，二氯甲烷，25℃，0.5小时；(b)2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯，N,N-二异丙基乙胺，N,N-二甲基甲酰胺，25℃，0.5小时；(c)氯化亚砜，二氯甲烷，回流，4小时；(d)四氢呋喃，回流，过夜。
(1)、6-((1-((2S,4R)-4-羟基-2-((4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)氨基甲酰基)吡咯烷-1-基)-3,3-二甲基-1-氧丁烷-2-基)氨基)己酸类似物12的合成：
称取化合物9a或9b(1.0equiv.)溶于TFA:DCM＝1:1的混合溶液中，反应30min后减压蒸馏除去溶剂，得到脱保护中间体化合物10a或10b。然后，在氩气保护下，取中间体化合物10a或10b于25mL两口瓶中，用无水DMF溶解，加入不同长度的溴代烷基酸11a-f(1.0equiv.)，逐滴加N,N-二异丙基乙胺(8.0equiv.)，室温下搅拌5min后加入2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(1.1equiv.)，室温条件下反应30min，加水淬灭，乙酸乙酯萃取，有机层用饱和食盐水洗涤后用无水硫酸钠干燥，减压蒸馏除去溶剂，柱层析纯化得到黄色固体化合物12a-i(产率为54％-63％)。
12b:1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.87(s,1H),7.45(d,J＝8.2Hz,2H),7.38(d,J＝8.1Hz,2H),4.63(dd,J＝8.0,4.9Hz,1H),4.59(d,J＝8.5Hz,1H),4.53(d,J＝15.7Hz,2H),4.36(d,J＝15.5Hz,1H),3.92(d,J＝11.0Hz,1H),3.80(dd,J＝10.9,3.6Hz,1H),3.41(t,J＝6.7Hz,2H),2.46(s,3H),2.36–2.28(m,1H),2.29–2.19(m,2H),2.13–2.04(m,1H),1.88–1.78(m,2H),1.67–1.56(m,2H),1.50–1.40(m,2H),1.04(s,9H).
12c:1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.86(s,1H),7.45(d,J＝8.1Hz,2H),7.38(d,J＝8.1Hz,2H),4.64(d,J＝3.9Hz,1H),4.60(d,J＝8.0Hz,1H),4.53(d,J＝15.7Hz,2H),4.36(d,J＝15.6Hz,1H),3.93(d,J＝11.0Hz,1H),3.80(dd,J＝10.9,3.5Hz,1H),3.40(t,J＝6.7Hz,2H),2.45(s,3H),2.36–2.28(m,1H),2.27–2.18(m,2H),2.13–2.04(m,1H),1.85–1.75(m,2H),1.67–1.54(m,2H),1.47–1.38(m,2H),1.33(dd,J＝14.7,7.2Hz,2H),1.04(s,9H).
12d:1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.88(s,1H),7.46(d,J＝7.8Hz,2H),7.40(d,J＝8.0Hz,2H),4.70–4.63(m,1H),4.63–4.54(m,1H),4.50(t,J＝15.9Hz,2H),4.37(dd,J＝15.4,4.7Hz,1H),3.92(d,J＝10.9Hz,1H),3.81(dd,J＝10.7,3.5Hz,1H),3.42(t,J＝6.7Hz,2H),2.46(s,3H),2.36–2.29(m,1H),2.27–2.18(m,2H),2.13–2.02(m,1H),1.84–1.77(m,2H),1.65–1.56(m,2H),1.44–1.38(m,2H),1.34–1.29(m,4H),1.04(s,9H).
12e:1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.86(s,1H),7.44(d,J＝7.1Hz,2H),7.37(d,J＝6.9Hz,2H),4.64(s,1H),4.60(d,J＝8.3Hz,1H),4.53(d,J＝16.0Hz,2H),4.36(d,J＝15.4Hz,1H),3.93(d,J＝10.4Hz,1H),3.81(d,J＝8.4Hz,1H),3.39(t,J＝6.0Hz,2H),2.45(s,3H),2.33–2.27(m,1H),2.26–2.18(m,2H),2.13–2.05(m,1H),1.84–1.74(m,2H),1.62–1.53(m,2H),1.37(s,2H),1.29(s,6H),1.04(s,9H).
12f:1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.87(s,1H),7.45(d,J＝8.0Hz,2H),7.37(d,J＝8.0Hz,2H),4.65(s,1H),4.61(d,J＝8.0Hz,1H),4.54(d,J＝15.9Hz,2H),4.36(d,J＝15.5Hz,1H),3.93(d,J＝10.8Hz,1H),3.85–3.76(m,1H),3.39(t,J＝6.7Hz,2H),2.45(s,3H),2.35–2.27(m,1H),2.27–2.18(m,2H),2.14–2.03(m,1H),1.85–1.73(m,2H),1.64–1.53(m,2H),1.42–1.36(m,2H),1.28(s,8H),1.04(s,9H).
(2)、5-溴-N-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚-4-基-戊基)戊酰胺15的合成：
称取5-溴己酸11b(181.0mg，1.0mmol)置于25mL单口瓶中，加入5mL二氯甲烷使其溶解，缓慢滴加二氯亚砜(0.5mL，过量)，回流4小时后，将溶剂旋干，然后依次加入无水四氢呋喃5mL，泊马度胺14(136.6mg，0.5mmol)，回流17小时。TLC确认反应完全后，旋干，用流动相比例(二氯甲烷：甲醇＝50:1)过硅胶柱纯化得到化合物15(产率为74％)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.18(s,1H),9.73(s,1H),8.47(t,J＝7.0Hz,1H),7.83(t,J＝7.9Hz,1H),7.62(d,J＝7.3Hz,1H),5.16(dd,J＝12.7,5.3Hz,1H),3.54(t,J＝6.7Hz,2H),2.68–2.55(m,2H),2.50(q,J＝7.5Hz,4H),1.89–1.79(m,2H),1.70–1.60(m,2H),1.50–1.40(m,2H).
3)、带己酸侧链的ER配体部分18,21a-b,24的合成
Figure GDA0002612956640000091
试剂和反应条件：(a)6-溴己酸乙酯，碳酸钾，丙酮，50℃，8小时；(b)1.22，四氢呋喃，90℃，8小时；2.氢氧化锂，50℃，10小时；(c)1.N-(4-甲氧基苯基)-N-(2,2,2-三氟乙基)乙磺酰胺，四氢呋喃，90℃，8小时；2.氢氧化锂，50℃，10小时
Diels-Alder反应的合成通法：在Ar的保护下，将具有不同的呋喃衍生物和适当的亲二烯体放入圆底烧瓶中，然后加入无水THF(2mL)用作助溶剂。将反应在90℃加热下搅拌8小时，然后加入水以淬灭反应，并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，随后进行硅胶柱色谱纯化产物。
(1)、3-(4-((((5,6-双(4-羟基苯基))-N-(2,2,2-三氟乙基))-7-氧杂环环[2.2.1]庚-5-烯)-2-磺酰胺基)苯氧基)己酸化合物18的合成：
化合物16的苯酚羟基与6-溴己酸乙酯在碱性条件下发生取代反应成含有酯侧链的化合物17，再与22发生Diels-Alder反应，所得DA产物在氢氧化锂作用下水解得到化合物18(产率为84％)。
(2)、4-(3-氧丙氧基)苯基5,6-双(4-羟基苯基)-7-氧杂双环[2.2.1]庚-5-烯-2-磺酸酯类似物21a-b的合成：
化合物19a或19b的苯酚羟基与6-溴己酸乙酯在碱性条件下发生取代反应成含有酯侧链的化合物20a或20b，再与22发生Diels-Alder反应，所得DA产物在氢氧化锂作用下水解得到化合物21a(产率为73％)或21b(产率为77％)。
(3)、N-(4-甲氧基苯基)-N-(2,2,2-三氟乙基)甲磺酰胺3-(4-(3-(4-羟基苯基)-7-氧杂双环[2.2.1]庚烷-2-烯-2-基)苯氧基)丙酸酯化合物24的合成：
化合物22的一侧苯酚羟基与6-溴己酸乙酯在碱性条件下发生取代反应成含有酯侧链的化合物23，再与亲二烯体22发生Diels-Alder反应，所得DA产物在氢氧化锂作用下水解得到化合物24(产率为78％)。
4)、目标化合物26a-j的合成：
Figure GDA0002612956640000111
试剂和反应条件：(a)N-乙基-N-(4-羟苯基)乙磺酰胺，碳酸钾，N,N-二甲基甲酰胺，85℃，12小时；(b)22，四氢呋喃，90℃，8小时；(c)N-乙基-N-(4-羟苯基)乙磺酰胺，碘化钾，碳酸钾，乙腈，80℃，12小时
(1)、(2S，4R)-1-((S)-2-(6-(4-(N-乙基乙烯基磺酰胺基)苯氧基)六氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-((S-1)-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)吡咯烷-2-羧酰胺类似物25a-i的合成：
将化合物12a-i在碱性条件下与等摩尔量的亲二烯体的苯酚的羟基发生亲核取代反应得到化合物25a-i(产率为41-63％)。
(2)、目标化合物26a-i的合成：
通过化合物25a-i和22的Diels-Alder反应制得(产率为61-72％)。
(3)、N-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚-4-基)-3-(4-(N-乙基乙烯基磺酰胺基)苯氧基)丙酰胺化合物25j的合成：
在氩气保护下，称取化合物15(393.2mg,1.0mmol)，碘化钾(199.2mg,1.2mmol),碳酸钾(207.3mg,1.5mmol)，N-乙基-N-(4-羟苯基)乙磺酰胺(272.4mg,1.2mmol)于50ml的圆底烧瓶中，加入20mL无水乙腈,80℃搅拌反应过夜。TLC确认反应完全后，加水淬灭，乙酸乙酯萃取，有机相经无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩旋干，再经硅胶柱层析分离纯化得到化合物25j(产率为30％)。1H NMR(400MHz,Acetone-d6)δ10.02(s,1H),9.53(s,1H),8.82(d,J＝8.5Hz,1H),7.87–7.82(m,1H),7.58(d,J＝7.2Hz,1H),7.27–7.22(m,2H),6.97–6.93(m,2H),6.77(dd,J＝16.5,9.9Hz,1H),6.05(d,J＝1.6Hz,1H),6.02(d,J＝4.9Hz,1H),5.18(dd,J＝12.7,5.5Hz,1H),4.05(t,J＝6.4Hz,2H),3.61(q,J＝7.1Hz,2H),2.83–2.73(m,4H),2.63(t,J＝7.4Hz,2H),1.92–1.80(m,2H),1.68–1.58(m,2H),1.31(s,2H),1.07(t,J＝7.1Hz,3H).
(4)、目标化合物26j的合成：
通过化合物25j和22的Diels-Alder反应的制得(产率为67％)。
5)、目标化合物26k-r的合成：
Figure GDA0002612956640000131
试剂和反应条件：(a)2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯，N,N-二异丙基乙胺，N,N-二甲基甲酰胺，25℃，4小时。
氨基化合物和羧酸化合物缩合成酰胺终产物26k-r的反应通法：在氩气的保护下，称取氨基化合物于两口瓶中，少量无水N,N-二甲基甲酰胺溶解后，依次加入羧酸化合物，缓慢滴加N,N-二异丙基乙胺，室温搅拌5分钟后加入2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)。TLC检测反应完全后加水淬灭，乙酸乙酯(3×30mL)萃取，有机层用饱和食盐水洗三次以上除去反应溶剂N,N-二甲基甲酰胺，无水硫酸钠干燥有机层，过滤后，减压蒸馏除去溶剂，柱层析纯化得产物26k-r。
第四方面，提供一种药物组合物，包含上述以氧桥双环庚烯类化合物为雌激素受体配体的蛋白水解靶向嵌合体化合物、一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。
第五方面，提供上述药物组合物在制备抗乳腺癌药物中的应用。
本发明提供了以氧桥双环庚烯类化合物为雌激素受体配体的蛋白水解靶向嵌合体化合物的合成方法，采用两种合理的合成方式，以VHL配体或CRBN配体作为E3连接酶配体部分，通过不同长度烷基侧链连接氧桥双环庚烯类磺酸酯或磺酰胺雌激素受体配体，合成得到一系列目标产物Protac分子。这类Protac分子与现有的抗乳腺癌药物他莫昔芬(4-OHT)的作用方式有所不同，是一类靶向雌激素受体下调剂。此类化合物不仅保留一定与雌激素受体结合的能力，而且具有与氟维司群(Ful)相当的良好的雌激素受体α下调活性，如26b在1μM时与氟维司群降解活性相当。其中，大多数化合物对ERα有明显的下调活性,如26h,26i,26k,26l,26m的降解效果也相当良好。与传统雌激素受体下调剂不同，该类化合物可以实现事件驱动型靶向雌激素受体降解，有望通过该法来克服ER阳性乳腺癌传统内分泌治疗带来的耐药。此外，该方法首次引入雌激素受体下调剂作为ER配体，通过和雌激素受体调节剂OBHS类化合物作为ER配体的化合物相比，OBHSA类雌激素受体下调剂的引入对所得Protac分子对ER的降解有一定的促进作用。
附图说明
图1化合物26a-26i处理的MCF-7细胞中ERα降解的比较
A)用1μM的化合物Ful,26a-26i处理的MCF-7细胞中ERα的蛋白免疫印迹分析；
B)化合物26a-26i对ERα降解水平的比较；
图2化合物26j-26r处理的MCF-7细胞中ERα降解的比较
A)用1μM的化合物4-OHT，26j-26r处理的MCF-7细胞中ERα的蛋白免疫印迹分析；
B)化合物26j-26r对ERα降解水平的比较；
具体实施方式
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
实施例1：
(2S,2R)-1-((2S)-2-(5-(4-((N-乙基-5,6-双(4-羟苯基)-7-氧杂双环[2.2.1]-5-庚烯)-2-磺酰胺基)苯氧基)戊酰胺)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-羧酰胺(26a)
Figure GDA0002612956640000151
在氩气的保护下，将双羟苯基呋喃22(35mg,0.14mmol)和亲二烯体25a(103mg,0.14mmol)放入圆底烧瓶中，然后加入无水THF(2mL)用作助溶剂。将反应在90℃加热下搅拌8小时，TLC检测反应完全后，加入水以淬灭反应，并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，随后进行硅胶柱色谱纯化得到87mg黄色固体产物,63％产率；m.p.172–173℃；1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.86(s,1H),7.46(d,J＝8.1Hz,2H),7.39(d,J＝8.1Hz,2H),7.12(dd,J＝11.6,5.2Hz,6H),6.82–6.74(m,4H),6.72–6.68(m,2H),5.43(s,1H),5.27(t,J＝4.5Hz,1H),4.65(s,1H),4.61(d,J＝8.3Hz,1H),4.52(s,1H),4.36(d,J＝15.5Hz,1H),3.97–3.92(m,4H),3.81(dd,J＝10.8,4.1Hz,1H),3.74(dd,J＝10.9,4.6Hz,2H),3.41(dd,J＝6.9,4.5Hz,1H),2.46(s,3H),2.35(d,J＝9.1Hz,2H),2.27–2.18(m,2H),2.14–2.06(m,1H),2.05–1.96(m,1H),1.78(s,4H),1.07–1.02(m,12H).13C NMR(100MHz,MeOD)δ175.68,174.40,172.32,159.94,158.76,158.56,152.82,148.95,142.10,140.19,138.29,132.29,131.77,131.44,130.68,130.35,130.33,129.54,128.94,125.28,124.65,116.77,116.51,115.93,85.80,84.06,71.07,68.78,62.30,60.81,59.05,58.03,47.91,43.68,38.88,36.51,36.17,31.47,29.72,27.06,23.55,15.87,14.99.HRMS(ESI)calcdfor C53H61N5O10S2[M+Na]+,1014.3752；found 1014.3766.
实施例2:
(2S,2R)-1-((2S)-2-(6-(4-((N-乙基-5,6-双(4-羟苯基)-7-氧杂双环[2.2.1]-5-庚烯)-2-磺酰胺基)苯氧基)己酰胺)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-羧酰胺(26b)
Figure GDA0002612956640000161
在氩气的保护下，将双羟苯基呋喃22(35mg,0.14mmol)和亲二烯体25b(106mg,0.14mmol)放入圆底烧瓶中，然后加入无水THF(2mL)用作助溶剂。将反应在90℃加热下搅拌8小时，TLC检测反应完全后，加入水以淬灭反应，并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，随后进行硅胶柱色谱纯化得到94mg黄色固体产物,67％产率；m.p.176–177℃；1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.82(s,1H),7.43(d,J＝8.1Hz,2H),7.35(d,J＝8.1Hz,2H),7.14–7.04(m,6H),6.74(t,J＝9.1Hz,4H),6.68(d,J＝7.6Hz,2H),5.42(s,1H),5.25(s,1H),4.65(d,J＝7.0Hz,1H),4.58(t,J＝8.3Hz,1H),4.52(d,J＝15.8Hz,2H),4.33(d,J＝15.5Hz,1H),3.93(s,1H),3.88(dd,J＝11.8,5.3Hz,2H),3.79(d,J＝9.7Hz,1H),3.74–3.64(m,2H),3.39(dd,J＝8.0,4.6Hz,1H),2.43(s,3H),2.35–2.28(m,1H),2.27–2.18(m,2H),2.13–2.02(m,1H),1.97(t,J＝10.0Hz,1H),1.75–1.68(m,2H),1.66–1.59(m,2H),1.49–1.41(m,2H),1.05–0.97(m,12H).13C NMR(100MHz,MeOD)δ174.53,173.01,171.01,158.62,157.37,157.18,151.50,147.58,140.75,138.78,136.95,132.05,130.88,130.45,130.07,128.99,128.28,127.63,123.96,123.32,115.52,115.29,114.64,84.46,82.73,69.76,67.67,61.09,59.49,57.70,56.76,46.63,42.41,37.55,35.23,28.60,25.83,25.42,25.35,14.7,13.80.HRMS(ESI)calcd for C54H63N5O10S2[M+H]+,1006.4089；found1006.4062.
实施例3:
(2S,2R)-1-((2S)-2-(7-(4-((N-乙基-5,6-双(4-羟苯基)-7-氧杂双环[2.2.1]-5-庚烯)-2-磺酰胺基)苯氧基)庚酰胺)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-羧酰胺(26c)
Figure GDA0002612956640000171
在氩气的保护下，将双羟苯基呋喃22(35mg,0.14mmol)和亲二烯体25c(107mg,0.14mmol)放入圆底烧瓶中，然后加入无水THF(2mL)用作助溶剂。将反应在90℃加热下搅拌8小时，TLC检测反应完全后，加入水以淬灭反应，并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，随后进行硅胶柱色谱纯化得到91mg黄色固体产物,64％产率；m.p.178–179℃；1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.82(s,1H),7.43(d,J＝8.2Hz,2H),7.36(d,J＝8.1Hz,2H),7.14–7.06(m,6H),6.79–6.71(m,4H),6.68(d,J＝8.6Hz,2H),5.42(s,1H),5.26(d,J＝3.7Hz,1H),4.66(s,1H),4.64–4.56(m,2H),4.52(d,J＝15.8Hz,2H),4.33(d,J＝15.5Hz,1H),3.93(s,1H),3.88(dd,J＝11.2,4.7Hz,2H),3.78(dd,J＝11.0,4.1Hz,1H),3.75–3.65(m,2H),3.39(dd,J＝8.1,4.5Hz,1H),2.43(s,3H),2.34–2.26(m,1H),2.24–2.18(m,2H),2.11–2.03(m,1H),1.98(dd,J＝11.8,8.7Hz,1H),1.73–1.68(m,2H),1.64–1.58(m,2H),1.47–1.40(m,2H),1.38–1.31(m,2H),1.06–0.97(m,12H).13C NMR(100MHz,MeOD)δ174.61,173.01,171.00,158.67,157.38,157.19,151.48,147.59,140.76,138.79,136.95,132.05,130.86,130.44,130.08,128.99,128.26,127.62,123.95,123.31,115.48,115.25,114.61,84.46,82.74,69.74,67.74,61.07,59.48,57.66,56.72,46.62,42.39,37.54,35.21,28.74,28.59,25.79,25.53,25.43,14.65,13.76.HRMS(ESI)calcd for C55H65N5O10S2[M+H]+,1020.4246；found 1020.4214.
实施例4:
(2S,2R)-1-((2S)-2-(8-(4-((N-乙基-5,6-双(4-羟苯基)-7-氧杂双环[2.2.1]-5-庚烯)-2-磺酰胺基)苯氧基)辛酰胺)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-羧酰胺(26d)
Figure GDA0002612956640000181
在氩气的保护下，将双羟苯基呋喃22(35mg,0.14mmol)和亲二烯体25d(109mg,0.14mmol)放入圆底烧瓶中，然后加入无水THF(2mL)用作助溶剂。将反应在90℃加热下搅拌8小时，TLC检测反应完全后，加入水以淬灭反应，并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，随后进行硅胶柱色谱纯化得到87mg黄色固体产物,60％产率；m.p.180–181℃；1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.81(s,1H),7.42(d,J＝8.1Hz,2H),7.35(d,J＝8.1Hz,2H),7.10(t,J＝7.1Hz,6H),6.74(t,J＝9.2Hz,4H),6.68(d,J＝8.5Hz,2H),5.43(s,1H),5.25(s,1H),4.64(s,1H),4.64–4.53(m,2H),4.49(d,J＝15.0Hz,2H),4.45(s,1H),4.35(dd,J＝15.4,7.1Hz,1H),3.92(d,J＝10.3Hz,1H),3.88–3.83(m,2H),3.79(d,J＝7.6Hz,1H),3.74–3.64(m,2H),3.39(dd,J＝6.8,5.1Hz,1H),2.42(s,3H),2.33–2.24(m,1H),2.21(dd,J＝12.1,7.8Hz,2H),2.11–2.03(m,1H),2.00–1.93(m,1H),1.72–1.66(m,2H),1.62–1.55(m,2H),1.42–1.36(m,2H),1.31(s,4H),1.04–0.96(m,12H).13C NMR(100MHz,MeOD)δ174.66,173.08,170.98,158.67,157.39,157.21,151.49,147.59,140.73,138.80,136.94,132.03,130.86,130.44,130.08,128.99,128.25,127.63,123.93,123.30,115.47,115.23,114.57,84.44,82.73,69.72,67.81,61.07,59.45,57.61,56.73,46.61,42.38,37.54,35.49,35.24,28.85,28.75,25.94,25.80,25.59,14.65,13.76.HRMS(ESI)calcd for C56H67N5O10S2[M+H]+,1034.4402；found 1034.4374.
实施例5:
(2S,2R)-1-((2S)-2-(9-(4-((N-乙基-5,6-双(4-羟苯基)-7-氧杂双环[2.2.1]-5-庚烯)-2-磺酰胺基)苯氧基)壬酰胺)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-羧酰胺(26e)
Figure GDA0002612956640000191
在氩气的保护下，将双羟苯基呋喃22(35mg,0.14mmol)和亲二烯体25e(110mg,0.14mmol)放入圆底烧瓶中，然后加入无水THF(2mL)用作助溶剂。将反应在90℃加热下搅拌8小时，TLC检测反应完全后，加入水以淬灭反应，并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，随后进行硅胶柱色谱纯化得到78mg黄色固体产物,53％产率；m.p.182–183℃；1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.79(s,1H),7.41(d,J＝8.1Hz,2H),7.34(d,J＝8.0Hz,2H),7.10(t,J＝8.1Hz,6H),6.74(t,J＝9.1Hz,4H),6.68(d,J＝8.3Hz,2H),5.43(s,1H),5.24(s,1H),4.64(s,1H),4.63–4.54(m,2H),4.51(d,J＝16.3Hz,2H),4.33(d,J＝15.6Hz,1H),3.92(d,J＝10.6Hz,1H),3.84(s,2H),3.79(d,J＝8.3Hz,1H),3.74–3.62(m,2H),3.40(s,1H),2.41(s,3H),2.31–2.24(m,1H),2.23–2.16(m,2H),2.11–2.03(m,1H),2.01–1.90(m,1H),1.71–1.63(m,2H),1.60–1.51(m,2H),1.37(s,2H),1.28(s,6H),1.06–0.96(m,12H).13C NMR(100MHz,MeOD)δ174.66,173.01,170.99,158.66,157.39,157.21,151.49,147.57,140.72,138.80,136.94,132.05,130.87,130.45,130.06,128.99,128.28,127.62,123.94,123.30,115.49,115.26,114.60,84.44,82.73,69.74,67.86,61.12,59.48,57.64,56.74,46.63,42.39,37.55,35.34,35.24,28.96,25.81,25.70,25.62,14.70,13.80.HRMS(ESI)calcd for C57H69N5O10S2[M+H]+,1048.4559；found 1048.4531.
实施例6:
(2S,2R)-1-((2S)-2-(10-(4-((N-乙基-5,6-双(4-羟苯基)-7-氧杂双环[2.2.1]-5-庚烯)-2-磺酰胺基)苯氧基)癸酰胺)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-羧酰胺(26f)
Figure GDA0002612956640000192
在氩气的保护下，将双羟苯基呋喃22(35mg,0.14mmol)和亲二烯体25f(113mg,0.14mmol)放入圆底烧瓶中，然后加入无水THF(2mL)用作助溶剂。将反应在90℃加热下搅拌8小时，TLC检测反应完全后，加入水以淬灭反应，并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，随后进行硅胶柱色谱纯化得到82mg黄色固体产物,55％产率；m.p.183–184℃；1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.82(s,1H),7.43(d,J＝7.8Hz,2H),7.36(d,J＝7.7Hz,2H),7.11(t,J＝7.4Hz,6H),6.75(dd,J＝13.0,8.5Hz,4H),6.68(d,J＝8.0Hz,2H),5.43(s,1H),5.26(s,1H),4.63(s,1H),4.59(t,J＝8.2Hz,1H),4.49(d,J＝6.4Hz,2H),4.33(d,J＝15.5Hz,1H),3.93(s,1H),3.87(dd,J＝13.1,6.7Hz,2H),3.79(d,J＝8.5Hz,1H),3.74–3.66(m,1H),3.47(q,J＝6.9Hz,2H),3.39(dd,J＝6.8,5.0Hz,1H),2.43(s,3H),2.32–2.24(m,1H),2.23–2.16(m,2H),2.12–2.02(m,1H),2.00–1.92(m,1H),1.72–1.66(m,2H),1.61–53(m,2H),1.43–1.37(m,2H),1.28(s,8H),1.17(t,J＝6.9Hz,3H),1.02(s,9H).13CNMR(100MHz,MeOD)δ174.67,173.03,170.97,158.69,157.42,157.23,151.48,147.58,140.72,138.82,136.93,132.05,130.86,130.44,130.07,128.98,128.24,127.60,123.92,123.29,115.44,115.20,114.55,84.44,82.72,69.73,67.84,65.54,61.07,59.46,57.61,56.71,46.60,42.35,37.54,35.32,35.22,29.16,29.03,28.98,28.92,25.76,25.63,14.61,14.14,13.73.HRMS(ESI)calcd for C58H71N5O10S2[M+H]+,1062.4715；found1062.4683.
实施例7:
(2S,2R)-1-((2S)-2-(5-(4-((N-乙基-5,6-双(4-羟苯基)-7-氧杂双环[2.2.1]-5-庚烯)-2-磺酰胺基)苯氧基)戊酰胺)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)吡咯烷-2-羧酰胺(26g)
Figure GDA0002612956640000201
在氩气的保护下，将双羟苯基呋喃22(35mg,0.14mmol)和亲二烯体25g(105mg,0.14mmol)放入圆底烧瓶中，然后加入无水THF(2mL)用作助溶剂。将反应在90℃加热下搅拌8小时，TLC检测反应完全后，加入水以淬灭反应，并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，随后进行硅胶柱色谱纯化得到101mg黄色固体产物,72％产率；m.p.174–177℃；1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.86(s,1H),7.42(s,4H),7.14(dd,J＝8.2,6.4Hz,6H),6.81(d,J＝7.9Hz,2H),6.77(d,J＝7.7Hz,2H),6.71(d,J＝8.6Hz,2H),5.44(s,1H),5.29(d,J＝4.1Hz,1H),5.01(q,J＝6.9Hz,1H),4.63(d,J＝9.0Hz,1H),4.59(d,J＝8.1Hz,2H),4.45(s,1H),3.95(s,2H),3.77(d,J＝3.0Hz,1H),3.75–3.70(m,2H),3.45–3.39(m,1H),2.47(s,3H),2.36(d,J＝8.3Hz,2H),2.25–2.20(m,2H),2.04–1.97(m,2H),1.79(s,4H),1.50(d,J＝6.9Hz,3H),1.08–1.02(m,12H).13C NMR(100MHz,MeOD)δ175.68,173.17,172.29,159.95,158.76,158.55,152.83,148.99,145.56,142.12,138.30,133.32,132.28,131.77,131.44,130.45,130.36,129.53,127.61,125.29,124.65,116.78,116.52,115.94,85.80,84.06,70.95,68.79,62.35,60.56,59.07,57.99,50.10,47.93,38.72,36.42,36.16,31.47,29.72,27.08,23.56,22.42,15.85,15.00.HRMS(ESI)calcd for C54H63N5O10S2[M+Na]+,1028.3909；found 1028.3927.
实施例8:
(2S,2R)-1-((2S)-2-(6-(4-((N-乙基-5,6-双(4-羟苯基)-7-氧杂双环[2.2.1]-5-庚烯)-2-磺酰胺基)苯氧基)己酰胺)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)吡咯烷-2-羧酰胺(26h)
Figure GDA0002612956640000211
在氩气的保护下，将双羟苯基呋喃22(35mg,0.14mmol)和亲二烯体25h(107mg,0.14mmol)放入圆底烧瓶中，然后加入无水THF(2mL)用作助溶剂。将反应在90℃加热下搅拌8小时，TLC检测反应完全后，加入水以淬灭反应，并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，随后进行硅胶柱色谱纯化得到87mg黄色固体产物,61％产率；m.p.182–184℃；1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.86(s,1H),7.42(s,4H),7.14(dd,J＝8.3,6.2Hz,6H),6.78(dd,J＝14.1,8.7Hz,4H),6.71(d,J＝8.6Hz,2H),5.44(s,1H),5.29(d,J＝4.0Hz,1H),5.01(q,J＝6.9Hz,1H),4.64(s,2H),4.59(t,J＝8.3Hz,1H),4.44(s,1H),3.93(t,J＝6.0Hz,2H),3.77(d,J＝5.2Hz,1H),3.76–3.70(m,2H),3.42(dd,J＝8.0,4.4Hz,1H),2.47(s,3H),2.32(dd,J＝16.8,7.4Hz,2H),2.26–2.19(m,2H),2.05–2.01(m,1H),2.00–1.93(m,1H),1.81–1.74(m,2H),1.67(dd,J＝14.6,7.0Hz,2H),1.55(dd,J＝8.1,5.6Hz,2H),1.50(d,J＝7.0Hz,3H),1.04(d,J＝8.3Hz,12H).13C NMR(100MHz,MeOD)δ175.89,173.18,172.30,160.04,158.77,158.56,152.83,149.01,145.57,142.14,138.31,133.33,132.24,131.77,131.45,130.46,130.35,129.55,127.61,125.29,124.66,116.78,116.52,115.92,85.81,84.07,70.95,68.98,62.35,60.56,59.03,58.00,50.11,47.94,38.72,36.53,36.45,31.46,29.93,27.08,26.74,26.68,22.42,15.84,15.00.HRMS(ESI)calcd forC55H65N5O10S2[M+Na]+,1042.4065；found 1042.4078.
实施例9:
(2S,2R)-1-((2S)-2-(7-(4-((N-乙基-5,6-双(4-羟苯基)-7-氧杂双环[2.2.1]-5-庚烯)-2-磺酰胺基)苯氧基)庚酰胺)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)吡咯烷-2-羧酰胺(26i)
Figure GDA0002612956640000221
在氩气的保护下，将双羟苯基呋喃22(35mg,0.14mmol)和亲二烯体25i(109mg,0.14mmol)放入圆底烧瓶中，然后加入无水THF(2mL)用作助溶剂。将反应在90℃加热下搅拌8小时，TLC检测反应完全后，加入水以淬灭反应，并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，随后进行硅胶柱色谱纯化得到94mg黄色固体产物,65％产率；m.p.181–183℃；1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.84(s,1H),7.41(s,4H),7.13(t,J＝7.5Hz,6H),6.77(dd,J＝11.2,8.8Hz,4H),6.70(d,J＝8.3Hz,2H),5.45(s,1H),5.28(d,J＝3.4Hz,1H),5.02(d,J＝3.2Hz,1H),4.64(d,J＝5.6Hz,2H),4.60(d,J＝8.0Hz,1H),4.44(s,1H),3.90(s,2H),3.76(s,1H),3.72(dd,J＝13.1,6.3Hz,2H),3.41(d,J＝4.9Hz,1H),2.46(s,3H),2.31(dd,J＝16.5,9.0Hz,2H),2.23(dd,J＝13.7,5.7Hz,2H),1.98–1.94(m,2H),1.72(d,J＝6.5Hz,2H),1.66–1.59(m,2H),1.49(d,J＝6.9Hz,3H),1.46(s,2H),1.38(d,J＝7.0Hz,2H),1.03(d,J＝7.9Hz,12H).13C NMR(100MHz,MeOD)δ175.91,173.09,172.27,159.97,158.69,158.50,152.79,148.93,145.48,142.07,138.26,133.28,132.18,131.73,131.38,130.41,130.30,129.54,127.58,125.24,124.61,116.76,116.52,115.89,85.75,84.02,70.92,69.02,62.36,60.53,58.95,57.99,50.06,47.91,38.68,36.51,36.43,31.46,29.88,27.08,26.84,26.74,22.43,20.90,15.88,15.03.HRMS(ESI)calcd for C56H67N5O10S2[M+Na]+,1056.4222；found 1056.4234.
实施例10:
N-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚-4-基)-6-(4-((((1S)-N-乙基-5,6-双(4-羟苯基)-7-氧杂双环[2.2.1]-5-庚烯)-2-磺酰胺基)苯氧基)己酰胺(26j)
Figure GDA0002612956640000231
在氩气的保护下，将双羟苯基呋喃22(35mg,0.14mmol)和亲二烯体25j(83mg,0.14mmol)放入圆底烧瓶中，然后加入无水THF(2mL)用作助溶剂。将反应在90℃加热下搅拌8小时，TLC检测反应完全后，加入水以淬灭反应，并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，随后进行硅胶柱色谱纯化得到79mg白色固体产物,67％产率；m.p.153-156℃；1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.64(d,J＝8.4Hz,1H),8.00(s,1H),7.75(t,J＝7.9Hz,1H),7.56(d,J＝7.3Hz,1H),7.14(dd,J＝8.7,3.1Hz,6H),6.80(d,J＝8.7Hz,2H),6.75(d,J＝8.6Hz,2H),6.70(d,J＝8.6Hz,2H),5.43(s,1H),5.30(d,J＝4.1Hz,1H),5.15–5.08(m,1H),3.97(t,J＝6.2Hz,2H),3.75(dt,J＝10.7,6.7Hz,2H),3.42(dd,J＝8.3,4.4Hz,1H),2.89–2.65(m,4H),2.54(t,J＝7.4Hz,2H),2.24(dd,J＝11.4,5.5Hz,1H),2.02(dd,J＝12.0,8.6Hz,1H),1.80(dd,J＝14.1,6.6Hz,2H),1.63–1.53(m,2H),1.31(d,J＝3.1Hz,2H),1.05(t,J＝7.0Hz,3H).13C NMR(100MHz,MeOD)δ174.53,171.30,169.93,168.26,164.87,160.05,158.79,158.59,142.17,138.33,138.23,137.12,132.98,132.31,131.80,130.36,129.55,126.73,125.33,124.68,119.41,118.05,116.74,116.48,115.93,85.82,84.10,68.98,62.37,50.56,38.22,36.96,32.15,31.47,29.90,26.61,26.06,23.60,14.99.HRMS(ESI)calcd for C45H44N4O11S[M+Na]+,871.2619；found 871.2636.
实施例11:
(2S,2R)-1-((2S)-2-(6-(4-((5,6-双(4-羟苯基)-N-(2,2,2-三氟乙基)-7-氧杂双环[2.2.1]-5-庚烯)-2-磺酰胺基)苯氧基)己氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-羧酰胺(26k)
Figure GDA0002612956640000241
在氩气保护下，称取E3泛素连接酶配体化合物10a(43mg,0.1mmol)，连接羧酸侧链的ER配体化合物18(65mg,0.1mmol),2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(42mg,0.11mmol)，N,N-二异丙基乙胺(78mg,0.6mmol),加入4mL无水N,N-二甲基甲酰胺。室温下反应4小时，TLC检测反应完全后，加水淬灭，乙酸乙酯萃取。有机相经过水洗后，用无水硫酸钠干燥，过滤后，浓缩旋干，经硅胶柱层析分离纯化得到66mg黄色固体产物,62％产率；m.p.174-177℃；1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.84(s,1H),7.45(d,J＝8.1Hz,2H),7.38(d,J＝8.2Hz,2H),7.19(d,J＝8.8Hz,2H),7.12(dd,J＝12.0,8.6Hz,4H),6.76(t,J＝7.9Hz,4H),6.69(d,J＝8.0Hz,2H),5.46(s,1H),5.28(d,J＝3.7Hz,1H),4.65(s,1H),4.59(dd,J＝17.8,9.3Hz,2H),4.51(s,1H),4.41(s,1H),4.39(d,J＝3.9Hz,1H),3.92(dd,J＝14.9,8.5Hz,4H),3.83–3.78(m,1H),3.44(dd,J＝8.2,4.5Hz,1H),2.45(s,3H),2.32(dd,J＝13.2,6.0Hz,2H),2.22(d,J＝8.1Hz,2H),2.14–2.06(m,1H),2.02–1.98(m,1H),1.80–1.72(m,2H),1.69–1.64(m,2H),1.53–1.43(m,2H),1.04(d,J＝2.2Hz,9H).13C NMR(100MHz,MeOD)δ175.87,174.34,172.32,160.38,158.78,158.52,152.80,148.87,142.32,140.11,138.01,133.29,132.44,131.49,131.40,130.54,130.29,129.42,128.92,126.87,125.12,124.46,116.80,116.50,116.07,85.71,83.98,71.04,68.99,62.46,60.78,58.99,57.98,53.29,43.67,38.83,36.52,36.48,31.52,29.83,27.04,26.66,26.61,15.85.HRMS(ESI)calcd for C54H60F3N5O10S2[M+Na]+,1082.3626；found1082.3640.
实施例12:
(2S,2R)-1-((2S)-2-(6-(4-((5,6-双(4-羟苯基)-N-(2,2,2-三氟乙基)-7-氧杂双环[2.2.1]-5-庚烯)-2-磺酰胺基)苯氧基)己氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-((S)-1-4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)吡咯烷-2-羧酰胺(26l)
Figure GDA0002612956640000251
在氩气保护下，称取E3泛素连接酶配体化合物10b(44mg,0.1mmol)，连接羧酸侧链的ER配体化合物18(65mg,0.1mmol),2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(42mg,0.11mmol)，N,N-二异丙基乙胺(78mg,0.6mmol),加入4mL无水N,N-二甲基甲酰胺。室温下反应4小时，TLC检测反应完全后，加水淬灭，乙酸乙酯萃取。有机相经过水洗后，用无水硫酸钠干燥，过滤后，浓缩旋干，经硅胶柱层析分离纯化得到71mg黄色固体产物,70％产率；m.p.178-180℃；1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.85(s,1H),7.42(s,4H),7.19(d,J＝8.8Hz,2H),7.13(dd,J＝11.9,8.6Hz,4H),6.77(dd,J＝8.4,6.2Hz,4H),6.70(d,J＝8.6Hz,2H),5.47(s,1H),5.29(d,J＝3.9Hz,1H),5.01(dd,J＝13.7,6.7Hz,1H),4.63(d,J＝8.0Hz,2H),4.58(s,1H),4.43(d,J＝8.8Hz,2H),4.39(d,J＝8.5Hz,1H),3.91(d,J＝6.9Hz,2H),3.76(d,J＝10.6Hz,1H),3.45(dd,J＝7.6,4.4Hz,1H),2.47(s,3H),2.37–2.31(m,2H),2.27–2.21(m,2H),2.03–1.98(m,1H),1.99–1.92(m,1H),1.77(dd,J＝13.6,6.9Hz,2H),1.66(s,2H),1.64–1.58(m,2H),1.50(d,J＝6.9Hz,3H),1.05(s,9H).13C NMR(100MHz,MeOD)δ175.88,173.15,172.30,160.41,158.82,158.56,152.82,148.97,145.53,142.35,138.06,133.31,132.49,131.51,131.43,130.55,130.44,129.44,127.59,126.89,125.15,124.49,116.81,116.51,116.09,85.73,84.00,70.93,68.99,62.51,60.55,59.02,57.98,53.30,50.10,38.70,36.52,36.43,31.54,29.86,27.07,26.69,26.64,22.41,15.84.HRMS(ESI)calcd for C55H62F3N5O10S2[M+Na]+,1096.3782；found 1096.3809.
实施例13:
2-氯-4-((6-((((S)-1-((2S，4R)-4-羟基-2-(((4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)氨基甲酰基)吡咯烷-1-基)-3,3-二甲基-1-氧丁烷-2-基)氨基)-6-氧己基)氧基)-5,6-双(4-羟基苯基)-7-氧杂双环[2.2.1]-5-庚烯-2-磺酸酯(26m)
Figure GDA0002612956640000261
在氩气保护下，称取E3泛素连接酶配体化合物10a(43mg,0.1mmol)，连接羧酸侧链的ER配体化合物21b(60mg,0.1mmol),2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(42mg,0.11mmol)，N,N-二异丙基乙胺(78mg,0.6mmol),加入4mL无水N,N-二甲基甲酰胺。室温下反应4小时，TLC检测反应完全后，加水淬灭，乙酸乙酯萃取。有机相经过水洗后，用无水硫酸钠干燥，过滤后，浓缩旋干，经硅胶柱层析分离纯化得到73mg黄色固体产物，72％产率；m.p.178-180℃；1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.83(s,1H),7.44(d,J＝7.9Hz,2H),7.37(d,J＝7.7Hz,2H),7.27(d,J＝9.0Hz,1H),7.15(d,J＝7.9Hz,4H),6.94(d,J＝2.3Hz,1H),6.79(dd,J＝9.1,2.4Hz,1H),6.73(dd,J＝7.9,5.3Hz,4H),5.65(s,1H),5.36(d,J＝3.3Hz,1H),4.64(s,1H),4.61–4.55(m,2H),4.51(s,1H),4.35(d,J＝15.5Hz,1H),3.91(dd,J＝16.6,10.1Hz,3H),3.84–3.75(m,2H),2.44(s,3H),2.37–2.15(m,5H),2.14–2.05(m,1H),1.77–1.70(m,2H),1.68–1.60(m,2H),1.53–1.39(m,2H),1.03(s,9H).13C NMR(100MHz,MeOD)δ175.81,174.32,172.32,159.38,158.73,158.69,152.77,148.91,142.60,140.10,139.72,137.89,133.35,131.40,130.29,130.15,129.75,128.93,128.69,125.62,124.99,124.34,117.32,116.75,116.59,115.14,85.76,84.07,71.05,69.58,62.90,60.78,58.99,58.02,49.85,49.64,43.70,38.84,36.51,31.71,29.76,27.08,26.62,15.91.HRMS(ESI)calcd for C52H57ClN4O11S2[M+Na]+,1035.3046；found 1035.3067.
实施例14:
2-氯-4-((6-((((S)-1-((2S，4R)-4-羟基-2-(((4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)氨基甲酰基)吡咯烷-1-基)-3,3-二甲基-1-氧丁烷-2-基)氨基)-6-氧己基)氧基)-5,6-双(4-羟基苯基)-7-氧杂双环[2.2.1]-5-庚烯-2-磺酸酯(26n)
Figure GDA0002612956640000271
在氩气保护下，称取E3泛素连接酶配体化合物10b(44mg,0.1mmol)，连接羧酸侧链的ER配体化合物21b(60mg,0.1mmol),2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(42mg,0.11mmol)，N,N-二异丙基乙胺(78mg,0.6mmol),加入4mL无水N,N-二甲基甲酰胺。室温下反应4小时，TLC检测反应完全后，加水淬灭，乙酸乙酯萃取。有机相经过水洗后，用无水硫酸钠干燥，过滤后，浓缩旋干，经硅胶柱层析分离纯化得到83mg黄色固体产物，81％产率；m.p.184-186℃；1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.86(s,1H),7.42(s,4H),7.30(d,J＝9.1Hz,1H),7.17(d,J＝8.6Hz,4H),6.98(d,J＝2.7Hz,1H),6.83(dd,J＝9.1,2.8Hz,1H),6.74(dd,J＝8.4,7.0Hz,4H),5.66(s,1H),5.39(d,J＝4.0Hz,1H),5.01(dd,J＝13.7,6.8Hz,1H),4.64(s,1H),4.58(dd,J＝20.0,11.5Hz,1H),4.44(s,1H),3.93(dd,J＝14.7,8.6Hz,3H),3.83–3.70(m,2H),2.47(s,3H),2.37–2.16(m,5H),2.05–1.91(m,1H),1.81–1.71(m,2H),1.67(d,J＝6.9Hz,2H),1.50(d,J＝7.0Hz,5H),1.05(s,9H).13C NMR(100MHz,MeOD)δ175.85,173.16,172.31,159.45,158.78,158.74,152.81,149.01,145.54,142.65,139.80,137.94,133.33,131.45,130.45,130.16,129.76,128.72,127.60,125.64,125.02,124.38,117.33,116.75,116.58,115.19,85.81,84.10,70.95,69.61,62.92,60.56,59.03,57.99,50.10,49.85,38.71,36.50,36.44,31.72,29.80,27.08,26.64,22.40,15.85.HRMS(ESI)calcd for C53H59ClN4O11S2[M+Na]+,1049.3202；found 1049.3233.
实施例15:
4-((6-((((S)-1-((2S，4R)-4-羟基-2-(((4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)氨基甲酰基)吡咯烷-1-基)-3,3-二甲基-1-氧丁烷-2-基)氨基)-6-氧己基)氧基)-5,6-双(4-羟基苯基)-7-氧杂双环[2.2.1]-5-庚烯-2-磺酸酯(26o)
Figure GDA0002612956640000281
在氩气保护下，称取E3泛素连接酶配体化合物10a(43mg,0.1mmol)，连接羧酸侧链的ER配体化合物21a(57mg,0.1mmol),2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(42mg,0.11mmol)，N,N-二异丙基乙胺(78mg,0.6mmol),加入4mL无水N,N-二甲基甲酰胺。室温下反应4小时，TLC检测反应完全后，加水淬灭，乙酸乙酯萃取。有机相经过水洗后，用无水硫酸钠干燥，过滤后，浓缩旋干，经硅胶柱层析分离纯化得到64mg黄色固体产物，65％产率；m.p.181-183℃；1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.86(s,1H),7.45(d,J＝8.2Hz,2H),7.38(d,J＝8.2Hz,2H),7.14(dd,J＝8.7,2.4Hz,4H),7.05(d,J＝9.0Hz,2H),6.81–6.74(m,4H),6.71(d,J＝8.4Hz,2H),5.58(s,1H),5.35(d,J＝4.0Hz,1H),4.65(t,J＝4.3Hz,1H),4.58(dd,J＝15.5,7.4Hz,1H),4.51(d,J＝6.0Hz,1H),4.35(d,J＝15.6Hz,1H),3.96–3.90(m,1H),3.88(d,J＝6.2Hz,2H),3.80(d,J＝8.8Hz,1H),3.65–3.57(m,1H),2.45(s,3H),2.41–2.22(m,4H),2.17–2.05(m,2H),1.80–1.70(m,2H),1.69–1.63(m,2H),1.48(dd,J＝14.0,7.1Hz,2H),1.04(s,9H).13C NMR(100MHz,MeOD)δ175.86,174.37,172.31,159.18,158.85,158.68,152.81,148.93,143.92,142.39,140.15,137.92,133.38,131.42,130.40,130.32,129.62,128.94,125.04,124.36,124.22,116.81,116.54,116.31,85.77,84.04,71.06,69.16,61.12,60.79,59.00,58.03,49.85,43.69,38.87,36.53,31.53,29.90,27.06,26.70,26.65,15.89.HRMS(ESI)calcd for C52H58N4O11S2[M+Na]+,1001.3436；found1001.3452.
实施例16:
4-((6-((((S)-1-((2S，4R)-4-羟基-2-(((4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)氨基甲酰基)吡咯烷-1-基)-3,3-二甲基-1-氧丁烷-2-基)氨基)-6-氧己基)氧基)-5,6-双(4-羟基苯基)-7-氧杂双环[2.2.1]-5-庚烯-2-磺酸酯(26p)
Figure GDA0002612956640000291
在氩气保护下，称取E3泛素连接酶配体化合物10b(44mg,0.1mmol)，连接羧酸侧链的ER配体化合物21a(57mg,0.1mmol),2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(42mg,0.11mmol)，N,N-二异丙基乙胺(78mg,0.6mmol),加入4mL无水N,N-二甲基甲酰胺。室温下反应4小时，TLC检测反应完全后，加水淬灭，乙酸乙酯萃取。有机相经过水洗后，用无水硫酸钠干燥，过滤后，浓缩旋干，经硅胶柱层析分离纯化得到75mg黄色固体产物，76％产率；m.p.172-174℃；1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.85(s,1H),7.41(d,J＝5.1Hz,4H),7.15(dd,J＝8.7,2.7Hz,4H),7.06(d,J＝9.1Hz,2H),6.78(dd,J＝10.7,9.0Hz,4H),6.72(d,J＝8.7Hz,2H),5.59(s,1H),5.36(d,J＝4.1Hz,1H),5.04–4.98(m,1H),4.62(dt,J＝16.7,7.0Hz,2H),4.44(s,1H),3.94–3.88(m,3H),3.79–3.72(m,1H),2.47(s,3H),2.44–2.26(m,4H),2.24–2.11(m,2H),1.75(dd,J＝14.1,6.7Hz,2H),1.66(dd,J＝14.3,7.1Hz,2H),1.59–1.54(m,2H),1.50(d,J＝6.9Hz,3H),1.05(s,9H).13C NMR(100MHz,MeOD)δ175.85,173.15,172.28,159.20,158.86,158.69,152.81,148.99,145.55,143.95,142.41,137.94,133.32,131.43,130.45,130.39,129.62,127.59,125.04,124.36,124.21,116.80,116.54,116.32,85.78,84.04,70.94,69.17,61.12,60.55,59.02,58.00,54.80,49.85,38.72,36.44,31.54,29.91,27.07,26.71,26.66,22.42,15.86.HRMS(ESI)calcd forC53H60N4O11S2[M+Na]+,1015.3592；found 1015.3619.
实施例17:
(2S,4R)-4-羟基-1-((2S)-2-(6-(4-(3-(4-羟基苯基)-6-(N-(4-甲氧基苯基)-N-(2,2,2-三氟乙基)氨磺酰基)-7-氧杂双环[2.2.1]庚-2-烯-2-基)苯基)己氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-羧酰胺(26q)
Figure GDA0002612956640000301
在氩气保护下，称取E3泛素连接酶配体化合物10a(43mg,0.1mmol)，连接羧酸侧链的ER配体化合物24(66mg,0.1mmol),2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(42mg,0.11mmol)，N,N-二异丙基乙胺(78mg,0.6mmol),加入4mL无水N,N-二甲基甲酰胺。室温下反应4小时，TLC检测反应完全后，加水淬灭，乙酸乙酯萃取。有机相经过水洗后，用无水硫酸钠干燥，过滤后，浓缩旋干，经硅胶柱层析分离纯化得到68mg黄色固体产物，63％产率；m.p.176-179℃；1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.84(s,1H),7.45(d,J＝7.8Hz,2H),7.38(d,J＝7.5Hz,2H),7.26–7.06(m,6H),6.86–6.66(m,6H),5.49(s,1H),5.28(s,1H),4.70–4.49(m,4H),4.38(dd,J＝23.1,12.1Hz,3H),3.99–3.87(m,3H),3.81(d,J＝8.5Hz,1H),3.73(s,3H),3.45(d,J＝4.3Hz,1H),2.45(s,3H),2.38–2.27(m,2H),2.22(d,J＝7.7Hz,2H),2.09(t,J＝8.8Hz,1H),1.99(t,J＝9.6Hz,1H),1.71(dd,J＝20.5,13.2Hz,4H),1.48(d,J＝6.5Hz,2H),1.04(s,9H).13C NMR(100MHz,MeOD)δ175.78,174.33,172.29,160.93,160.22,158.68,152.76,148.92,142.06,140.14,138.66,133.34,132.65,131.50,130.58,130.29,129.55,128.92,126.22,125.59,125.00,124.33,116.84,115.90,115.56,85.69,84.04,71.04,68.72,62.53,60.77,58.95,58.02,55.95,53.30,49.85,43.67,38.85,36.52,31.52,29.98,27.07,26.74,26.66,15.90.
实施例18:
(2S,4R)-4-羟基-1-((2S)-2-(6-(4-(3-(4-羟基苯基)-6-(N-(4-甲氧基苯基)-N-(2,2,2-三氟乙基)氨磺酰基)-7-氧杂双环[2.2.1]庚-2-烯-2-基)苯基)己氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)吡咯烷-2-羧酰胺(26r)
Figure GDA0002612956640000302
在氩气保护下，称取E3泛素连接酶配体化合物10b(44mg,0.1mmol)，连接羧酸侧链的ER配体化合物24(66mg,0.1mmol),2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(42mg,0.11mmol)，N,N-二异丙基乙胺(78mg,0.6mmol),加入4mL无水N,N-二甲基甲酰胺。室温下反应4小时，TLC检测反应完全后，加水淬灭，乙酸乙酯萃取。有机相经过水洗后，用无水硫酸钠干燥，过滤后，浓缩旋干，经硅胶柱层析分离纯化得到74mg黄色固体产物，68％产率；m.p.175-178℃；1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.85(s,1H),7.42(s,4H),7.29–7.08(m,6H),6.84(d,J＝8.7Hz,1H),6.78(d,J＝8.7Hz,4H),6.70(d,J＝8.6Hz,1H),5.49(d,J＝3.0Hz,1H),5.29(d,J＝3.4Hz,1H),5.01(q,J＝6.8Hz,1H),4.65(d,J＝2.7Hz,1H),4.60(t,J＝8.0Hz,1H),4.42(dd,J＝16.9,8.0Hz,3H),3.99–3.87(m,3H),3.78(s,1H),3.74(s,3H),3.47–3.41(m,1H),2.47(s,3H),2.38–2.28(m,2H),2.25–2.16(m,2H),1.98(dt,J＝13.3,6.4Hz,2H),1.76(dd,J＝12.8,6.6Hz,2H),1.71–1.61(m,2H),1.53(dd,J＝27.8,5.9Hz,5H),1.06(s,9H).13C NMR(100MHz,MeOD)δ175.80,173.13,172.27,160.95,160.25,158.70,152.79,148.99,145.55,142.08,137.84,133.29,132.66,131.52,130.59,130.44,129.55,127.59,126.25,125.62,125.01,124.34,116.55,115.91,115.56,85.71,83.97,70.93,68.73,62.52,60.54,58.99,57.99,55.95,53.31,50.07,49.85,38.71,36.45,31.52,30.00,27.09,26.76,26.69,22.43,15.86.
实施例19：
化合物的相对亲和力测定
目标化合物与ERα的亲和力通过荧光偏振法进行测定，化合物的亲和力是内源性E2亲和力的相对值，设定E2与受体亲和力的值RBA＝100％，对ERα的Ki值为3.1nM。在384孔板中，加入20μL由0.8μM ERα蛋白、40nM香豆雌酚和2.4μg牛免疫球蛋白的磷酸钾缓冲液后，再加入20μL目标化合物溶液，化合物浓度梯度为：1×10-5M,5×10-5M,1×10-6M,5×10-6M,1×10-7M,5×10-7M,1×10-8M,5×10-8M,1×10-9M。室温下放置2小时后，在酶标仪上读板，选取365nm处波长为主波长，440nm处波长为参照波长，分析实验结果，并计算出Ki。根据公式受体亲和力RBA＝测试物Ki/雌二醇Ki×100计算出每个化合物的RBA值。
Figure GDA0002612956640000321
表1目标化合物26a-26i对ERα相对结合亲和力(RBA)
Figure GDA0002612956640000322
a相对结合力值(RBA)是通过竞争性荧光偏振实验测试,结果是通过公式IC50 estradiol/IC50 compound×100±the range(RBA,estradiol＝100％)计算的。
Figure GDA0002612956640000323
表2目标化合物26j-26r对ERα相对结合亲和力(RBA)
Figure GDA0002612956640000331
从实验结果看，大部分的化合物都表现出了一定的ERα结合力，虽然其RBA值都小于1，甚至比起母体化合物OBHSA类的结合力也要低一些，这可能是由于侧链及E3配体的的引入对其在蛋白的定位产生了影响。不过，由于PROTAC发挥作用采用的是事件驱动模式，其对靶蛋白的降解是一种催化过程，所以，这种模式并不需要很强的结合亲和力来占据靶蛋白活性位点。如表2所示，当ER配体选择亲和力更好的OBHS类化合物时，目标分子结合亲和力有所提高。
实施例20：
Wetern blot检测乳腺癌细胞ERα的表达
目标化合物对ERα在乳腺癌的下调活性主要通过Wetern blot检测，在六孔板铺板24小时后，用无酚红无血清的培养基对细胞进行饥饿处理24小时，设置空白孔，阳性对照组(氟维司群)和给药组，24小时后收细胞进行跑胶显影，结果如图1所示：
Figure GDA0002612956640000332
从实验结果看，大多数化合物对ERα有明显的下调活性。其中，比较化合物26a-26f的下调水平，连接链的长度与下调活性密切相关，其中，26b具有最好的下调活性，在1μM时与氟维司群降解活性相当。当化合物链长变短或者变长时，化合物的降解活性有一定的下降，其中，当化合物n＝9(26f，图1)时，其降解活性损失明显，大约只能引起不到40％的ERα降解。相比于链长这个影响活性较大的部分，E3配体部分两种VHL配体的变化对降解活性影响比较小。其中，含有对VHL亲和力较高的E3配体的PROTAC分子26g-26i在1μM时对ERα都有较好的降解能力，和侧链长度相等的化合物26a-26c相比，降解活性略有提高(n＝4,n＝6)。
Figure GDA0002612956640000341
接着，比较了化合物26j-26r对ERα降解水平，结果如图2所示，和化合物26b和26h相比，同等浓度下，化合物26j基本失去了对ERα的降解能力；化合物26j只有E3配体部分和26b与26h不同，26b与26h中E3配体部分是E3连接酶VHL的配体，而26j的这个部分则是E3连接酶CRBN的配体泊马度胺。这个发现说明E3连接酶配体的选择不是随意的，在以往的研究中，也有报道CRBN配体的利用获得底物蛋白高降解活性的成功范例。所以，这也进一步说明降解不同的底物蛋白可能需要特定的一种或几种E3连接酶，而对于ER这个靶点，E3连接酶VHL是一个很好的选择。这也为设计靶向ER受体的PROTAC的E3连接酶部分提供了参考。
另外，本发明还改变了ER配体部分的结构，结果发现，在ER配体部分，选择具有下调活性的雌激素受体下调剂OBHSA类型(26k，26l)的配体分子，还是具有更好亲和力的雌激素受体调节剂OBHS类(26m-26p)化合物，所构成的PROTAC都具有一定雌激素受体下调活性。虽然OBHSA类化合物的雌激素受体结合亲和力不如OBHS类化合物，但是，并未影响其ER的降解活性。但是同样是OBHS类化合物，亲和力较差的26o和26p相对于26m和26n的降解能力变差。这一方面说明了由于PROTAC对靶蛋白的降解是一种催化过程，并不需要对靶蛋白配体有非常高的结合亲和力以及足够高的药物剂量。另一方面也说明了OBHSA这类本身具有下调作用的化合物作为ER配体，会对整个PROTAC分子对ER蛋白的降解起到促进的作用。
最后，对于引入侧链连接E3配体的位置改变，结果发现，化合物26q和26r的降解活性有所下降。这也说明进行多元化，合理化的PROTAC分子设计非常必要，这样才能筛选出优异的苗头化合物进行后期的临床研究。

Claims (4)

1.一种以氧桥双环庚烯类化合物为雌激素受体配体的蛋白水解靶向嵌合体化合物，其特征在于，所述的化合物选自以下任意一种：
(2S, 2R)-1-((2S)-2-(6-(4-((N-乙基-5,6-双(4-羟苯基)-7-氧杂双环[2.2.1]-5-庚烯)-2-磺酰胺基)苯氧基)己酰胺)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-羧酰胺、
(2S, 2R)-1-((2S)-2-(7-(4-((N-乙基-5,6-双(4-羟苯基)-7-氧杂双环[2.2.1]-5-庚烯)-2-磺酰胺基)苯氧基)庚酰胺)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-羧酰胺、
(2S, 2R)-1-((2S)-2-(5-(4-((N-乙基-5,6-双(4-羟苯基)-7-氧杂双环[2.2.1]-5-庚烯)-2-磺酰胺基)苯氧基)戊酰胺)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)吡咯烷-2-羧酰胺、
(2S, 2R)-1-((2S)-2-(6-(4-((N-乙基-5,6-双(4-羟苯基)-7-氧杂双环[2.2.1]-5-庚烯)-2-磺酰胺基)苯氧基)己酰胺)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)吡咯烷-2-羧酰胺、
(2S, 2R)-1-((2S)-2-(7-(4-((N-乙基-5,6-双(4-羟苯基)-7-氧杂双环[2.2.1]-5-庚烯)-2-磺酰胺基)苯氧基)庚酰胺)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)吡咯烷-2-羧酰胺、
(2S, 2R)-1-((2S)-2-(6-(4-((5,6-双(4-羟苯基)-N-(2,2,2-三氟乙基)-7-氧杂双环[ 2.2.1] -5-庚烯）-2-磺酰胺基)苯氧基)己氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷- 2-羧酰胺、
(2S, 2R)-1-((2S)-2-(6-(4-((5,6-双(4-羟苯基)-N-(2,2,2-三氟乙基)-7-氧杂双环[ 2.2.1] -5-庚烯）-2-磺酰胺基)苯氧基)己氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-((S)-1-4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)吡咯烷- 2-羧酰胺、
2-氯-4-((6-((((S)-1-((2S，4R)-4-羟基-2-(((4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基）氨基甲酰基）吡咯烷-1-基)-3,3-二甲基-1-氧丁烷-2-基)氨基)-6-氧己基)氧基)-5,6-双(4-羟基苯基)-7-氧杂双环[2.2.1]-5-庚烯-2-磺酸酯、
2-氯-4-((6-((((S)-1-((2S，4R)-4-羟基-2-(((4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基) 氨基甲酰基）吡咯烷-1-基)-3,3-二甲基-1-氧丁烷-2-基)氨基)-6-氧己基)氧基)-5,6-双(4-羟基苯基)-7-氧杂双环[2.2.1]-5-庚烯-2-磺酸酯。
2.权利要求1所述的以氧桥双环庚烯类化合物为雌激素受体配体的蛋白水解靶向嵌合体化合物在制备抗乳腺癌药物中的应用。
3.一种药物组合物，其特征在于，包含权利要求1所述的化合物、一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。
4.权利要求3所述的药物组合物在制备抗乳腺癌药物中的应用。
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