CN107540608A - 4‑取代萘酰亚胺类化合物及其应用 - Google Patents
4‑取代萘酰亚胺类化合物及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一类4‑取代萘酰亚胺类化合物及其应用，所述的化合物具有通式I的结构。化合物能在体外和细胞内竞争性结合和拮抗Bcl‑2和Mcl‑1蛋白，从而诱导细胞凋亡，是一类活性很高的凋亡诱导剂和抗肿瘤化合物。此外，以其为基础设计的衍生物可以作为双功能分子，在体外和细胞内识别、分离、富集和荧光检测Bcl‑2家族蛋白；或者够作为PROTAC双功能复合体在细胞内选择性降解Bcl‑2和Mcl‑1蛋白，从而在活细胞中调控Bcl‑2家族蛋白的水平。
Description
技术领域
本发明涉及一类4-取代萘酰亚胺类化合物，特别涉及4-硫吗啉基-1,8-萘酰亚胺类及其衍生物。具体涉及这些化合物在体外、体内的竞争性结合和拮抗Bcl-2和Mcl-1蛋白，从而诱导细胞凋亡作用和作为抗癌化合物的应用；其中一些衍生物作为基于活性的分子探针在体外和细胞内识别、分离、富集和荧光检测Bcl-2家族蛋白的应用；以及其中一些化合物作为PROTAC(Proteolysis Targeting Chimera)双功能复合体在细胞内选择性降解Bcl-2和Mcl-1蛋白的应用。
背景技术
Bcl-2家族蛋白(B-cell lymphoma 2family of proteins)是细胞凋亡线粒体内源通路的顶点和核心因子，是调控细胞凋亡的一类关键性家族蛋白。其家族成员包括三个亚族：具有抗凋亡功能的Bcl-2家族蛋白(根据结构差异程度可以进一步分为Bcl-2-like蛋白和Mcl-1-like蛋白)；具有促凋亡功能的Bax,Bak；仅含有BH3区域的BH3-only蛋白，如Bad,Bim等。这三类蛋白通过其共有的BH3结构域相互作用,Bad,Bim等BH3-only蛋白通过竞争结合具有抗凋亡功能的蛋白，释放凋亡的“执行者”—Bax,Bak，启动凋亡通路。因此，通过小分子同时高亲和力的拮抗于Bcl-2-like蛋白和Mcl-1-like蛋白可以专一诱导肿瘤细胞凋亡，实现高选择性、安全、高效、低痛苦抗癌的目标。
但到目前为止，特异性拮抗Bcl-2蛋白的小分子主要分为三类。天然产物棉子酚(Gossypol)，ABT-263类化合物以及三联苯类化合物。它们都是BH3类似物，但是它们都存在严重的不足。Gossypol BH3类似程度不足，不是特异的BH3类似物，因此，具有一定的毒副作用。ABT-263虽然是BH3类似物，但是不能与Mcl-1作用，不能广谱抑制Bcl-2家族蛋白，实验过程中发现其对Mcl-1高表达的癌细胞表现出的效果不理想和严重的抗性。而三联苯类化合物在体外竞争性结合实验中仅仅表现出微摩尔级别的亲和力，而这样的亲和力远不能高效的诱导细胞凋亡。因此，开发一类高效的，选择性的，广谱的Bcl-2/Mcl-1抑制剂才能够克服上述分子的缺陷，实现对癌症的安全、高效、低痛苦的治疗。
另外，Bcl-2家族蛋白作为调控细胞凋亡和肿瘤发生发展的一类关键性家族蛋白，其家族新蛋白成员的发现、在不同细胞系中蛋白水平的检测和调控都对肿瘤的治疗和研究具有重要意义。目前，小分子探针在功能蛋白质组新成员的发现、分离、富集和功能检测以及对活细胞内特定蛋白的水平调控等领域的应用日趋广泛。相比于传统的免疫印迹、免疫共沉淀和基因敲除等方法，小分子探针具有成本低、实验周期短、实验重复性强和对活细胞干扰少等优点。其中，利用基于活性的分子探针(Activity-based Probes,ABPs)是一种有效的发现发现、分离、富集和检测新蛋白的小分子探针；而PROTAC(Proteolysis TargetingChimera)双功能复合物是调控目标蛋白在活细胞内水平的小分子探针。
基于活性的分子探针是指一类能够在复杂的蛋白质组中与靶标蛋白的活性中心特异性共价结合的化学小分子。其结构主要包括三部分：反应基团、连接基团和报告基团，连接基团一般为烷烃链或聚乙二醇链，将反应基团和报告基团连接到一起。反应基团一般为能够与特定蛋白特异性结合的化合物，如靶点蛋白的抑制剂分子等，化合物上的功能基团应该可以与蛋白活性中心的氨基酸残基发生共价反应，使之不可逆的结合在靶标蛋白上。报告基团主要有两种:一种是荧光基团，如荧光素、罗丹明、Cy3/Cy5等；当被探针标记的蛋白质组通过SDS-PAGE上分离后，被探针结合的蛋白会显示出特定的荧光信号。另一种是生物素基团(Biotin)，利用生物素和链霉亲和素的特异性结合，可以实现被探针标记的蛋白的分离和富集。分离得到的靶点蛋白既可以通过免疫印迹法检测,也可以通过生物大分子质谱进行分析,确定这些被探针标记的蛋白成分。我们可以通过改造优化反应基团部分设计合成出具有更好选择性的探针分子，高效作用于靶点蛋白，探测靶点蛋白的结构与功能。利用基于靶标蛋白活性的特异化学小分子探针来探测功能蛋白质组，小分子探针中的反应基团与靶标蛋白特异性的结合从而特异性地从复杂的蛋白质组内“钓取”相关蛋白，从而获取感兴趣的生物化学信息，这是一种有效的发现未知靶点的策略。
PROTAC(Proteolysis Targeting Chimera)指的是一种双功能复合物，包括两种配体，中间由连接体相连。例如，其中一种配体连有E3泛素连接酶，另一边配体与目的蛋白相连，促进两者在空间上的接近，以这种方式模拟目的蛋白与泛素化E3连接酶的特异性结合，促进目的蛋白的多泛素化，进而使目的蛋白被蛋白酶体降解，从而实现目标蛋白水平的调控，降低细胞中目标蛋白的水平。
因此，基于Bcl-2家族蛋白抑制剂，设计开发针对Bcl-2家族蛋白的基于活性的分子探针和PROTAC双功能复合物，可以应用于Bcl-2家族新蛋白成员的发现、分离、富集和功能检测以及对活细胞内Bcl-2家族蛋白(如Bcl-2和Mcl-1)的水平调控等领域，对实现肿瘤的治疗和研究具有重要意义。
发明内容
本发明旨在获得以下三类分子：更多能够良好靶向Bcl-2家族蛋白(包括Bcl-2和Mcl-1蛋白)的小分子抑制剂；应用于Bcl-2家族新蛋白成员的发现、分离、富集和功能检测的基于活性的分子探针；在活细胞内促进Bcl-2家族蛋白降解的PROTAC双功能复合物。
本发明一方面提供一种4-取代萘酰亚胺类化合物，具有通式I的结构：
其中：
R1选自吗琳基、硫吗啉基、哌啶基、4-甲基哌啶基、4,4-二甲基哌啶基、哌嗪基、4-C1-4烷基取代的哌嗪基、4-苄基哌嗪基、苯甲氨基或由下述基团任意取代的苯甲氨基：OH、OCH3、I、Br、Cl、NO2、NHCH3、N(CH3)2、CN、苯基或C1-4烷基；
R2选自H、R3、ZR3、哌啶基、哌啶酮基、哌啶二酮基、吡咯烷基、吡咯烷酮基、吡咯烷二酮基、C1-6烷基或取代C1-6烷基；
所述的R3选自取代或未取代的苯基、萘基、苯并呋喃基、噻吩基或吲哚基，所述的取代是由下述基团任意取代：C1-4烷基、C1-4烯基、C1-4炔基、苯基、OH、I、Br、Cl、NO2、NHCH3、N(CH3)2、CN、CF3、COOH、SO3H、COOR6、CONHR6、SO3R6、SO2NHR6或OR6；其中的R6选自C1-4烷基、C1-4烯基、C1-4炔基、苯基、苄基、CH2COOH或CH2CONH2；
所述的Z选自(CH2)m、(CH2)mCONH、(CH2)mNHCO、(CH2)mOCO、(CH2)mNHSO2、(CH2)mOSO2、(CH2)mCONH(CH2)nO、(CH2)mNHCO(CH2)nO、羰基或磺酰基，m、n各自独立地是1-3的整数；
所述的取代C1-6烷基是由下述基团任意取代的C1-6烷基：OH、OCH3、I、Br、Cl、NO2、NH2、NHCH3、N(CH3)2、CH(OCH3)2、CHO、CN、COOH、COOCH3、COOC2H5或R3。
另一方面，本发明提供一类基于上述化合物结构的功能性分子，即4-取代萘酰亚胺类化合物的衍生物，是上述4-取代萘酰亚胺类化合物被L-R4或L-R5取代后所获得的衍生物；其中，
所述的L选自L1～L6:
其中，p是1-3的整数，q是1-10的整数；
所述的R4选自式i～vi的基团：
所述的R5选自式vii或viii的基团：
式vii中，l为2-10的整数。
对上述4-取代萘酰亚胺类化合物，本发明通过多种手段检测了它们的BH3类似程度，以及他们对Mcl-1和Bcl-2的抑制能力。结果表明，本发明的上述具有通式I的化合物可以有效的抑制Mcl-1和Bcl-2蛋白。本发明通过细胞实验检测了它们对多种肿瘤细胞系的抑制作用。结果表明，本发明所述的4-取代萘酰亚胺类化合物可以高效的诱导多种肿瘤细胞系凋亡，而对正常细胞没有杀伤作用。基于此，本发明进一步提供所述的4-取代萘酰亚胺类化合物在制备Bcl-2家族蛋白抑制剂中的应用，尤其是在制备Bcl-2家族蛋白抑制剂类抗癌药物中的应用。所述的Bcl-2家族蛋白抑制剂或相应的抗肿瘤药物可以是化合物的单质剂型也可以是有效量的通式I的4-取代萘酰亚胺类化合物与适量的药用辅剂混合形成的组合制剂。
对本发明中所述及的4-取代萘酰亚胺类化合物的R4取代衍生物，本发明通过凝胶荧光成像、活细胞荧光成像和生物素/链霉亲和素体系富集实验检测了它们在体外和活细胞内标记、分离、富集Bcl-2家族蛋白的能力。结果表明，该类衍生物可以有效的在体外和活细胞内标记、分离、富集Bcl-2和Mcl-1蛋白。对本发明中所述及的4-取代萘酰亚胺类化合物的R5取代衍生物，本发明通过免疫印迹实验检测了它们在细胞内调控Bcl-2家族蛋白水平的能力。结果表明，该类衍生物可以有效的在活细胞内促进Bcl-2和Mcl-1蛋白的降解，从而降低Bcl-2和Mcl-1蛋白的水平。
基于上述发现，本发明进一步提供所述的4-取代萘酰亚胺类化合物的衍生物在制备功能性试剂中的应用，所述的功能性试剂用于Bcl-2家族蛋白识别、标记及调控。更为具体地，其中所述的R4取代的4-取代萘酰亚胺类化合物的衍生物可作为基于活性的分子探针应用于Bcl-2家族新蛋白成员的发现、分离、富集和功能检测。其中所述的R5取代的4-取代萘酰亚胺类化合物的衍生物可以作为PROTAC(Proteolysis Targeting Chimera)双功能复合体在细胞内选择性降解Bcl-2和Mcl-1蛋白。
附图说明
图1是化合物7对诱导U937细胞凋亡的流式细胞仪分析结果，其中A、B、C分别为加入0μmol、5μmol、10μmol的化合物7时的细胞凋亡结果；
图2是化合物7依赖Bax/Bak的细胞毒性实验结果，其中A为加入非特异性阳性对照Gossypol的细胞毒性结果，B为加入化合物7的细胞毒性结果。
图3是化合物17和19在体外和MCF-7细胞中荧光标记、分离和富集Bcl-2和Mcl-1的实验结果，其中a、b分别为10μM化合物17在0μM、50μM竞争性抑制剂7存在下荧光标记Bcl-2和Mcl-1的凝胶荧光结果，c、d为a、b相同实验体系中各蛋白含量的考马斯亮蓝染色结果，e、f为化合物50μM 19在0μM、200μM竞争性抑制剂7存在下分离和富集Bcl-2和Mcl-1的银染结果。
图4是化合物20和21在MCF-7细胞内调控Bcl-2和Mcl-1水平的免疫印迹实验结果。
具体实施方式
本发明所提供的4-取代萘酰亚胺类化合物，具有通式I的结构：
其中，
所述的R1选自吗琳基、硫吗啉基、哌啶基、4-甲基哌啶基、4,4-二甲基哌啶基、哌嗪基、4-C1-4烷基取代的哌嗪基、4-苄基哌嗪基、苯甲氨基或由下述基团任意取代的苯甲氨基：OH、OCH3、I、Br、Cl、NO2、NHCH3、N(CH3)2、CN、苯基或C1-4烷基；优选吗琳基、硫吗啉基或苯甲氨基。
所述的R2选自H、R3、ZR3、哌啶基、哌啶酮基、哌啶二酮基、吡咯烷基、吡咯烷酮基、吡咯烷二酮基、C1-6烷基或取代C1-6烷基，其中的取代C1-6烷基是由下述基团任意取代的C1-6烷基：OH、OCH3、I、Br、Cl、NO2、NH2、NHCH3、N(CH3)2、CH(OCH3)2、CHO、CN、COOH、COOCH3、COOC2H5或R3。优选的技术方案中，所述的R2选自R3、ZR3，C1-6烷基以及由下述基团任意取代的C1-6烷基：CHO、COOH、COOCH3或COOC2H5；更加优选地，所述的R2选自R3、ZR3或CHO取代的C1-6烷基。
上述技术方案中所述及的R3选自取代或未取代的苯基、萘基、苯并呋喃基、噻吩基或吲哚基，即苯基或取代苯基、萘基或取代萘基、苯并呋喃基或取代苯并呋喃基、噻吩基或取代噻吩、吲哚基或取代吲哚基。其中所述及的取代是由下述基团任意取代：C1-4烷基、C1-4烯基、C1-4炔基、苯基、OH、I、Br、Cl、NO2、NHCH3、N(CH3)2、CN、CF3、COOH、SO3H、COOR6、CONHR6、SO3R6、SO2NHR6或OR6。优选的技术方案中，所述的R3选自取代或未取代的苯基、萘基、苯并呋喃基、噻吩基或吲哚基，所述的取代是1～3个取代基的任意取代。更加优选的技术方案中，所述的R3选自苯基、萘基、吲哚基或由下述基团任意取代的苯基：C1-4烷基、C1-3烯基、C1-3炔基、COOH、OH、I、Br、Cl或OR6。其中的R6选自C1-4烷基、C1-4烯基、C1-4炔基、苯基、苄基、CH2COOH或CH2CONH2。最为优选的技术方案中，所述的R3选自苯基、萘基、吲哚基、2-甲基苯基、3-甲基苯基、4-甲基苯基、4-乙基苯基、3-异丙基苯基、4-异丙基苯基、4-叔丁基苯基、2-羧基苯基、3-羧基苯基、4-羧基苯基、2-羟基苯基、3-羟基苯基、4-羟基苯基、3,4,5-三羟基苯基、2-碘苯基、4-碘苯基。
上述技术方案中所述及的Z选自(CH2)m、(CH2)mCONH、(CH2)mNHCO、(CH2)mOCO、(CH2)mNHSO2、(CH2)mOSO2、(CH2)mCONH(CH2)nO、(CH2)mNHCO(CH2)nO、羰基或磺酰基。其中m和n各自独立地是1-3的整数。
更为具体的实施方式中，本发明所述的4-取代萘酰亚胺类化合物选自如下化合物：
本发明进一步提供所述的4-取代萘酰亚胺类化合物的制备方法，包括如下步骤：
(1)4-溴-萘二甲酸酐与R1H在缚酸剂存在下按照摩尔比1:1.2-1.5反应，得化合物III，反应时间为6-12h，反应温度为80-150℃，反应溶剂为DMF，缚酸剂为三乙胺；优选在氮气保护下进行反应；
(2)化合物III与NH2、C1-6烷基胺或(OH、OCH3、I、Br、Cl、NO2、NH2、NHCH3、N(CH3)2、CH(OCH3)2、CN、COOCH3、COOC2H5、R3)取代的C1-6烷基胺在缚酸剂存在下按照投料摩尔比1:2-1:5反应，制得化合物I，其中的R2(相应分别)为H、C1-6烷基、或(OH、OCH3、I、Br、Cl、NO2、NH2、NHCH3、N(CH3)2、CH(OCH3)2、CN、COOCH3、COOC2H5、R3)取代的C1-6烷基；反应时间为4-10h，反应温度为60-80℃，反应溶剂为乙醇，缚酸剂为三乙胺；
(3)步骤(2)所制得的R2为CH(OCH3)2取代C1-6烷基或COOCH3取代C1-6烷基的通式I的化合物在碱性条件下水解，分别制得R2为CHO取代C1-6烷基或COOH取代C1-6烷基的式I的化合物；优选在氮气保护下进行反应；
(4)上述步骤所制得的R2为H、(CH2)mNH2、(CH2)mOH和(CH2)mCOOH的化合物I与R3COOH、R3COCl、R3SO2Cl和R3NH2通过酰化和磺酰化反应制得R2为ZR3的化合物I；
(R2为(CH2)mNH2、(CH2)mOH和(CH2)mCOOH的化合物I被包括在步骤(2)、(3)中制得的R2为NH2、OH、COOH取代的C1-6烷基的化合物I的范围内。(CH2)m包括于C1-6烷基链中)
(5)化合物III和R3NH2按照投料摩尔比1:2-1:5反应，得R2为R3的式I的化合物，反应时间为10-24h，反应温度为120-160℃，反应溶剂为乙酸：DMF＝1:5的混合溶剂。
在上述4-取代萘酰亚胺类化合物的基础上，本发明进一步提供一系列基于上述化合物的功能分子，即4-取代萘酰亚胺类化合物的衍生物。该一系列衍生物是在上述本发明的具有通式I结构的4-取代萘酰亚胺类化合物基础上，经由L-R4或L-R5取代后所获得的衍生物；
其中，所述的L是连接基团，连接于通式I的4-取代萘酰亚胺类化合物上，所述L选自L1～L6:
其中，p是1-3的整数，q是1-10的整数；
其中所述的R4选自式i～vi的基团：
所述的R5选自式vii或viii的基团：
式vii中，l为2-10的整数。
具体的实施方式之一，所述的衍生物具有式ix的结构：
另一具体的实施方式中，所述的衍生物具有式x的结构：
上述式ix或式x中，取代基的选择及优选均与本说明书中前文所描述的一致。
更为具体的优选实施方式，所述的4-取代萘酰亚胺类化合物的衍生物选自如下化合物：
进一步，本发明提供上述4-取代萘酰亚胺类化合物的衍生物的制备方法，该方法基于前文所描述的具有通式I结构的化合物的制备方法，包括如下步骤：
(1)将含有活泼氢的化合物I和L的甲酯衍生物进行酰胺化、磺胺化或成醚等反应，或将化合物III和L的甲酯衍生物在缚酸剂存在下按照投料摩尔比1:2-1:5反应，得化合物I-L-OCH3；
(2)化合物I-L-OCH3在碱性条件下水解，所得产物进一步与R4NH2或R5NH2按照投料摩尔比1:1-1:2进行反应酰胺化反应，得4-取代萘酰亚胺类化合物的衍生物；其中水解所用碱为NaOH，溶剂为THF：H2O＝3:1的混合溶剂；酰胺化反应添加活性酯为HATU，缚酸剂为DIEA。
本发明以上所述及的所有技术方案中，使用的术语“烷基”包括直链烷基和支链烷基。如提及单个烷基如“丙基”，则只特指直链烷基，如提及单个支链烷基如“异丙基”，则只特指支链烷基。又如“C1-4烷基”包括C1-3烷基、甲基、乙基、正丙基、异丙基和叔丁基。类似的规则也适用于本说明书中使用的其它基团。
下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用原料和试剂等均可从化学或生物试剂公司购买或从已公开的方法制备。
实施例1：N-乙基-4-苯甲氨基-1,8-萘二甲酰亚胺(化合物1)的制备
(1)中间体A1的合成
分别取1.39g(5mmol)4-溴-1,8-萘二甲酸酐，0.589g(5.5mmol)苄胺，0.556g三乙胺，加入15mL DMF，85℃反应6h，冷却至室温后倒入150mL水中，抽滤。所的固体用石油醚/乙酸乙酯重结晶得中间体A1(4-苯甲氨基-1,8-萘二甲酸酐)，为黄色固体，产率80％。
(2)化合物1的合成
分别取303mg中间体A1，225mg乙胺和506mg三乙胺，加入10mL乙醇，氮气保护下回流，点板跟踪反应(大约反应5h)，冷却，析出固体，过滤，固体用甲醇/水重结晶，得化合物1，产率53％。
化合物1的1H NMR测定结果以及质谱测定结果如下：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:8.50(t,J＝7.2Hz,1H),8.37(t,J＝7.2Hz,1H),8.29(d,J＝8.4Hz,1H),7.87(t,J＝7.2Hz,1H),7.55(d,J＝8.4Hz,1H),7.35(t,J＝7.6Hz,1H),7.31-7.29(m,5H),4.32(s,2H),3.20(q,J＝6.4Hz,2H),1.19(t,J＝6.4Hz,2H).TOF MS(EI+):C21H18N2O2,理论值：330.1,实测值：330.1.
实施例2：N-正丁基-4-硫吗啉基-1,8-萘二甲酰亚胺(化合物2)的制备
(1)中间体A2的合成
分别取1.39g(5mmol)4-溴-1,8-萘二甲酸酐，0.557g(5.5mmol)琉吗啉，0.556g(5.5mmol)三乙胺，加入15mL DMF，85℃反应6h，冷却至室温后倒入150mL水中，抽滤。所的固体用石油醚/乙酸乙酯重结晶得中间体A2(4-(4-溴苯巯基)-1,8-萘二甲酸酐)，为黄色固体，产率75％。
(2)化合物2的合成
分别取299mg(1mmol)中间体A2，365mg(5mmol)正丁胺和506mg(5mmol)三乙胺，加入10mL乙醇，氮气保护下回流，点板跟踪反应(大约反应5h)，冷却，析出固体，过滤，固体用甲醇/水重结晶，得化合物2，产率58％。
化合物2的1H NMR测定结果以及质谱测定结果如下：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:8.52(t,J＝7.6Hz,1H),8.37(t,J＝7.6Hz,1H),8.31(d,J＝8.4Hz,1H),7.87(t,J＝7.2Hz,1H),7.56(d,J＝8.4Hz,1H),3.72(t,J＝7.2Hz,2H),3.13(t,J＝6.4Hz,2H),2.67(t,J＝7.2Hz,2H),1.54(m,J＝6.4Hz,2H),1.29(m,J＝6.4Hz,2H),0.91(t,J＝6.4Hz,2H).TOF MS(EI+):C20H22N2O2S,理论值：354.1,实测值：354.1.
实施例3：3-(4-硫吗啉基-1,8-萘二甲酰亚胺基)-N-(4-甲基苯基)-丙酰胺(化合物3)
(1)中间体A2的合成
按照实施例2步骤(1)的方法制备得中间体A2。
(2)中间体B3的合成
分别取299mg(1mmol)中间体A2，698mg(5mmol)3-氨基丙酸甲酯506mg(5mmol)三乙胺，加入10mL乙醇，氮气保护下回流，点板跟踪反应(大约反应5h)，冷却，析出固体，过滤，固体用甲醇/水重结晶，得中间体B3，产率51％。
(3)中间体C3的合成
分别取192mg(0.5mmol)中间体B3，200mg(5.0mmol)NaOH，加入THF：H2O＝3:1的混合溶剂10mL，常温搅拌12h，反应液倒入100mL冷水中，用盐酸酸化至PH＝2，抽滤得中间体C3，产率95％。
(4)化合物3的合成
取74mg(0.2mmol)中间体C3溶于10mL DMF中，依次加入23.5mg(0.22mmol)对甲基苯胺，52mg(0.4mmol)DIPEA，常温搅拌5min后加入HATU 91mg(0.24mmol)，点板跟踪反应(大约反应2h)，水洗，二氯甲烷萃取，粗产物用二氯甲烷：甲醇＝15:1柱分离，得化合物3，产率70％.
化合物3的1H NMR测定结果以及质谱测定结果如下：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:9.82(s,1H),8.53(t,J＝7.2Hz,1H),8.37(t,J＝7.2Hz,1H),8.29(d,J x＝8.4Hz,1H),7.87(t,J＝7.2Hz,1H),7.72(d,J＝7.6Hz,2H),7.55(d,J＝8.4Hz,1H),7.51(d,J＝7.6Hz,2H),4.36(t,J＝6.8Hz,2H),3.72(t,J＝7.2Hz,2H),2.67(t,J＝7.2Hz,2H),2.34(t,J＝6.8Hz,2H),2.32(s,3H).TOF MS(EI+):C26H25N3O3S,理论值：459.2,实测值：459.3.
实施例4：N-(2-(4-硫吗啉基-1,8-萘二甲酰亚胺基)乙基)-3,4,5-三甲氧基苯甲酰胺(化合物4)的制备
(1)中间体A2的合成
按照实施例2步骤(1)的方法制备得中间体A2。
(2)中间体B4的合成
分别取299mg(1mmol)中间体A2，300mg(5mmol)乙二胺和506mg(5mmol)三乙胺，加入10mL乙醇，氮气保护下回流，点板跟踪反应(大约反应5h)，冷却，析出固体，过滤，固体用甲醇/水重结晶，得中间体B4，产率61％。
(3)化合物4的合成
取68mg(0.2mmol)中间体B4溶于10mL DMF中，依次加入46.6mg(0.22mmol)对3,4,5-三甲氧基苯甲酸，52mg(0.4mmol)DIPEA，常温搅拌5min后加入HATU 91mg(0.24mmol)，点板跟踪反应(大约反应2h)，水洗，二氯甲烷萃取，粗产物用二氯甲烷：甲醇＝15:1柱分离，得化合物4，产率81％。
化合物4的1H NMR测定结果以及质谱测定结果如下：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:8.82(s,1H),8.50(t,J＝7.2Hz,1H),8.37(t,J＝7.2Hz,1H),8.29(d,J x＝8.4Hz,1H),7.87(t,J＝7.2Hz,1H),7.51(d,J＝7.6Hz,2H),7.17(s,2H),3.72(t,J＝7.2Hz,2H),3.69(t,J＝6.8Hz,2H),3.36(t,J＝6.8Hz,2H),2.67(t,J＝7.2Hz,2H),2.78(s,9H).TOF MS(EI+):C28H29N3O6S,理论值：535.2,实测值：535.2.
实施例5：N-(2-(4-硫吗啉基-1,8-萘二甲酰亚胺基)乙基)-2-萘甲酰胺(化合物5)的制备
(1)中间体B4的合成
按照实施例4步骤(1)、(2)的方法制备得中间体B4。
(2)化合物7的合成
取68mg(0.2mmol)中间体B4溶于10mL DMF中，依次加入37.8mg(0.22mmol)对2-萘甲酸，52mg(0.4mmol)DIPEA，常温搅拌5min后加入HATU 91mg(0.24mmol)，点板跟踪反应(大约反应2h)，水洗，二氯甲烷萃取，粗产物用二氯甲烷：甲醇＝15:1柱分离，得化合物5，产率77％.
化合物5的1H NMR测定结果以及质谱测定结果如下：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:8.94(s,1H),8.50(t,J＝7.2Hz,1H),8.40(m,1H),8.37(t,J＝7.2Hz,1H),8.29(d,J x＝8.4Hz,1H),8.15-8.05(m,3H),7.87(t,J＝7.2Hz,1H),7.75(m,J＝7.2Hz,1H),7.66(m,J＝7.2Hz,1H),7.55(d,J＝8.4Hz,1H),3.72(t,J＝7.2Hz,2H),3.69(t,J＝6.8Hz,2H),3.36(t,J＝6.8Hz,2H),2.67(t,J＝7.2Hz,2H).TOF MS(EI+):C29H25BrN3O3S,理论值：495.2,实测值：495.2.
实施例6：N-(2-(4-硫吗啉基-1,8-萘二甲酰亚胺基)乙基)-2-吲哚甲酰胺(化合物6)的制备
(1)中间体B4的合成
按照实施例4步骤(1)、(2)的方法制备得中间体B4。
(2)化合物6的合成
取68mg(0.2mmol)中间体B4溶于10mL DMF中，依次加入35.4mg(0.22mmol)对2-萘甲酸，52mg(0.4mmol)DIPEA，常温搅拌5min后加入HATU 91mg(0.24mmol)，点板跟踪反应(大约反应2h)，水洗，二氯甲烷萃取，粗产物用二氯甲烷：甲醇＝15:1柱分离，得化合物6，产率62％.
化合物6的1H NMR测定结果以及质谱测定结果如下：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:11.55(s,1H),8.94(s,1H),8.50(t,J＝7.2Hz,1H),8.37(t,J＝7.2Hz,1H),8.29(d,J x＝8.4Hz,1H),7.87(t,J＝7.2Hz,1H),7.64(q,J＝7.6Hz,1H),7.55(d,J＝8.4Hz,1H),7.54(t,J＝7.6Hz,1H),7.02(t,J＝7.6Hz,2H),3.72(t,J＝7.2Hz,2H),3.68(t,J＝6.8Hz,2H),3.34(t,J＝6.8Hz,2H),2.67(t,J＝7.2Hz,2H).TOF MS(EI+):C27H24N4O3S,理论值：484.2,实测值：484.2.
实施例7：N-(2-(4-硫吗啉基-1,8-萘二甲酰亚胺基)乙基)-4-甲基苯甲酸甲酯(化合物7)的制备
(1)中间体A2的合成
按照实施例2步骤(1)的方法制备得中间体A2。
(2)中间体B7的合成
分别取299mg(1mmol)中间体A2，300mg(5mmol)2-羟基乙胺和506mg(5mmol)三乙胺，加入10mL乙醇，氮气保护下回流，点板跟踪反应(大约反应5h)，冷却，析出固体，过滤，固体用甲醇/水重结晶，得中间体B7为橘黄色固体，产率60％。
(3)化合物7的合成
分别取376mg(1.1mmol)中间体B7溶于10mL THF中，加入339mg(2.2mmol)4-甲基苯磺酰氯和223mg(2.2mmol)三乙胺，回流，点板跟踪反应(大约反应2h)。加水淬灭，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，真空旋干得到粗产物，用石油醚：乙酸乙酯＝1:1柱分离，得化合物7为黄色固体，产率84％.
化合物7的1H NMR测定结果以及质谱测定结果如下：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:8.94(s,1H),8.50(t,J＝7.2Hz,1H),8.37(t,J＝7.2Hz,1H),8.29(d,J x＝8.4Hz,1H),7.87(t,J＝7.2Hz,1H),7.64(q,J＝7.6Hz,1H),7.55(d,J＝8.4Hz,1H),7.54(t,J＝7.6Hz,1H),7.02(t,J＝7.6Hz,2H),4.50(t,J＝6.8Hz,2H),3.72(t,J＝7.2Hz,2H),3.37(t,J＝6.8Hz,2H),2.67(t,J＝7.2Hz,2H),2.0(s,J＝6.8Hz,3H).TOF MS(EI+):C26H24N2O4S,理论值：460.1,实测值：460.2.
实施例8：N-(2-(4-硫吗啉基-1,8-萘二甲酰亚胺基)乙基)-4-甲基苯磺酸甲酯(化合物8)的制备
(1)中间体B7的合成
按照实施例7步骤(1)、(2)的方法制备得中间体B7。
(2)化合物8的合成
分别取376mg(1.1mmol)中间体B7溶于10mL THF中，加入对甲苯磺酰氯419mg(2.2mmol)和223mg(2.2mmol)三乙胺，回流，点板跟踪反应(大约反应2h)。加水淬灭，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，真空旋干得到粗产物，用石油醚：乙酸乙酯＝1:1柱分离，得化合物8，产率84％.
化合物8的1H NMR测定结果以及质谱测定结果如下：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:8.45(s,1H),8.50(t,J＝7.2Hz,1H),8.37(t,J＝7.2Hz,1H),8.29(d,J x＝8.4Hz,1H),7.87(t,J＝7.2Hz,1H),7.64(q,J＝7.6Hz,1H),7.56(d,J＝8.4Hz,1H),7.54(t,J＝7.6Hz,1H),7.02(t,J＝7.6Hz,2H),3.84(t,J＝6.8Hz,2H),3.72(t,J＝7.2Hz,2H),3.40(t,J＝6.8Hz,2H),2.67(t,J＝7.2Hz,2H),1.98(s,J＝6.8Hz,3H).TOF MS(EI+):C25H24N2O5S2,理论值：469.1,实测值：469.1.
实施例9：N-(2-(4-硫吗啉基-1,8-萘二甲酰亚胺基)乙基)-4-甲基苯磺酰胺(化合物9)的制备
(1)中间体B4的合成
按照实施例4步骤(1)、(2)的方法制备得中间体B4。
(2)化合物9的合成
取68mg(0.2mmol)中间体B4溶于10mL DMF中，依次加入38mg(0.22mmol)对甲苯磺酸，52mg(0.4mmol)DIPEA，常温搅拌5min后加入HATU 91mg(0.24mmol)，点板跟踪反应(大约反应2h)，水洗，二氯甲烷萃取，粗产物用二氯甲烷：甲醇＝15:1柱分离，得化合物9为黄色固体，产率62％.
化合物9的1H NMR测定结果以及质谱测定结果如下：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:7.91(t,1H),8.44(t,J＝7.2Hz,1H),8.37(t,J＝7.2Hz,1H),8.13(d,J x＝8.4Hz,1H),7.87(t,J＝7.2Hz,1H),7.40(q,J＝7.6Hz,1H),7.51(d,J＝8.4Hz,1H),7.55(t,J＝7.6Hz,1H),7.02(t,J＝7.6Hz,2H),3.72(t,J＝7.2Hz,2H),3.61(t,J＝6.8Hz,2H),3.32(t,J＝6.8Hz,2H),2.67(t,J＝7.2Hz,2H),2.43(s,J＝6.8Hz,3H).TOF MS(EI+):C25H25N3O4S2,理论值：495.1,实测值：495.0.
实施例10：N-(4-羟基苯基)-4-硫吗啉基-1,8-萘二甲酰亚胺(化合物10)的制备
(1)中间体A2的合成
按照实施例2步骤(1)的方法制备得中间体A2。
(2)化合物10的合成
取59.8mg(0.2mmol)中间体A2溶于10mL DMF中，加入27mg(0.24mmol)4-氨基苯酚，并加入2mL AcOH，氮气保护100℃回流反应，点板跟踪反应(大约反应16h)，加100mL水淬灭，抽滤，得到固体。粗产物用石油醚：乙酸乙酯＝2:1柱分离，得化合物10，产率62％.
化合物10的1H NMR测定结果以及质谱测定结果如下：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:9.25(s,1H),8.34(t,J＝7.2Hz,1H),8.27(t,J＝7.2Hz,1H),7.98(d,J＝8.4Hz,1H),7.87(t,J＝7.2Hz,1H),7.61(q,J＝7.6Hz,1H),7.53(d,J＝8.4Hz,1H),7.51(t,J＝7.6Hz,1H),7.01(d,J＝7.6Hz,2H),3.72(t,J＝7.2Hz,2H),2.67(t,J＝7.2Hz,2H),.TOF MS(EI+):C22H18N2O3S,理论值：390.1,实测值：390.1.
实施例11：N-(4-苯氧基苯基)-4-硫吗啉基-1,8-萘二甲酰亚胺(化合物11)的制备
(1)中间体A2的合成
按照实施例2步骤(1)的方法制备得中间体A2。
(2)化合物11的合成
取59.8mg(0.2mmol)中间体A2溶于10mL DMF中，加入44.5mg(0.24mmol)4-氨基二苯醚，并加入2mL AcOH，氮气保护100℃回流反应，点板跟踪反应(大约反应16h)，加100mL水淬灭，抽滤，得到固体。粗产物用石油醚：乙酸乙酯＝2:1柱分离，得化合物11，产率62％.
化合物11的1H NMR测定结果以及质谱测定结果如下：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:8.46(t,J＝7.2Hz,1H),8.37(t,J＝7.2Hz,2H),7.89(t,J＝7.2Hz,1H),7.55(m,2H),7.42(t,J＝7.6Hz,2H),7.15(d,J＝7.6Hz,2H),7.15(t,J＝7.6Hz,2H),7.04(t,J＝6.8Hz,2H),6.99(t,J＝6.8Hz,2H),3.72(t,J＝7.2Hz),2.67(t,J＝7.2Hz).TOF MS(EI+):C28H22N2O3S,理论值：466.1,实测值：466.1.
实施例12：N-乙醛基-4-琉吗啉基-1,8-萘二甲酰亚胺(化合物12)的制备
(1)中间体A2的合成
按照实施例2步骤(1)的方法制备得中间体A2
(2)中间体B12的合成
分别取299mg(1mmol)中间体A2，556mg(5mmol)氨基乙醛缩二甲醇和506mg(5mmol)三乙胺，加入10mL乙醇，氮气保护下回流，点板跟踪反应(大约反应5h)，冷却，析出固体，过滤，固体用甲醇/水重结晶，得中间体B12，产率68％。
(3)化合物12的合成
取386mg(1mmol)中间体B12溶于5mL二氯甲烷，常温下加入5mL三氟乙酸，点板跟踪反应(大约反应0.5h)，减压悬蒸去溶剂，固体用甲醇/水重结晶，得化合物12，产率88％。
化合物12的1H NMR测定结果以及质谱测定结果如下：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:9.72(t,J＝8.0Hz,1H),8.52(t,J＝7.6Hz,1H),8.37(t,J＝7.6Hz,1H),8.31(d,J＝8.4Hz,1H),7.87(t,J＝7.2Hz,1H),7.56(d,J＝8.4Hz,1H),4.31(d,J＝8.0Hz,2H),3.72(t,J＝7.2Hz),2.67(t,J＝7.2Hz).TOF MS(EI+):C18H16N2O3S,理论值：340.0,实测值：340.1.
实施例13：3-N-(哌啶-2,6-二酮)--4-硫吗啉基-1,8-萘酰亚胺(化合物13)的制备
(1)中间体A2的合成
按照实施例2步骤(1)的方法制备得中间体A2。
(2)化合物13的合成
取299mg(0.88mmol)中间体A2溶于10mL THF中，加入150mg(0.87mmol)3-氨基哌啶-2,6-二酮盐酸盐，滴加1.20mL三乙胺，120℃回流，TLC跟踪反应(大约反应20h)。旋干溶剂，粗产物在乙酸酐中回流20min，温度降低到80℃时加入5mL无水乙醇，搅拌30min，冷却抽滤，用乙酸乙酯洗涤3次，得黄色固体。粗产品用二氯甲烷：甲醇＝40：1柱分离提纯，产率84％.
化合物17的1H NMR测定结果以及质谱测定结果如下：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:11.20(S,J＝7.6Hz,1H),8.52(t,J＝7.6Hz,1H),8.37(t,J＝7.6Hz,1H),8.31(d,J＝8.4Hz,1H),7.87(t,J＝7.2Hz,1H),7.56(d,J＝8.4Hz,1H),4.78(t,J＝6.4Hz,1H),3.72(t,J＝7.2Hz),2.67(t,J＝7.2Hz),2.26(m,J＝6.4Hz,2H),1.98(m,J＝6.4Hz,2H).TOF MS(EI+):C21H19N3O4S,理论值：409.1,实测值：409.1.
实施例14：N-(2-(4-硫吗啉基-1,8-萘二甲酰亚胺基)乙基)-3-二氮丙啶基辛酰胺-7-炔(化合物14)的制备
(1)中间体C3的合成
按照实施例3步骤(1)、(2)、(3)的方法制备得中间体C3。
(2)化合物14的合成
取74mg(0.2mmol)中间体C3溶于10mL DMF中，依次加入30.1mg(0.22mmol)原料D14，52mg(0.4mmol)DIPEA，常温搅拌5min后加入HATU 91mg(0.24mmol)，点板跟踪反应(大约反应2h)，水洗，二氯甲烷萃取，粗产物用二氯甲烷：甲醇＝15:1柱分离，得化合物14，产率55％.
化合物14的1H NMR测定结果以及质谱测定结果如下：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:8.52(t,J＝7.2Hz,1H),8.36(t,J＝7.2Hz,1H),8.29(d,J＝8.4Hz,1H),7.87(t,J＝7.2Hz,1H),7.68(t,J＝6.0Hz,1H),7.55(d,J＝8.4Hz,1H),4.26(t,J＝6.8Hz,2H),3.72(t,J＝7.2Hz,2H),3.42(t,J＝6.0Hz,2H),2.78(t,J＝6.4Hz,1H),2.70(t,J＝6.8Hz,2H),2.66(t,J＝7.2Hz,2H),2.46(t,J＝6.4Hz,2H),1.51(t,J＝6.0Hz,2H),1.39(t,J＝6.4Hz,2H).TOFMS(EI+):C26H27N5O3S,理论值：489.2,实测值：489.2.
实施例15：N-(2-(4-硫吗啉基-1,8-萘二甲酰亚胺基)乙基)-3-二氮丙啶基辛酰胺-7-炔(化合物15)的制备
(1)中间体B4的合成
按照实施例4步骤(1)、(2)的方法制备得中间体B4。
(2)化合物15的合成
取68mg(0.2mmol)中间体B4溶于10mL DMF中，依次加入36.6mg(0.22mmol)原料C15，52mg(0.4mmol)DIPEA，常温搅拌5min后加入HATU 91mg(0.24mmol)，点板跟踪反应(大约反应2h)，水洗，二氯甲烷萃取，粗产物用二氯甲烷：甲醇＝15:1柱分离，得化合物15，产率61％.
化合物15的1H NMR测定结果以及质谱测定结果如下：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:8.52(t,J＝7.2Hz,1H),8.36(t,J＝7.2Hz,1H),8.29(d,J＝8.4Hz,1H),8.01(t,J＝6.0Hz,1H),7.87(t,J＝7.2Hz,1H),7.55(d,J＝8.4Hz,1H),3.70(t,J＝6.8Hz,2H),3.67(t,J＝7.2Hz,2H),3.32(t,J＝6.8Hz,2H),2.64(t,J＝7.2Hz,2H),2.34(t,J＝6.0Hz,2H),1.60(t,J＝6.0Hz,2H),1.41(t,J＝6.4Hz,2H).TOF MS(EI+):C26H27N5O3S,理论值：489.2,实测值：489.2.
实施例16：N-(2-(4-硫吗啉基-1,8-萘二甲酰亚胺基)乙基)-4-(3-三氟甲基二氮丙啶基)苯甲酰胺(化合物16)的制备
(1)中间体B4的合成
按照实施例4步骤(1)、(2)的方法制备得中间体B4。
(2)化合物16的合成
取68mg(0.2mmol)中间体B4溶于10mL DMF中，依次加入50.6mg(0.22mmol)原料C16，52mg(0.4mmol)DIPEA，常温搅拌5min后加入HATU 91mg(0.24mmol)，点板跟踪反应(大约反应2h)，水洗，二氯甲烷萃取，粗产物用二氯甲烷：甲醇＝15:1柱分离，得化合物16，产率76％.
化合物16的1H NMR测定结果以及质谱测定结果如下：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:8.82(s,1H),8.53(t,J＝7.2Hz,1H),8.37(t,J＝7.2Hz,1H),8.29(d,J x＝8.4Hz,1H),7.87(t,J＝7.2Hz,1H),7.78(d,J＝7.2Hz,2H),7.55(d,J＝8.4Hz,1H),7.38(d,J＝7.2Hz,2H),4.36(t,J＝6.8Hz,2H),3.73(t,J＝7.2Hz,2H),2.67(t,J＝7.2Hz,2H),2.34(t,J＝6.8Hz,2H),2.32(s,3H).TOF MS(EI+):C27H22F3N5O3S,理论值：553.1,实测值：553.1.
实施例17：N-(3-(4-苯甲酰基苯基)-N-(2-(4-硫吗啉基-1,8-萘二甲酰亚胺基)乙基)-2-丙酰胺基)-戊酰胺-4-炔(化合物17)的制备
(1)中间体B4的合成
按照实施例4步骤(1)、(2)的方法制备得中间体B4。
(2)化合物17的合成
取68mg(0.2mmol)中间体B4溶于10mL DMF中，依次加入76.8mg(0.22mmol)原料C17，52mg(0.4mmol)DIPEA，常温搅拌5min后加入HATU 91mg(0.24mmol)，点板跟踪反应(大约反应2h)，水洗，二氯甲烷萃取，粗产物用二氯甲烷：甲醇＝15:1柱分离，得化合物17，产率63％.
化合物17的1H NMR测定结果以及质谱测定结果如下：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:8.53(t,J＝7.2Hz,1H),8.32(s,1H),8.37(t,J＝7.2Hz,1H),8.29(d,J＝8.4Hz,1H),8.12(s,1H),7.87(t,J＝7.2Hz,1H),7.81(d,J＝7.6Hz,2H),7.78(d,J＝7.2Hz,2H),7.72(q,J＝7.6Hz,2H),7.61(m,1H),7.55(t,J＝7.6Hz,3H),7.38(d,J＝7.2Hz,2H),6.93(d,J＝7.6Hz,2H),4.92(d,J＝6.8Hz,1H),3.72(t,J＝7.2Hz,2H),3.50(t,J＝6.4Hz,2H),3.32(t,J＝6.4Hz,2H),3.19(t,J＝6.8Hz,2H),2.90(s,1H),2.67(t,J＝7.2Hz,2H),2.35(t,J＝6.0Hz,2H),2.31(t,J＝6.0Hz,2H).TOF MS(EI+):C39H36N4O5S,理论值：672.2,实测值：672.2.
实施例18：N-(2-(4-硫吗啉基-1,8-萘二甲酰亚胺基)乙基)-N’-(3-二氮丙啶基-6-庚炔基)丁二酰胺(化合物18)的制备
(1)中间体B4的合成
按照实施例4步骤(1)、(2)的方法制备得中间体B4。
(2)中间体C18的合成
取136mg(0.4mmol)中间体B4和81mg(0.8mmol)三乙胺溶于20mL THF中，冰浴下滴加90mg(0.6mmol)丁二酸单甲酰氯，常温搅拌12h，水洗，二氯甲烷萃取，粗产物用二氯甲烷：甲醇＝15:1柱分离，得中间体C18，产率80％.
(3)中间体D18的合成
分别取137mg(0.3mmol)中间体C18，120mg(3.0mmol)NaOH，加入THF：H2O＝3:1的混合溶剂10mL，常温搅拌12h，反应液倒入100mL冷水中，用盐酸酸化至PH＝2，抽滤得中间体D18，产率98％。
(4)化合物18的合成
取88mg(0.2mmol)中间体D18溶于10mL DMF中，依次加入36.6mg(0.22mmol)原料E18，52mg(0.4mmol)DIPEA，常温搅拌5min后加入HATU 91mg(0.24mmol)，点板跟踪反应(大约反应2h)，水洗，二氯甲烷萃取，粗产物用二氯甲烷：甲醇＝15:1柱分离，得化合物18，产率67％.
化合物18的1H NMR测定结果以及质谱测定结果如下：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:8.52(t,J＝7.2Hz,1H),8.36(t,J＝7.2Hz,1H),8.29(d,J＝8.4Hz,1H),8.01(t,J＝6.0Hz,1H),7.87(t,J＝7.2Hz,1H),7.72(d,J＝7.6Hz,2H),7.55(d,J＝8.4Hz,1H),7.52(t,J＝7.6Hz,1H),3.70(t,J＝6.8Hz,2H),3.35(t,J＝6.8Hz,2H),3.32(t,J＝7.2Hz,2H),2.52(m,4H),2.67(t,J＝7.2Hz,2H),2.34(t,J＝6.0Hz,2H),1.60(t,J＝6.0Hz,2H),1.41(t,J＝6.4Hz,2H).TOF MS(EI+):C29H32N6O4S,理论值：560.2,实测值：560.2.
实施例19：N-(2-(4-硫吗啉基-1,8-萘二甲酰亚胺基)乙基)-N’-(4-(4-戊炔酰胺基)-苯甲酰基苯基)丁二酰胺(化合物19)的制备
(1)中间体B4的合成
按照实施例6步骤(1)、(2)的方法制备得中间体B4。
(2)化合物19的合成
取68mg(0.2mmol)中间体B4溶于10mL DMF中，依次加入86.3mg(0.22mmol)原料C19，52mg(0.4mmol)DIPEA，常温搅拌5min后加入HATU 91mg(0.24mmol)，点板跟踪反应(大约反应2h)，水洗，二氯甲烷萃取，粗产物用二氯甲烷：甲醇＝15:1柱分离，得化合物19，产率53％.
化合物19的1H NMR测定结果以及质谱测定结果如下：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:10.03(s,1H),9.32(s,1H),8.53(t,J＝7.2Hz,1H),8.37(t,J＝7.2Hz,1H),8.29(d,J＝8.4Hz,1H),8.01(s,1H),7.87(t,J＝7.2Hz,1H),7.85(d,J＝7.2Hz,4H),7.81(d,J＝7.6Hz,2H),7.74-7.72(m,6H),7.61(m,1H),7.55(m,3H),3.70(t,J＝6.4Hz,2H),3.35(t,J＝7.2Hz,2H),3.32(t,J＝6.4Hz,2H),2.90(s,1H),2.67(t,J＝7.2Hz,2H),2.60(t,J＝6.8Hz,2H),2.45(t,J＝6.8Hz,2H),2.35(t,J＝6.0Hz,2H),2.31(t,J＝6.0Hz,2H).TOF MS(EI+):C41H39N5O6S,理论值：729.3,实测值：729.3.
实施例20：N-(2-(2-(2-(4-硫吗啉基-1,8-萘二甲酰亚胺基)乙基)乙氧基)乙氧基)-
N’-((2S)-1-((4R)-4-羟基-2-((4-(4-甲基-5-噻唑基)苄基)氨基甲酰基)-1-吡咯烷基)-3,3二甲基-1-氧代-2-丁基)丁二酰胺(化合物20)的制备
(1)中间体A2的合成
按照实施例2步骤(1)的方法制备得中间体A2。
(2)中间体B20的合成
分别取299mg(1mmol)中间体A2，740mg(5mmol)1,8-二氨基-3,6-二氧杂辛烷和506mg(5mmol)三乙胺，加入10mL乙醇，氮气保护下回流，点板跟踪反应(大约反应5h)，冷却，析出固体，过滤，固体用甲醇/水重结晶，得中间体B20，产率61％。
(3)化合物20的合成
取125mg(0.2mmol)中间体B20溶于10mL DMF中，依次加入92mg(0.22mmol)原料C20，52mg(0.4mmol)DIPEA，常温搅拌5min后加入HATU 91mg(0.24mmol)，点板跟踪反应(大约反应2h)，水洗，二氯甲烷萃取，粗产物用二氯甲烷：甲醇＝15:1柱分离，得化合物20，产率48％.
化合物20的1H NMR测定结果以及质谱测定结果如下：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:10.03(s,1H),9.32(s,1H),8.53(t,J＝7.2Hz,1H),8.37(t,J＝7.2Hz,1H),8.29(d,J＝8.4Hz,1H),8.01(s,1H),7.87(m,J＝7.2Hz,1H),7.83(s,1H),7.72(d,J＝7.2Hz,2H),7.69(d,J＝8.0Hz,2H),7.57(t,J＝7.2Hz,1H),7.49(d,J＝8.0Hz,2H),5.01(s,1H),4.40(m,J＝6.4Hz,3H),4.24(s,1H),4.07(m,J＝6.4Hz,1H),3.71(m,J＝6.4Hz,4H),3.52(m,J＝6.4Hz,4H),3.48(m,J＝6.4Hz,2H),3.39(t,J＝6.4Hz,2H),3.32(t,J＝7.2Hz,2H),3.28(t,J＝6.4Hz,2H),2.77(s,3H),2.67(t,J＝7.2Hz,2H),2.50(t,J＝6.0Hz,2H),2.48(m,J＝6.4Hz,2H),2.35(t,J＝6.0Hz,2H),0.94(s,9H).TOF MS(EI+):C48H59N7O9S2,理论值：941.4,实测值：941.3.
实施例21：N-(2-(2-(2-(4-硫吗啉基-1,8-萘二甲酰亚胺基)乙基)乙氧基)乙氧基)-N’-(2-((N-(2,6-二氧代-3-哌啶基)-3-邻苯二甲酰亚胺基)氨基)乙基)丁二酰胺(化合物21)的制备
(1)中间体B20的合成
按照实施例18步骤(1)、(2)的方法制备得中间体B20。
(2)化合物21的合成
取125mg(0.2mmol)中间体B20溶于10mL DMF中，依次加入70mg(0.22mmol)原料C21，52mg(0.4mmol)DIPEA，常温搅拌5min后加入HATU 91mg(0.24mmol)，点板跟踪反应(大约反应2h)，水洗，二氯甲烷萃取，粗产物用二氯甲烷：甲醇＝15:1柱分离，得化合物21，产率46％.
化合物21的1H NMR测定结果以及质谱测定结果如下：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:11.17(s,1H),8.53(t,J＝7.2Hz,1H),8.37(t,J＝7.2Hz,1H),8.29(d,J＝8.4Hz,1H),8.32(s,1H),8.01(s,1H),7.87(m,J＝7.2Hz,1H),7.59(m,J＝8.0Hz,2H),7.57(t,J＝7.2Hz,1H),7.25(t,J＝8.0Hz,2H),7.00(t,J＝8.0Hz,2H),6.79(s,1H),4.44(t,J＝6.4Hz,1H),3.71(m,J＝6.4Hz,4H),3.63(m,J＝6.4Hz,2H),3.52(m,J＝6.4Hz,4H),3.41(m,J＝6.4Hz,2H),3.39(t,J＝6.4Hz,2H),3.31(t,J＝7.2Hz,2H),3.28(t,J＝6.4Hz,2H),2.77(s,3H),2.67(t,J＝7.2Hz,2H),2.50(t,J＝6.0Hz,2H),2.35(t,J＝6.0Hz,2H),2.15-2.11(m,4H).TOF MS(EI+):C41H45N7O10S,理论值：827.3,实测值：827.2.
实施例22：通过荧光偏振分析法检测化合物在体外抑制Bcl-2和Mcl-1蛋白的能力
合成一个带有21个氨基酸的Bid BH3肽段(氨基酸：79-99：QEDIIRNIARHLAQVGDSMDR)，并在N端标记上6-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(FAM)作为荧光标签(FAM-Bid)。竞争结合实验中所用的反应体系为GST-Bcl-2蛋白(40nM)或Mcl-1蛋白(40nM)，和FAM-Bid多肽(5nM)溶于反应缓冲液中(100mM K3PO4,pH 7.5；100μg/mL牛γ白蛋白；0.02％叠氮化钠)。在96孔板中，每孔加入100μL反应体系，然后加入1μL不同浓度的溶于DMSO的待检测化合物的母液(10mM)，终浓度为100μM。同时设立两个对照组，一个对照组为反应体系中只含有Bcl-2或Mcl-1和FAM-Bid(相当于0％抑制率)，另一对照组中的反应体系只含有FAM-Bid肽段。96孔板经过4个小时的避光孵育后，进行酶标仪上检测。荧光极化值(mP)在由530nm波长激发产生的485nm发射波长下测量。Ki值通过Wang等人报道的计算方程得到。计算Ki的程序可以通过以下网址免费的获得：http://sw16.im.med.umich.edu/software/calc ki/。
按照上述相同的试验方法检测其他化合物的BH3类似程度，它们与Bcl-2和Mcl-1蛋白的竞争结合常数(Ki)在也多是nM级，以(-)-Gossypol为阳性对照，4-氨基取的萘酰亚胺为阴性对照。具体结果如表1所示。
表1.本发明化合物的荧光偏振分析法实验结果
表1的结果可知，化合物1-21表现出对抗凋亡蛋白—Mcl-1和Bcl-2蛋白—亚微摩尔级亲和力，其中，化合物7，8，12,13表现出最好的对Mcl-1和Bcl-2蛋白的亲和力。说明本发明中涉及的4-取代萘酰亚胺骨架系列化合物能够高效的在体外解离抗凋亡蛋白与BH3-only蛋白的相互作用,而相应位置仅有氨基取代的萘酰亚胺类化合物则不能。
实施例23：通过流式细胞技术检测化合物7诱导MCF-7细胞系的凋亡情况
本实验通过Annexin-V/propidium iodide staining by flow cytometry试剂盒(碧云天，苏州，中国C1063)检测化合物7(5μM和10μM)作用于人类白血病U937细胞系24h细胞凋亡情况。
实验步骤如下：
1.细胞收集：悬浮细胞直接收集到10mL的离心管中，每样本细胞数为5×106/mL，1000r/min离心5min，弃去培养液；
2.用孵育缓冲液洗涤1次，500～1000r/min离心5min；
3.用100μL的标记溶液重悬细胞，室温下避光孵育10～15min；
4.500～1000r/min离心5min沉淀细胞孵育缓冲液洗1次；
5.加入荧光(SA-FLOUS)溶液4℃下孵育20min，避光并不时振动，通过流式细胞仪，检测化合物7对诱导U937细胞的凋亡情况。以未加入检测化合物的作为对照组。
流式细胞仪分析：流式细胞仪激发光波长用488nm，用一波长为515nm的通带滤器检测FITC荧光，另一波长大于560nm的滤器检测PI。
结果判断：凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如PI有抗染性，坏死细胞则不能。细胞膜有损伤的细胞的DNA可被PI着染产生红色荧光，而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。因此，在细胞凋亡的早期PI不会着染而没有红色荧光信号。正常活细胞与此相似。在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为(FITC-/PI-)；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为(FITC+/PI+)；而右下象限为凋亡细胞，显现(FITC+/PI-)(见图1)。图1的结果显示，相对于对照组(control)，加入化合物7的U937细胞的凋亡细胞明显增多，且随着化合物浓度的增加凋亡细胞也增多，24h时，5μM，10μM的化合物7分别诱导35％和60％的人类白血病U937细胞系细胞的凋亡。
本发明的化合物1-22对于其他肿瘤细胞如K562、KU812等，也能够高效的诱导肿瘤细胞凋亡。
实施例24：化合物依赖Bax/Bak的细胞毒性实验
磷酸钙共沉淀转染3μg Bax/Bak干扰质粒(Santa Bio Inc.USA Bax/Bak序列分别为GCTCTGAGCAGATCATGAA和CCCATTCACTACAGGTGAA)至U937细胞中，转染24小时后，收集细胞，Western检测RNA干扰后Bax/Bak蛋白表达情况，相同处理无质粒转染的细胞组设为对照组。转染后的细胞接种于96孔板中(1×105个/孔)，平行进行未转染质粒细胞组的对照实验，按实验设计浓度梯度加入待检测化合物7，作用24小时后，MTT检测细胞活力，实验同时MTT检测不同浓度化合物7对未转染Bax/Bak干扰质粒的正常细胞HEk293细胞的毒性，结果如附图2所示，Gossypol作为非特异性BH3类似物与本发明的化合物对比平行处理，可见Gossypol对U937细胞的毒性在未转染和转染细胞中没有差异(图2A)，但本发明化合物7在未转染和转染细胞中表现出明显的差别(对U937细胞的死亡率分别为90％和10％左右)，说明化合物7具有绝对依赖Bax/Bak的细胞毒性,化合物7对未转染干扰质粒的HEk293细胞基本没有表现出杀伤力(化合物浓度50μM时细胞死亡率为10％左右)(图2B)。
按上述相同试验方法检测其他20个化合物，通过对比检测化合物作用于转染细胞和未转染细胞的IC50值变化，说明所检测化合物也均具有绝对依赖Bax/Bak的作用特点(见表2)。而4-氨基取代的萘酰亚胺作用于转染细胞和未转染细胞的IC50值基本不变，说明4-氨基取代的萘酰亚胺并不依赖Bax/Bak的作用特点(见表2)。表2.本发明化合物依赖Bax/Bak的细胞毒性实验结果
表2的结果表明，本发明的化合物1-21对Bax/Bak干扰质粒感染的细胞的毒性显著低于未转染细胞，可知本发明化合物对癌细胞的细胞的毒性是依赖于Bax/Bak蛋白实现的。氨基取代的萘酰亚胺化合物对Bax/Bak干扰质粒感染的细胞的毒性与未转染细胞几乎相同，可知氨基取代的萘酰亚胺化合物对癌细胞的细胞的毒性是不依赖于Bax/Bak蛋白实现的。
表2的结果表明，本发明的化合物1-21对正常细胞HEk293表现为＞50μM的IC50，基本没有表现出杀伤力。氨基取代的萘酰亚胺化合物对正常细胞HEk293表现为IC50＝7.9μM，杀伤力甚至高于对Bax/Bak干扰质粒感染的细胞。证实本发明涉及的化合物相比于类似的氨基取代的萘酰亚胺化合物对肿瘤细胞的杀伤具有更好的特异性，而对正常细胞的杀伤作用小。
实施例25：通过电泳凝胶成像检测化合物在体外和活细胞中荧光标记、分离、富集Bcl-2和Mcl-1蛋白的能力
将10μM化合物17分别加入实验组和对照组含有5μM Bcl-2、5μM MDM2和5μM BSA蛋白的PBS缓冲液中(0.5M NaCl，0.04M PBS)，对照组再加入竞争性抑制剂化合物12 50μM。在4℃下静置孵育2h，使用365nm紫外灯照射30min，然后将实验组和对照组分别进行SDS-PAGE电泳，荧光凝胶成像，考马斯亮蓝染色。
结果如图3A所示，加入化合物17的实验组中Bcl-2蛋白条带在荧光成像中显示出荧光信号，而其他对照蛋白和加入竞争性抑制剂的Bcl-2蛋白则不显示荧光信号(图3A)。结果表明化合物17可以在体外选择性的荧光标记Bcl-2蛋白。
将50μM化合物19分别加入实验组和对照组的MCF-7细胞系中，对照组细胞系中同时加入200μM竞争性抑制剂化合物12，在37℃下孵育24h。用不含化合物的新培养及换液清洗细胞3次，然后使用365nm紫外灯照射30min，收集细胞并裂解。在细胞裂解液中分别依次加入200μM生物素-N3、2.5mM抗坏血酸钠、600μM THPTA和100μM硫酸铜。25℃机械振动下孵育2h，超滤出去未反应的生物素-N3，向样品中加入链霉亲和素标记的琼脂糖珠，4℃孵育过夜。移去上清液，琼脂糖珠用PBS缓冲液洗涤3次，加入1X SDS loading buffer煮样，然后将实验组和对照组分别进行SDS-PAGE电泳，银染和凝胶成像。
结果如图3B所示，加入化合物19的实验组在凝胶成像图中含有Bcl-2蛋白和Mcl-1条带，而几乎不含其他蛋白的条带。加入竞争性抑制剂后，凝胶成像图中的Bcl-2蛋白和Mcl-1条带变浅(图3B)。结果表明化合物19可以应用于在细胞内内选择性的分离和富集Bcl-2家族蛋白。
实施例27：通过免疫印迹法检测化合物21,22在活细胞中调控Bcl-2和Mcl-1蛋白水平的能力
分别用10μM化合物20,21和纯DMSO分别在25℃下处理MCF-7细胞24h。使用150μl细胞裂解液裂解5*106个肿瘤细胞。裂解液冰浴30min完全裂解后,4℃,12000rpm离心30min,取上清即得总蛋白，采用Bradford法进行蛋白定量，确定蛋白浓度。在总蛋白中加入对应量5X Loading Buffer,100℃沸水煮5min，使蛋白样品完全变性，-20℃保存待用；
取总蛋白(l00μg)通过SDS-PAGE进行电泳分离，将分离后的凝胶用湿转法将蛋白电转至PVDF膜上；然后，使用5％脱脂奶粉室温封闭PVDF膜2h；封闭之后，分别在PVDF膜上加入对应一抗BCL-2，MCL-1,4℃慢摇过夜，孵育完毕，用PBS洗涤3次，再加入对应二抗,室温慢摇孵育2h，孵育完毕，再用PBS洗涤3次，最后，用SuperSignal West Femto化学发光试剂孵育5min，进行曝光。
结果如图4所示，加入化合物20和21的实验组在成像图中含有Bcl-2蛋白和Mcl-1条带相比于对照组明显变浅(图4)。结果表明化合物20和21可以在细胞内选择性降解Bcl-2和Mcl-1蛋白，从而在活细胞内调控Bcl-2家族蛋白的水平。
Claims (12)
1.4-取代萘酰亚胺类化合物，具有通式I的结构：
其中：
R1选自吗琳基、硫吗啉基、哌啶基、4-甲基哌啶基、4,4-二甲基哌啶基、哌嗪基、4-C1-4烷基取代的哌嗪基、4-苄基哌嗪基、苯甲氨基或由下述基团任意取代的苯甲氨基：OH、OCH3、I、Br、Cl、NO2、NHCH3、N(CH3)2、CN、苯基或C1-4烷基；
R2选自H、R3、ZR3、哌啶基、哌啶酮基、哌啶二酮基、吡咯烷基、吡咯烷酮基、吡咯烷二酮基、C1-6烷基或取代C1-6烷基；
所述的R3选自取代或未取代的苯基、萘基、苯并呋喃基、噻吩基或吲哚基，所述的取代是由下述基团任意取代：C1-4烷基、C1-4烯基、C1-4炔基、苯基、OH、I、Br、Cl、NO2、NHCH3、N(CH3)2、CN、CF3、COOH、SO3H、COOR6、CONHR6、SO3R6、SO2NHR6或OR6；其中的R6选自C1-4烷基、C1-4烯基、C1-4炔基、苯基、苄基、CH2COOH或CH2CONH2；
所述的Z选自(CH2)m、(CH2)mCONH、(CH2)mNHCO、(CH2)mOCO、(CH2)mNHSO2、(CH2)mOSO2、(CH2)mCONH(CH2)nO、(CH2)mNHCO(CH2)nO、羰基或磺酰基，m、n各自独立地是1-3的整数；
所述的取代C1-6烷基是由下述基团任意取代的C1-6烷基：OH、OCH3、I、Br、Cl、NO2、NH2、NHCH3、N(CH3)2、CH(OCH3)2、CHO、CN、COOH、COOCH3、COOC2H5或R3。
2.根据权利要求1所述的4-取代萘酰亚胺类化合物，其特征在于，所述的R3选自苯基、萘基、吲哚基或由下述基团任意取代的苯基：C1-4烷基、C1-3烯基、C1-3炔基、COOH、OH、I、Br、Cl或OR6。
3.根据权利要求2所述的4-取代萘酰亚胺类化合物，其特征在于，所述的R3选自苯基、萘基、吲哚基、2-甲基苯基、3-甲基苯基、4-甲基苯基、4-乙基苯基、3-异丙基苯基、4-异丙基苯基、4-叔丁基苯基、2-羧基苯基、3-羧基苯基、4-羧基苯基、2-羟基苯基、3-羟基苯基、4-羟基苯基、3,4,5-三羟基苯基、2-碘苯基、4-碘苯基。
4.根据权利要求1或3所述的4-取代萘酰亚胺类化合物，其特征在于，所述的R2选自R3、ZR3，C1-6烷基以及由下述基团任意取代的C1-6烷基：CHO、COOH、COOCH3或COOC2H5。
5.根据权利要求4所述的4-取代萘酰亚胺类化合物，其特征在于，所述的R2选自R3、ZR3或CHO取代的C1-6烷基。
6.根据权利要求1所述的4-取代萘酰亚胺类化合物，其特征在于，所述的R1是吗琳基、硫吗啉基或苯甲氨基。
7.根据权利要求1所述的4-取代萘酰亚胺类化合物，选自：
8.4-取代萘酰亚胺类化合物的衍生物，其特征在于，是权利要求1所述的4-取代萘酰亚胺类化合物被L-R4或L-R5取代后所获得的衍生物；其中，
所述的L选自L1～L6:
其中，p是1-3的整数，q是1-10的整数；
所述的R4选自式i～vi的基团：
所述的R5选自式vii或viii的基团：
式vii中，l为2-10的整数。
9.根据权利要求8所述的4-取代萘酰亚胺类化合物的衍生物，其特征在于，所述的衍生物具有式ix或式x的结构：
10.根据权利要求8所述的4-取代萘酰亚胺类化合物的衍生物，选自：
11.权利要求1所述的4-取代萘酰亚胺类化合物在制备Bcl-2家族蛋白抑制剂中的应用。
12.权利要求8所述的化合物的衍生物在制备功能性试剂中的应用，所述的功能性试剂用于Bcl-2家族蛋白识别、标记及调控。
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