CN110272640A - 一种耐酸菌超分辨成像染料及其合成方法和应用 - Google Patents

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Abstract

一种耐酸菌超分辨成像染料及其合成方法和应用，该染料具体分子结构以琥珀酰亚胺活性酯取代的罗丹明螺酰胺为基本结构单元，其结构式如下(1)所示：本发明开发的耐酸菌超分辨成像染料不仅具有耐酸的性能，而且保留了可见光激活性能。因此这类耐酸菌超分辨成像染料可以应用于超分辨成像技术中不受酸性环境的干扰。

Description

一种耐酸菌超分辨成像染料及其合成方法和应用
技术领域
本发明属于荧光染料和成像领域，具体涉及一种耐酸菌超分辨成像染料及其合成方法和应用。
背景技术
近年来发展的一系列超高分辨率成像技术，其中基于单分子定位的光激活定位显微技术(PLAM)和随机光学重构显微技术(STORM或dSTORM)使光学显微镜的空间分辨达到了前所未有的高度。目前超分辨显微成像技术已经被广泛应用到生命科学研究中，然而尽管超分辨显微成像技术取得了巨大的进步，将荧光显微镜的空间分辨率推进到了20纳米。
开发生物成像用单分子定位超分辨荧光染料，目前最好的方法是在高荧光强度和光稳定性的染料中引入光开关功能。罗丹明类染料由于其突出的光性能，是目前超分辨中用的最多的一类染料，特别是硅罗丹明的性能更加突出，在超分辨中的应用受到广泛关注。罗丹明染料的荧光“明-暗”状态是基于酰胺螺环开关，传统罗丹明螺酰胺在紫外光辐照下，会由不发光的闭环结构变为强荧光发射的开环结构。S.W.Hell等人最早利用这一独特的光化学反应将罗丹明螺酰胺标记在固定的PtK2细胞的微丝骨架上，利用单分子定位技术实现了超分辨成像。但是，包括罗丹明螺酰胺在内，光开关分子在细胞内应用所面临的共同难题是需要紫外光作为“开-关”激发光，例如罗丹明螺酰胺需要用波长小于375nm的光来将闭环结构打开变为有荧光的开环结构，而紫外光会对细胞产生严重的光毒性，难以在活细胞中应用。为了改善激活光波长，W.E.Moerner等人将酰胺取代基修饰为较大的共轭体系，将吸收波长向长波长移动，首次将开关激发光延长到可见光区(>400nm)，实现了对细菌表面的三维超分辨荧光成像。由此，罗丹明螺酰胺在超分辨成像中表现出巨大潜力。
尽管罗丹明螺酰胺作为光激活染料已经可以用于超分辨荧光成像，但是这类染料分子还有一些不足还需要改进，首先是酸激活荧光干扰，通常情况下酸激活和光激活是两种都能够打开罗丹明酰胺螺环的方式。细胞内存在许多偏酸性的环境(如溶酶体，酸性蛋白等)，当罗丹明螺酰胺染料使用于这些酸性环境中，其酸激活产生的荧光会严重干扰甚至导致光激活性能完全失效，因此在酸性环境中基于这类染料的荧光探针目前无法应用于超分辨荧光成像。此外，一些嗜酸微生物生长的最适pH常在4以下，典型的例如嗜酸微生物如酸矿水中的化能自养硫氧化细菌和自热的煤堆和酸热泉中的嗜热嗜酸细菌等，而这些嗜酸菌嗜酸的奥秘仍未解开，若要将超分辨成像在这个领域加以应用，传统会被酸激活的罗丹明螺酰胺类染料显然也是不合适的。令人遗憾的是，目前报道的绝大多数罗丹明螺酰胺都只能用紫外光(＜375nm)辐照来实现光激活荧光，而紫外光对生物体具有光毒性不利于活细胞超分辨成像。尽管S.W.Hell等人使用了长波长的双光子激光激活罗丹明螺酰胺的荧光并应用于超分辨成像，但是双光子激光功率要比单光子激光大几个数量级，这也会对成像的生物体造成不可修复的光损伤。W.E.Moerner等人开发的可见光激活染料最大吸收波长约为380nm，仅在405nm左右有一点吸收带边，因此也不能高效地利用405nm激光实现光激活。综上所述，开发一类具有耐酸性同时在可见激光波长(405nm)具有最大吸收值的罗丹明螺酰胺类荧光开关染料对于活细胞超分辨荧光成像显得尤为迫切和重要。
发明内容
本发明提供了一种耐酸菌超分辨成像染料及其合成方法和应用，具体结构以罗丹明螺酰胺为基本单元，将琥珀酰亚胺(NHS)活性酯共价连接到罗丹明螺酰胺分子上，通过NHS活性酯即可以将这类荧光开关探针非特异性标记到活细菌细胞表面的膜蛋白上，通过STORM技术就可以对细菌表面进行超分辨成像。
本发明所述的一种耐酸菌超分辨成像染料，其结构式如下所示：
本发明还提供了一种耐酸菌超分辨成像染料的合成方法，合成路线如下：
具体步骤为：
(1)将3-硝基罗丹明和三氯氧磷按物质的量比1:3-20溶解于1,2-二氯乙烷，升温至84℃回流，搅拌1-3小时后蒸除溶剂，将粗酰氯中间体溶于无水二氯甲烷，随后逐滴加入三乙胺和6-(4-氨基苯乙炔基)萘酐混合溶液，其中粗酰氯中间体、三乙胺和6-(4-氨基苯乙炔基)萘酐三者的物质的量比为1:0.5-2:1-2，室温搅拌8-24小时后减压蒸除溶剂，产物通过硅胶柱色谱分离提纯得到中间体P1；
(2)取步骤(1)中的产物P1与二水合氯化亚锡和浓盐酸分别按物质的量比1:1.5-5:0.1-2溶解于混合于无水乙醇中，回流搅拌5-8小时后减压蒸除溶剂，产物通过硅胶柱色谱分离提纯得到中间体P2；
(3)取步骤(2)中的产物P2与乙酰氯按物质的量比1:1-30混合于无水二氯甲烷中，室温搅拌反应0.5-3小时后，产物通过硅胶柱色谱分离提纯得到中间体P3；
(4)取步骤(3)中的产物P3与4-氨甲基吡啶分子按物质的量比例1:1-10混合并置于无水乙醇中，升温至78℃回流2-10小时，最后通过硅胶柱色谱提纯即可得到中间体产物P4。
(5)取步骤(4)中的产物P4和3-碘丙酸琥珀酰亚胺酯按物质的量比例1:1-10混合于无水乙腈中，升温至82℃回流8-36小时，反应结束后减压蒸除溶剂，残余物置于乙酸乙酯中搅拌过夜，抽滤得到最终的一种用于耐酸菌超分辨荧光成像的可见光光控耐酸性荧光分子开关染料(P5)。
一种耐酸菌超分辨成像染料的应用，基于其耐酸性或可见光激活的优点应用在超分辨荧光成像或被作为荧光探针分子用于生物及化学物质的传感及检测等诸多领域。
本发明开发的耐酸菌超分辨成像染料不仅具有耐酸的性能，而且保留了可见光激活性能。因此这类耐酸菌超分辨成像染料可以应用于超分辨成像技术中不受酸性环境的干扰。
附图说明
图1：实施例5制备得到产品P5的核磁氢谱；
图2：实施例5制备得到产品P5的核磁碳谱；
图3：实施例5制备得到产品P5的高分辨质谱；
图4：实施例5中P5标记的枯草芽孢杆菌表面的共聚焦成像及三维超分辨荧光成像图。
具体实施方式
本发明给出了一种耐酸菌超分辨成像染料的合成及其作为光激活荧光染料应用于耐酸菌的超分辨荧光成像技术领域。
实施例1
中间体分子(P1)合成路线和产物结构如下：
合成步骤及表征：将3-硝基罗丹明(2.92g，6mmol)和三氯氧磷(5.6mL，60mmol)置于1,2-二氯乙烷(150mL)，升温至84℃回流，搅拌2小时后蒸除溶剂得到暗紫红色油状液体。将粗酰氯产物溶于二氯甲烷(100mL)，随后逐滴加入三乙胺(3mL)和6-(4-氨基苯乙炔基)萘酐(1.88g，6mmol)混合溶液中，室温搅拌24小时后减压蒸除溶剂，残余物通过柱色谱(硅胶，二氯甲烷/乙酸乙酯，30:1v/v)分离得到黄色粉末产物P1(2.44g，52％)。对黄色粉末产物进行了核磁和质谱的表征：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.75(d,J＝8.4Hz,1H),8.65(d,J＝7.1Hz,1H),8.55(d,J＝7.7Hz,1H),7.92(d,J＝7.6Hz,1H),7.90–7.82(m,1H),7.75(d,J＝7.7Hz,1H),7.61(t,J＝7.8Hz,1H),7.46(d,J＝8.6Hz,2H),7.36(d,J＝7.6Hz,1H),7.11(d,J＝8.6Hz,2H),6.68(d,J＝8.5Hz,2H),6.40–6.24(m,4H),3.34(dd,J＝14.0,6.8Hz,8H),1.17(t,J＝7.0Hz,12H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ162.61,160.40,160.12,155.81,152.86,149.11,146.15,137.83,133.85,133.78,133.65,132.56,132.34,131.68,130.88,130.18,129.25,128.33,128.03,127.85,125.99,122.74,121.48,119.52,119.04,117.77,108.34,104.38,100.50,97.83,86.03,66.95,44.33,12.52.LC-MS(ESI):m/z:calcd:782.2740；found:783.2810[M+H]+。
经上述检测，鉴定其结构为P1所示。
实施例2
中间体分子(P2)合成路线和产物结构如下：
合成步骤及表征：将P1(1.56g，2mmol)，二水合氯化亚锡(1.80g，8mmol)和浓盐酸(9mL)置于无水乙醇(50mL)中，升温至78℃回流，搅拌8小时后减压蒸除溶剂，粗产物通过柱色谱(硅胶，乙酸乙酯/石油醚，1:3v/v)分离得到黄色固体P2(1.27g，85％)。对黄色固体产物进行了核磁和质谱的表征：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.75(d,J＝8.3Hz,1H),8.64(d,J＝7.2Hz,1H),8.54(d,J＝7.7Hz,1H),7.90(d,J＝7.7Hz,1H),7.85(t,J＝7.8Hz,1H),7.44(d,J＝8.5Hz,2H),7.22(t,J＝7.7Hz,1H),7.13(d,J＝8.6Hz,2H),6.76(d,J＝8.5Hz,2H),6.60(d,J＝8.0Hz,1H),6.37(d,J＝7.4Hz,1H),6.35–6.24(m,4H),5.44(s,2H),3.32(q,J＝7.0Hz,8H),1.16(t,J＝7.0Hz,12H)。13C NMR(101MHz,CDCl3)δ169.69,160.45,160.16,154.88,152.57,148.73,145.74,138.85,134.52,133.91,133.73,132.58,132.28,131.66,130.76,130.19,129.48,128.53,127.77,125.45,119.00,118.41,117.57,113.36,112.35,111.95,108.16,106.83,101.06,97.69,85.74,67.17,44.26,12.57。LC-MS(ESI)：m/z：计算值：752.2999；实验值：753.3073[M+H]+。
经上述检测，鉴定其结构为P2所示。
实施例3
中间体P3合成路线和产物结构如下：
合成步骤及表征：将P2(0.75g，1mmol)和乙酰氯(0.12g，1.5mmol)混合于二氯甲烷(10mL)，搅拌2小时后减压蒸除溶剂，粗产物通过柱色谱(硅胶，乙酸乙酯/石油醚，1:3v/v)分离得到黄色粉末产物P3(0.76g，96％)。对黄色粉末产物进行了核磁和质谱的表征：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ10.58(s,1H),8.75(d,J＝8.2Hz,1H),8.65(d,J＝7.2Hz,1H),8.55(d,J＝7.7Hz,1H),8.51(d,J＝8.2Hz,1H),7.92(d,J＝7.7Hz,1H),7.90–7.82(m,1H),7.56–7.43(m,3H),7.00(d,J＝8.5Hz,2H),6.81(d,J＝7.6Hz,1H),6.67(d,J＝8.8Hz,2H),6.37–6.26(m,4H),3.33(q,J＝7.0Hz,8H),2.31(s,3H),1.17(t,J＝7.0Hz,12H)。13CNMR(100MHz,CDCl3)δ169.31,168.94,160.38,160.11,153.44,152.94,148.99,137.79,137.43,134.99,133.82,133.77,132.55,132.43,131.70,130.91,130.20,129.24,128.48,127.84,126.34,119.68,119.10,118.08,117.81,115.18,108.26,105.41,100.48,97.77,86.08,67.99,44.32,24.98,12.55。LC-MS(ESI)：m/z：计算值：794.3104；实验值：795.3177[M+H]+。
经上述检测，鉴定其结构为P3所示。
实施例4
中间体P4合成路线和产物结构如下：
合成步骤及表征：P3(0.40g，0.5mmol)和4-氨基甲基吡啶(0.15mL，1.5mmol)混合于无水乙醇(10mL)，升温至78℃回流，搅拌8小时后减压蒸除溶剂，残余物通过柱色谱(硅胶，二氯甲烷/甲醇，20:1v/v)分离提纯得到黄色粉末产物P4(0.42g，96％)。对黄色粉末产物进行了核磁和质谱的表征：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ10.59(s,1H),8.66(dd,J＝16.5,7.7Hz,2H),8.52(d,J＝9.9Hz,4H),7.89(d,J＝7.5Hz,1H),7.81(t,J＝7.7Hz,1H),7.48(dd,J＝13.1,8.0Hz,3H),7.37(d,J＝4.3Hz,2H),6.98(d,J＝8.1Hz,2H),6.81(d,J＝7.4Hz,1H),6.67(d,J＝8.7Hz,2H),6.42–6.23(m,4H),5.36(s,2H),3.33(q,J＝7.0Hz,8H),2.30(s,3H),1.16(t,J＝6.6Hz,12H)。13C NMR(101MHz,CDCl3)δ169.29,168.89,163.89,163.61,153.41,152.95,149.99,148.97,145.77,137.50,137.41,134.93,132.83,132.34,132.04,131.60,130.83,130.67,128.48,128.12,127.48,126.40,123.21,122.49,121.48,120.04,118.08,117.78,115.25,108.23,105.40,99.36,97.76,86.49,67.99,44.30,42.64,24.97,12.54。LC-MS(ESI)：m/z：计算值：884.3686；实验值：885.3804[M+H]+。
经上述检测，鉴定其结构为P4所示。
实施例5
中间体P5合成路线和产物结构如下：
合成步骤及表征：P4(0.26g，0.3mmol)和3-碘丙酸琥珀酰亚胺酯(0.1g，0.35mmol)混合于无水乙腈(10mL)，升温至82℃回流，搅拌24小时后减压蒸除溶剂，残余物置于乙酸乙酯中搅拌过夜，抽滤得到棕色粉末产物P5(0.26g，74％)。对棕色粉末产物进行了核磁氢谱、核磁碳谱和高分辨质谱表征如图1、图2、图3所示：
1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.41(s,1H),9.02(d,J＝5.8Hz,2H),8.83(d,J＝8.0Hz,1H),8.58(d,J＝7.0Hz,1H),8.49(d,J＝7.5Hz,1H),8.34(d,J＝8.0Hz,1H),8.24(d,J＝5.8Hz,2H),8.07(d,J＝7.4Hz,1H),8.04–7.94(m,1H),7.66(d,J＝8.1Hz,2H),7.60–7.49(m,1H),7.09(d,J＝7.6Hz,2H),6.73(d,J＝6.8Hz,2H),6.62–6.12(m,4H),5.50(s,2H),4.92(t,2H),3.63(t,2H),3.35(q,J＝7.0Hz,8H),2.80(s,4H),2.25(s,3H),1.08(t,J＝6.1Hz,12H)。13C NMR(101MHz,DMSO)δ169.99,168.86,168.05,166.49,163.52,163.23,157.90,151.96,145.00,137.69,137.05,135.13,132.44,132.38,131.53,130.98,130.93,130.25,128.36,127.94,126.44,125.39,122.76,122.12,119.02,117.65,117.38,114.52,113.45,98.45,86.69,66.59,54.76,42.98,31.27,25.45,24.63,12.17。LC-MS(ESI)：m/z：计算值：1054.4134；实验值：1054.4212[M]+。
经上述检测，鉴定其结构为P5所示。
实施例6
将野生枯草芽孢杆菌的菌株放置于5mLLB培养基中37℃摇床摇动培养过夜，取1mL细菌培养液至于1.5mL离心管中离心，转速10000转/分，离心时间3min，离心结束后弃去上层清液，往离心管中里加入1mL PBS(pH＝4.5)缓冲溶液再悬浮后接着离心并去掉上层清液。接着将实施例5中的产物P5配成浓度为10-8M的DMSO溶液，取50uL染料的DMSO母液稀释到950uLPBS(pH＝4.5)缓冲溶液中，取上述混匀的母液1mL加入细菌离心管中再悬浮后置于37℃摇床摇动培养30min，随后重复上述离心-再悬浮过程7-10次，最后取20uL细菌培养液滴到琼脂糖凝胶上，将接种有细菌的琼脂糖盖到用氩等离子体清洗过的载玻片上，即可置于超分辨STORM显微镜下成像，选择常用的405nm激光作为激活光，561nm激光作为激发光，通过随机光激活以及重叠重构技术即可得到超分辨图像。图4为P5标记的枯草芽孢杆菌表面后分别在激光共聚焦显微镜和超分辨STORM显微镜下拍摄的图像。
实施例7
中间体P5合成路线和产物结构如下：
合成步骤及表征：P4(0.26g，0.3mmol)和3-碘丙酸琥珀酰亚胺酯(0.085g，0.3mmol)混合于无水乙腈(10mL)，升温至82℃回流，搅拌8小时后减压蒸除溶剂，残余物置于乙酸乙酯中搅拌过夜，抽滤得到棕色粉末产物P5(0.21g，60％)。对棕色粉末产物进行了核磁氢谱、核磁碳谱和高分辨质谱表征下所示：
1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.41(s,1H),9.02(d,J＝5.8Hz,2H),8.83(d,J＝8.0Hz,1H),8.58(d,J＝7.0Hz,1H),8.49(d,J＝7.5Hz,1H),8.34(d,J＝8.0Hz,1H),8.24(d,J＝5.8Hz,2H),8.07(d,J＝7.4Hz,1H),8.04–7.94(m,1H),7.66(d,J＝8.1Hz,2H),7.60–7.49(m,1H),7.09(d,J＝7.6Hz,2H),6.73(d,J＝6.8Hz,2H),6.62–6.12(m,4H),5.50(s,2H),4.92(t,2H),3.63(t,2H),3.35(q,J＝7.0Hz,8H),2.80(s,4H),2.25(s,3H),1.08(t,J＝6.1Hz,12H)。13C NMR(101MHz,DMSO)δ169.99,168.86,168.05,166.49,163.52,163.23,157.90,151.96,145.00,137.69,137.05,135.13,132.44,132.38,131.53,130.98,130.93,130.25,128.36,127.94,126.44,125.39,122.76,122.12,119.02,117.65,117.38,114.52,113.45,98.45,86.69,66.59,54.76,42.98,31.27,25.45,24.63,12.17。LC-MS(ESI)：m/z：计算值：1054.4134；实验值：1054.4212[M]+。
经上述检测，鉴定其结构为P5所示，性能检测实验同实施例6，实验结果和实施例6一样。
实施例8
中间体P5合成路线和产物结构如下：
合成步骤及表征：P4(0.26g，0.3mmol)和3-碘丙酸琥珀酰亚胺酯(0.86g，3mmol)混合于无水乙腈(10mL)，升温至82℃回流，搅拌24小时后减压蒸除溶剂，残余物置于乙酸乙酯中搅拌过夜，抽滤得到棕色粉末产物P5(0.27g，76％)。对棕色粉末产物进行了核磁氢谱、核磁碳谱和高分辨质谱表征如下所示：
1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.41(s,1H),9.02(d,J＝5.8Hz,2H),8.83(d,J＝8.0Hz,1H),8.58(d,J＝7.0Hz,1H),8.49(d,J＝7.5Hz,1H),8.34(d,J＝8.0Hz,1H),8.24(d,J＝5.8Hz,2H),8.07(d,J＝7.4Hz,1H),8.04–7.94(m,1H),7.66(d,J＝8.1Hz,2H),7.60–7.49(m,1H),7.09(d,J＝7.6Hz,2H),6.73(d,J＝6.8Hz,2H),6.62–6.12(m,4H),5.50(s,2H),4.92(t,2H),3.63(t,2H),3.35(q,J＝7.0Hz,8H),2.80(s,4H),2.25(s,3H),1.08(t,J＝6.1Hz,12H)。13C NMR(101MHz,DMSO)δ169.99,168.86,168.05,166.49,163.52,163.23,157.90,151.96,145.00,137.69,137.05,135.13,132.44,132.38,131.53,130.98,130.93,130.25,128.36,127.94,126.44,125.39,122.76,122.12,119.02,117.65,117.38,114.52,113.45,98.45,86.69,66.59,54.76,42.98,31.27,25.45,24.63,12.17。LC-MS(ESI)：m/z：计算值：1054.4134；实验值：1054.4212[M]+。
经上述检测，鉴定其结构为P5所示，性能检测实验同实施例6，实验结果和实施例6一样。

Claims (3)

1.一种耐酸菌超分辨成像染料，其特征在于其结构式如下所示：
2.如权利要求1所述一种耐酸菌超分辨成像染料的合成方法，其特征在于：该合成方法的具体步骤如下：
(1)将3-硝基罗丹明和三氯氧磷按物质的量比1:3-20溶解于1,2-二氯乙烷，升温至84℃回流，搅拌1-3小时后蒸除溶剂，将粗酰氯中间体溶于无水二氯甲烷，随后逐滴加入三乙胺和6-(4-氨基苯乙炔基)萘酐混合溶液，其中粗酰氯中间体、三乙胺和6-(4-氨基苯乙炔基)萘酐三者的物质的量比为1:0.5-2:1-2，室温搅拌8-24小时后减压蒸除溶剂，产物通过硅胶柱色谱分离提纯得到中间体P1；
(2)取步骤(1)中的产物P1与二水合氯化亚锡和浓盐酸分别按物质的量比1:1.5-5:0.1-2溶解于混合于无水乙醇中，回流搅拌5-8小时后减压蒸除溶剂，产物通过硅胶柱色谱分离提纯得到中间体P2；
(3)取步骤(2)中的产物P2与乙酰氯按物质的量比1:1-30混合于无水二氯甲烷中，室温搅拌反应0.5-3小时后，产物通过硅胶柱色谱分离提纯得到中间体P3；
(4)取步骤(3)中的产物P3与4-氨甲基吡啶分子按物质的量比例1:1-10混合并置于无水乙醇中，升温至78℃回流2-10小时，最后通过硅胶柱色谱提纯即可得到中间体产物P4；
(5)取步骤(4)中的产物P4和3-碘丙酸琥珀酰亚胺酯按物质的量比例1:1-10混合于无水乙腈中，升温至82℃回流8-36小时，反应结束后减压蒸除溶剂，残余物置于乙酸乙酯中搅拌过夜，抽滤得到最终的一种用于耐酸菌超分辨荧光成像的可见光光控耐酸性荧光分子开关染料P5。
3.权利要求1所述的一种耐酸菌超分辨成像染料在超分辨荧光成像、分子探针及荧光传感及其他领域的应用。
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