JP2008500446A - 長波長のチオール反応性フルオロフォア - Google Patents
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Abstract
【選択図】図1
Description
本出願は、2004年5月21日に出願された先行する米国特許仮出願第60/573,944号明細書、および2004年8月6日に出願された米国特許仮出願第60/599,514号明細書の、35U.S.C.§119(e)の下での利益を主張するものである。これらの出願は、その全文が参照により本明細書に組み込まれている。
A−Y
を有するフルオロフォアであって、
式中、Aは、スクエアレイン核、ナイルレッド核、ベンゾジオキサゾール核、クマリン核、およびアザクマリン核からなる群から選択され、およびYは、
A−Y’−B
を有するバイオセンサー化合物であって、
式中、Aは、スクエアレイン核、ナイルレッド核、ベンゾジオキサゾール核、クマリン核、およびアザクマリン核からなる群から選択されるフルオロフォアであり、Y’−Bは、
A−Y’−B (I)
を有する。
または
A−Y (II)
を有する。式中、Aは、スクエアレイン核、ナイルレッド核、ベンゾジオキサゾール核、クマリン核、アザクマリン核、またはそれらの誘導体であり、Yは、チオール反応性基である。
この実施例では、ヨードエステルスクエアレイン核1を生成するために、スキームIの工程を使用した。
この実施例では、ヨードアセトアミドスクエアレイン核2は、スキームIIの工程により生成された。この実施例は、RがC2H5であるスキームIIに対応する。
1H NMR(CD3OD,TMS)δppm:4.295(t,CH2,2H);4.871(s,CH3,3H);5.102(t,CH2,2H);7.733および8.148〜8.279(m,芳香族,8H)。
C18H15N2O2Sの分子量の計算値は323(M+)、実測値323(FAB)
1H NMR(CDCl3,TMS)δppm:1.385(t,CH3,3H);1.456(t,CH3,3H);4.064(q,CH2,2H);4.794(q,CH2,2H);5.479(s,CH,1H);7.026〜7.518(m,芳香族,4H)。
C14H11NO3Sの分子量の計算値は273(M+)、実測値273(FAB)
1H NMR(CDCl3,TMS)δppm:1.439(t,CH3,3H);4.127(t,CH2,2H);4.181(q,CH2,2H);4.381(t,CH2,2H);5.924(s,CH,1H);5.964(s,CH,1H);7.070〜7.823(m,芳香族,12H)。
C32H23N3O4S2の分子量の計算値は577(M+)、実測値577(FAB)。
1H NMR(CD3OD,TMS)δppm:1.420(t,CH3,3H);3.780(t,CH2,2H);4.320(q,CH2,2H);4.520(t,CH2,2H);5.924(s,CH,1H);5.964(s,CH,1H);7.200〜7.850(m,芳香族,8H)。
C24H21N3O2S2の分子量の計算値は447(M+)、実測値447(FAB)
1H NMR(CD3OD,TMS)δppm:1.420(t,CH3,3H);3.900(s,CH2,2H);4.300(q,CH2,2H);4.450(t,CH2,2H);4.480(t,CH2,2H);5.820(s,CH,1H);5.980(s,CH,1H);7.200〜8.200(m,芳香族,8H)。
C26H22IN3O3S2の分子量の計算値は615(M+)、実測値615(FAB)。
この実施例では、Rが、スキームIIの中間体3cのCH2CH2CO2Hであること以外は、実施例2の工程が繰り返された。その結果得られた、保護アミノ基を備えた中間体色素3dは、NMR分光法により特性化された。
1H NMR(DMSO−d6,TMS)δppm:2.720(t,CH2,2H);3.970(t,CH2,2H);4.470(t,CH2,2H);4.530(t,CH2,2H);5.760(s,CH,1H);5.800(s,CH,1H);7.100〜8.450(m,芳香族,12H)。
1H NMR(DMSO−d6,TMS)δppm:1.420(t,CH3,3H);3.900(s,CH2,2H);4.300(q,CH2,2H);4.450(t,CH2,2H);4.480(t,CH2,2H);5.820(s,CH,1H);5.980(s,CH,1H);7.200〜8.200(m,芳香族,8H)。
この実施例では、チオール反応性ナイルレッド核4は、スキームIIIにより調製された。
1H NMR(D2O)δppm:3.59(s,CH3,3H);3.90(t,CH2,2H);4.05(t,CH2,2H);7.22〜7.30(m,芳香族,2H);7.50(d,芳香族,1H);7.77(d,芳香族,1H)。13C NMR(D2O)δppm:42.44、57.92、58.72、120.29、122.52、125.93、140.56、149.93、163.21。
C9H12N2O2の分子量の計算値は180(M+)、実測値181(M+1)(FAB)
1H NMR(CDCl3)δppm:2.98(s,3H)、3.48(t,2H)、3.83(t,2H)、6.20(s,1H)、6.77(d,1H)、7.10(d,1H)、7.45(s,1H)、7.60〜7.75(m,3H)、7.72(m,1H)、8.08(m,1H)。13C NMR(CDCl3)δppm:39.2、55.6、60.3、102.2、110.2、113.6、124.7、126.3、126.6、126.8、130.6、132.3、133.7、135.1、145.8、148.2、152.4、182.5、183.8。
C19H26N2O3の分子量の計算値は320(M+)、実測値321(M+1)(FAB)
1H NMR(CDCl3)δppm:3.14(s,3H)、3.66(s,2H)、3.74(t,2H)、4.38(t,2H)、6.40(s,1H,ArH)、6.54(d,1H,ArH)、6.72(d,1H,ArH)、7.64〜7.75(m,3H,ArH)、8.29(d,1H,ArH)、8.65(d,1H,ArH)。13C NMR(CDCl3)δppm:−6.1、39.6、50.9、63.0、97.5、106.4、110.1、124.1、125.6、126.0、130.6、131.2、131.7、131.98、132.0、141.5、146.5、151.8、152.2、169.0、184.1。
C21H17IN2O4の分子量の計算値は488、実測値489(MH+)(FAB−MS)。
この実施例は、スキームIVの工程によりナイルレッド核5を生成した。
1H NMR(CDCl3)δppm:1.22(t,6H)、3.40(q,4H)、4.19(t,2H)、4.40(t,2H)、6.23(s,1H)、6.36(d,1H)、6.59(dd,1H)、7.09(d,1H)、7.52(d,1H)、7.70(m,2H)、7.84(m,2H)、7.96(d,1H)、8.13(d,1H)。13C NMR(CDCl3)δppm:12.8、37.5、45.2、65.3、96.3、105.2、106.5、109.8、118.6、123.5、124.9、126.0、127.9、131.3、132.1、134.2、139.6、146.8、150.7、152.2、161.0、162.8、168.4、183.3。
C30H25N3O5の分子量の計算値は507、実測値508(MH+)(FAB−MS)。
1H NMR(CDCl3)δppm:1.25(t,6H)、3.17(t,2H)、3.45(q,4H)、4.20(t,2H)、6.27(s,1H)、6.43(d,1H)、6.63(dd,1H)、7.15(m,1H)、7.56(d,1H)、8.02(m,1H)、8.18(d,1H)。13C NMR(CDCl3)δppm:12.8、41.6、45.3、63.9、96.4、105.4、106.6、109.9、118.4、124.9、125.9、127.4、128.0、131.3、134.3、147.1、151.0、152.3、161.7、183.5。
C22H23N3O3の分子量の計算値は377、実測値378(MH+)(FAB−MS)。
1H NMR(CDCl3)δppm:1.17(t,6H)、3.35(q,4H)、3.69(t,2H)、3.78(s,2H)、4.14(t,2H)、6.12(s,1H)、6.27(s,1H)、6.48(dd,1H)、6.91(d,1H)、7.34(d,1H)、7.74(s,1H)、7.95(s,1H)。13C NMR(CDCl3)δppm:12.9、29.9、40.1、45.3、66.9、96.3、105.2、106.7、109.8、118.0、124.9、125.9、127.8、131.3、134.1、139.4、147.0、151.0、152.2、161.1、168.1、183.3。
C24H24IN3O4の分子量の計算値は545、実測値546(M−H+)(CI−MS)。
この実施例は、スキームVによりヨードアセトアミドベンゾジオキサゾール核6を生成した。
1H NMR(CDCl3)δppm:1.36(t,CH3,6H);3.91(q,CH2,4H);6.19(d,CH,1H);7.82(d,CH,1H);10.01(s,CH,1H)。
C11H13N3O2の分子量の計算値は219(M+)、実測値220(M+1)(FAB)
1H NMR(CDCl3,TMS)δppm:1.42(t,CH3,6H);3.20(t,2H);4.0(q,CH2,4H);4.40(t,CH2,2H);6.50(s,CH,1H);6.51(s,CH,1H);7.5〜8.7(m,芳香族,10H)。
C29H26N5O3Sの分子量の計算値は524(M+)、実測値524(FAB)
得られた色素6eは、以下第1表の極性感受性を示した。
この実施例は、スキームVIによりヨードアセトアミドベンゾジオキサゾール核7を生成した。中間体7cは、実施例6の6cと同様の方法で生成された。
1H NMR(CD3OD)δppm:2.67(s,CH3,3H);4.30(t,CH2,2H);4.88(t,CH2,2H);7.81(m,4H);7.93(d,2H);8.93(m 2H)。13C NMR(CD3OD)δppm:22.12、39.63、60.69、124.49、130.00、132.90、135.76、145.45、162.06、169.20。
この実施例は、反応スキームVIaによりヨードアセチルベンゾジオキサゾール核7’を生成するために用いることができる。
この実施例は、スキームVIIによりヨードアセチルベンゾジオキサゾール核8を生成する。
1H NMR(CDCl3)δppm:1.36(t,CH3,6H);3.91(q,CH2,4H);6.19(d,CH,1H);7.82(d,CH,1H);10.01(s,CH,1H)。
C11H13N3O2の分子量の計算値は219(M+)、実測値220(M+1)(FAB−MS)。
1H NMR(CD3OD)δppm:3.26(s,3H)、4.06(t,2H)、4.94(t,2H)、7.82(t,1H)、7.90(t,1H)、8.25〜8.32(m,2H)。13C NMR(CD3OD)δppm:16.8、52.3、59.1、117.0、124.2、128.5、129.4、129.7、141.6、178.1。
1H NMR(CD3OD)δppm:1.38(t,6H)、3.13(t,2H)、4.03(q,4H)、4.13(t,2H)、6.51(d,1H)、6.53(d,1H)、7.67(m,1H)、7.78(m,1H)、7.89(m,1H)、8.03(m,1H)、8.14(m,1H)、8.20(m,1H)。13C NMR(CD3OD)δppm:11.62、44.54、51.08、59.18、104.72、108.01、109.18、115.96、123.33、127.47、127.70、129.09、142.10、143.40、144.25、144.97、145.35、149.04、172.69。
C29H26N5O3Sの分子量の計算値は395(M+)、実測値395(FAB MS)。
この実施例は、反応スキームVIIaによりヨードアセチルベンゾジオキサゾール核8’を生成する。
この実施例は、スキームVIIIによりアザクマリン核9を生成する。
1H NMR(CDCl3)δppm:2.48(s,3H)、3.06(s,6H)、6.40(s,1H)、6.65(m,1H)、7.50(m,1H)。13C NMR(CDCl3)δppm:21.0、40.5、97.5、109.8、122.9、129.2、147.6、148.9、152.0、154.7。
C11H12N2O2の分子量の計算値は204、実測値205(MH+)(FAB−MS)。
1H NMR(CDCl3)δppm:3.00(s,3H)、3.64(t,2H)、4.36(t,2H)、6.76(m,2H)、7.28(m,2H)、8.07(s,1H)。13C NMR(CDCl3)δppm:38.9、51.2、61.3、112.4、117.1、129.5、149.0、161.2。
C10H13NO2の分子量の計算値は179、実測値179(M+)(FAB−MS)。
1H NMR(CDCl3)δppm:2.96(s,6H)、3.10(s,3H)、3.47(t,2H)、3.82(t,2H)、6.36(s,1H)、6.46(s,1H)、6.53(d,1H)、6.75(m,1H)、6.80(d,2H)、7.24(m,2H)、7.56(d,1H)。13C(CDCl3)δppm:38.9、40.6、55.7、60.3、96.9、102.2、103.8、111.0、113.3、117.4、129.4、129.8、143.1、144.5、145.3、149.7、150.3、151.8、178.88。
この実施例は、反応スキームVIIIaによりアザクマリン核9’を生成する。
この実施例では、反応スキームIXを用いて化合物10を生成した。
1H NMR(CDCl3)δppm:1.22(t,6H)、1.29(t,3H)、3.42(q,4H)、4.23(q,2H)、6.48(d,1H)、6.60(d,1H)、6.94(d,1H)、7.30(d,1H)、7.53(d,1H)、7.70(s,1H)。13C NMR(CDCl3)δppm:12.7、14.6、45.2、60.6、97.2、108.8、109.6、114.8、119.7、130.0、139.6、144.6、151.9、156.7、160.5、168.0。
C18H21NO4の分子量の計算値は315、実測値315(M+)(FAB−MS)。
1H NMR(CDCl3)δppm:1.25(t,6H)、3.48(q,4H)、6.48(d,1H)、6.64(m,1H)、7.40(d,1H)、8.25,(s,1H)、10.12(s,1H)。13C NMR(CDCl3)δppm:12.67、45.49、97.35、108.43、110.39、114.50、132.4、145.6、153.7、159.2、162.1、188.2。
C14H15NO3の分子量の計算値は245、実測値246(MH+)(FAB−MS)。
1H NMR(CD3OD)δppm:3.26(s,3H)、4.06(t,2H)、4.94(t,2H)、7.82(t,1H)、7.90(t,1H)、8.25〜8.32(m,2H)。13C NMR(CD3OD)δppm:16.8、52.3、59.1、117.0、124.2、128.5、129.4、129.7、141.6、178.1。
この実施例は、反応スキームIXaによりクマリン核10’を生成する。
GGBP結合:200uLのPBS緩衝液中のH152C GGBP(4nmol)溶液を調製し、これをDTT(8nmol)で室温にて30分間培養した。スクエアレインヨードエステル核1(1mg、120uLのDMSO中に部分溶解)溶液を添加し、混合物をホイルで包み、室温で4時間放置した。標識タンパク質を、PBS緩衝液で溶出しながら、NAP−5サイズ排除カラムから第2留分として得た。タンパク質のグルコースに対する蛍光反応を、96ウェルマイクロウェルプレートのいくつかのウェル中で分析した。グルコースをPBSに添加し、最終グルコース濃度を0〜1mMにした。標識タンパク質のグルコースに対する蛍光反応は、グルコースをPBS緩衝液中の標識タンパク質溶液に添加して判定した。典型的には、蛍光測定は、Varian Cary Eclipse蛍光光度計(Varian, Inc.、パロアルト、CA)またはPTI分光蛍光計(Photon Technology International, Inc.、ローレンスビル、NJ)のどちらかを使用した。プレートの蛍光強度は、625nmでの励起および660nmでの発光を用いて、マイクロウェルプレート調節器を備えたVarian Cary Eclipse蛍光光度計により読み取った。この結果、スクエアレインヨードエステル核1−結合タンパク質複合体蛍光特性は、分析物濃度に対応しており、したがってバイオセンサーとして機能していた。これは、図3に示す通り、標識タンパク質およびグルコース間の近似Kdが6uMであることを示した。
式中、Fは蛍光強度であり、Finfは無限遠の蛍光強度であり、F0はグルコースゼロの蛍光強度であり、xは、以下の関係式により決まるグルコース遊離濃度([GLc]free)である:
式中、Fconst=(Finf−F0)/Kd。
表3に示した通り、タンパク質にシステイン置換を有する、色素2とGGBP(グルコース/ガラクトース結合タンパク質)との複合体をいくつか調製した。一般に、化合物2とGGBPとの複合体は、化合物1とGGBPとの複合体より溶液中では大幅に安定していた。PBS緩衝液中のタンパク質のアリコートを、DTT(ジチオスレイトール)で10〜30分間処理し、続いてDMSO中のヨードアセチルスクエアレイン色素を添加した。約3〜4時間後、反応を止め、サイズ排除クロマトグラフィー(NAP−5カラム)により、色素標識されたタンパク質を得た。蛍光反応を、600nmでの励起および625nm〜700nmでスキャンされた発光により判定した。最大発光は660nm付近で観察された。
同様のプロトコルを用いて、E149C GGBP、H152C GGBPおよびS337C MBPを、ナイルレッド化合物4および5で標識した。蛍光励起は550nmであり、最大発光は650nmであった。蛍光強度の変化を表4に示す。この結果、ナイルレッド核4−および5−結合タンパク質複合体の蛍光特性は、分析物濃度に対応しており、したがってバイオセンサーとして機能していた。
9(IAZCO)を用いたグルコース/マルトース検出:アザクマリン核IAZCOを、前述の実施例の通りにグルコース結合タンパク質(GBP)およびマルトース結合タンパク質(MBP)に結合させた。システイン残基置換を伴うタンパク質GGBP(グルコース/ガラクトース結合タンパク質)およびMBP(マルトース結合タンパク質)の誘導体を調製した。一般的には、PBS緩衝液中のタンパク質のアリコートを、DTT(ジチオスレイトール)で10〜30分間処理した後、DMSO中の色素9を添加した。約3〜4時間後、反応を止め、サイズ排除クロマトグラフィー(NAP−5カラム)により、色素標識されたタンパク質を得た。標識されたタンパク質のグルコース/マルトースに対する蛍光反応を、600nmでの励起および620nm〜700nmでスキャンされた発光により判定した。この結果、9(IAZCO)に結合したグルコース/ガラクトース結合タンパク質変異体E149Cは、100mMグルコースの存在下では9nmの波長シフト(ブルーシフト)を示し(653nmから644nmへシフト)、したがってバイオセンサーとして機能していた。
経皮的読み取り実験
1つの実施形態では、インビトロでの経皮的グルコース/マルトース検出実験を、本明細書に記載のNIR色素を用いて行った。
(b)化合物9のヨードアセチルアザクマリン核(IAZCO)に結合したS337C MBP
(c)化合物4のヨードアセチルナイルレッド核(INR)に結合したS337C MBP
これらの複合体を、架橋ポリエチレングリコール(PEG)ディスクに注入し、ディスクを経皮的読み取り試験に使用した。マイクロウェルプレート中のこれら複合体のPBS溶液についても経皮試験を行った。ブランクのPEGディスクおよびPBSを対照として使用した。PBSおよびPEGディスク中のタンパク質活性は、インビトロでの実験前に試験した。
図6では、PEGディスク10をウサギの皮膚12に乗せ、レーザー14で励起し、検出器16により皮膚の裏側から読み取った。ウサギの皮膚は、厚さ約3〜4mmでヒトの目には透明でなかった。励起は590nmのLED光を用いて行い、蛍光強度は650nmでモニターした。フィルター18を用いて、励起光および励起散乱の干渉を回避した。
INR−MBP PEGディスクおよび溶液を用いて、上記の実験を繰り返した。9に結合したA213C GGBPの場合のように、PEGディスクおよび溶液ともに蛍光強度は安定していた。マルトースを添加すると蛍光強度は上昇し、2〜4分上昇し続けた。
Claims (43)
- R2は、C2からC4のアルキルであることを特徴とする、請求項1に記載のフルオロフォア。
- R2は、CH2CH2であることを特徴とする、請求項2に記載のフルオロフォア。
- R2Oは、−CH2CH2O−であることを特徴とする、請求項1に記載のフルオロフォア。
- R2N(R3)−は、−CH2CH2NH−であることを特徴とする、請求項1に記載のフルオロフォア。
- 式
A−Y’−B
を有するバイオセンサー化合物であって、
式中、Aは、蛍光発光を示し、かつスクエアレイン核、ナイルレッド核、ベンゾジオキサゾール核、クマリン核、およびアザクマリン核からなる群から選択されるフルオロフォアであり、
Y’−Bは、
またはY’−Bは、A’−CO−V−Bであり、A’は−R2O−または−R2N(R3)−(式中、R2はC1からC6のアルキル、R3はHまたはCH3)であり、およびV−Bは、−CH2−Bまたは
Bは、検出されるリガンドに結合親和性を有するレセプター)であり、前記バイオセンサー化合物は、前記リガンドの結合の結果としての蛍光特性における検出可能な変化を示すことを特徴とするバイオセンサー化合物。 - 前記レセプターは、結合タンパク質であることを特徴とする、請求項23に記載のバイオセンサー化合物。
- Bは、ペリプラズム結合タンパク質であることを特徴とする、請求項23に記載のバイオセンサー化合物。
- 前記バイオセンサーの蛍光発光は、575nmを超えることを特徴とする、請求項23に記載のバイオセンサー化合物。
- Bは、グルコース/ガラクトース結合タンパク質(GGBP)であることを特徴とする、請求項23に記載のバイオセンサー化合物。
- 前記結合タンパク質は、少なくとも1つのアミノ酸置換を有するグルコース/ガラクトース結合タンパク質であり、前記少なくとも1つのアミノ酸置換は、位置11のシステイン、位置14のシステイン、位置19のシステイン、位置43のシステイン、位置74のシステイン、位置107のシステイン、位置110のシステイン、位置112のシステイン、位置113のシステイン、位置137のシステイン、位置149のシステイン、位置213のシステイン、位置216のシステイン、位置238のシステイン、位置287のシステイン、位置292のシステイン、位置112のシステインおよび位置238のセリン、位置149のシステインおよび位置238のセリン、位置152のシステインおよび位置213のセリン、位置213のシステインおよび位置238のシステイン、位置149のシステインおよび位置213のアルギニン、位置149のシステインおよび位置213のセリンおよび位置238のセリン、および位置149のシステインおよび位置213のアルギニンおよび位置238のセリンからなる群から選択されることを特徴とする、請求項23に記載のバイオセンサー化合物。
- R2Oは、−CH2CH2O−であることを特徴とする、請求項23に記載のバイオセンサー化合物。
- R2N(R3)は、−CH2CH2NH−であることを特徴とする、請求項23に記載のバイオセンサー化合物。
- 少なくとも1つの変異結合タンパク質を有し、前記結合タンパク質のチオール基を介して前記結合タンパク質に共有結合されたフルオロフォアを伴うバイオセンサー化合物であって、前記フルオロフォアは、少なくとも約575nmで発光蛍光を示し、スクエアレイン核、ナイルレッド核、ベンゾジオキサゾール核、クマリン核およびアザクマリン核からなる群から選択されるバイオセンサー化合物を提供する工程、
前記結合タンパク質を分析物源と接触させて、前記分析物を前記結合タンパク質に結合させる工程、および、
前記結合タンパク質をエネルギー源に曝して前記フルオロフォアを励起する工程、および前記分析物源の分析物または分析物濃度の指標として蛍光特性を検出する工程
を含むことを特徴とする分析物の検出方法。 - 前記結合タンパク質は、ペリプラズム結合タンパク質であることを特徴とする、請求項33に記載の方法。
- 前記方法は、前記結合タンパク質を前記分析物源と連続的に接触させる工程、前記結合タンパク質を前記エネルギー源に連続的に曝す工程、および前記蛍光特性を検出する工程を含むことを特徴とする、請求項33に記載の方法。
- 前記変異結合タンパク質は、前記分析物の分析物濃度の変化の結果として立体構造が変化し、およびここで、前記方法は、前記分析物濃度の変化の結果として前記蛍光特性の変化を検出することを特徴とする、請求項33に記載の方法。
- 請求項33に記載の方法であって、前記変異結合タンパク質は、位置11のシステイン、位置14のシステイン、位置19のシステイン、位置43のシステイン、位置74のシステイン、位置107のシステイン、位置110のシステイン、位置112のシステイン、位置113のシステイン、位置137のシステイン、位置149のシステイン、位置213のシステイン、位置216のシステイン、位置238のシステイン、位置287のシステイン、位置292のシステイン、位置112のシステインおよび位置238のセリン、位置149のシステインおよび位置238のセリン、位置152のシステインおよび位置213のセリン、位置213のシステインおよび位置238のシステイン、位置149のシステインおよび位置213のアルギニン、位置149のシステインおよび位置213のセリンおよび位置238のセリン、および位置149のシステインおよび位置213のアルギニンおよび位置238のセリンからなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸置換を有するグルコース/ガラクトース結合タンパク質であることを特徴とする、請求項33に記載の方法。
- Bは、グルコース/ガラクトース結合タンパク質またはマルトース結合タンパク質であることを特徴とする、請求項33に記載の方法。
- R2Oは、−CH2CH2−O−であることを特徴とする、請求項38に記載の方法。
- R2N(R3)は、−CH2CH2NH−であることを特徴とする、請求項38に記載の方法。
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