RU2066455C1 - Маркер для люминесцентного иммуноанализа - Google Patents

Маркер для люминесцентного иммуноанализа Download PDF

Info

Publication number
RU2066455C1
RU2066455C1 RU94006940A RU94006940A RU2066455C1 RU 2066455 C1 RU2066455 C1 RU 2066455C1 RU 94006940 A RU94006940 A RU 94006940A RU 94006940 A RU94006940 A RU 94006940A RU 2066455 C1 RU2066455 C1 RU 2066455C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
marker
luminescent
uroporphyrin
coproporphyrin
maximum
Prior art date
Application number
RU94006940A
Other languages
English (en)
Other versions
RU94006940A (ru
Inventor
Н.С. Осин
А.Ф. Миронов
В.Д. Румянцева
О.Н. Понаморева
Original Assignee
Государственный научно-исследовательский институт биологического приборостроения
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Государственный научно-исследовательский институт биологического приборостроения filed Critical Государственный научно-исследовательский институт биологического приборостроения
Priority to RU94006940A priority Critical patent/RU2066455C1/ru
Publication of RU94006940A publication Critical patent/RU94006940A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2066455C1 publication Critical patent/RU2066455C1/ru

Links

Images

Landscapes

  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)

Abstract

Использование: иммунодиагностика, в частности к химии реагентов для люминесцентного анализа. Сущность изобретения: реагент Pt-уропорфириноктакислота может быть использован в качестве маркера антигенов и антител при проведении люминесцентного иммуноанализа с временным разрешением и позволяет уменьшить расход маркера при получении конъюгатов металлопорфинин/белок. Основные люминесцентные свойства: λвозб.макс. = 381 нм; λизл.макс. = 646 нм; τзатух. = 0,078 с; полуширина максимума возбуждения 20 нм; полуширина максимума фосфоресценции 21 нм; квантовый выход люминесценции 0,6-0,7.

Description

Изобретение относится к иммунодиагностике, в частности, к химии реагентов для люминесцентного иммуноанализа и может быть использовано в качестве маркера антигенов и антител.
Одним из наиболее чувствительных методов люминесцентного иммуноанализа является метод, в котором используются ковалентно связанные с антителами или антигенами (иммунологическими компонентами) порфириновые соединения.
Известны маркеры для люминесцентного анализа для получения ковалентно меченых конъюгатов с иммунологическими компонентами, в качестве которых используют различные типы флуоресцирующих порфиринов: копропорфирины (Савицкий А. П. и др. ДАН СССР, 1197, т. 293, стр. 744-748), порфирины с заместителями по мезоположению (ЕР N0127797, кл. МКИ С07Д 487/22). Эти порфирины водорастворимы, имеют достаточно высокий квантовый выход флуоресценции (до 0,2), разнесенные по длинам волн более чем на 180 нм области возбуждения (380-420 нм) и излучения (600-640 нм) и флуоресценции, позволяют получить довольно высокую чувствительность иммуноанализа.
Однако при проведении твердофазного иммуноанализа чувствительность определения иммунологических комплексов с помощью этих меток ограничивается уровнем 10-10.10-11М и обусловлена тем, что эквивалентный уровень фонового сигнала дают примеси, рассеянный свет и собственно полистирольный планшет, в котором проводятся измерения.
Известно использование Pd-копропорфирина 1 в качестве маркера для проведения люминесцентного иммуноанализа (Савицкий А.П. и др. ДАН СССР, 1989, т. 304, стр. 1005-1008). Этот маркер по сравнению с безметальными порфиринами способен длительно люминесцировать-фосфоресцировать при комнатной температуре в водном растворе. Для этого соединения характерно: максимум возбуждения 392 нм; максимум люминесценции (фосфоресценции) 665 нм; коэффициент экстинкции в полосе возбуждения в водном растворе 188400; полуширина в полосах возбуждения 25 нм; время жизни фосфоресценции в водном растворе с сульфитом натрия Х-100 1,2•10-3 с.
Существование длительной люминесценции Рd-копропорфирина со временем затухания 1,2•10-3 с позволяет использовать его в иммунолюминесцентном анализе с временным разрешением (ИЛАВР) при чувствительности определения иммунологических компонентов до 10-12М. Однако достигнутый предел детекции с помощью Рd-комплексов уступает хелатам с ионами Еu+3 типа β-дикетонов.
Наиболее близким аналогом предлагаемого маркера является Pt-копропорфирин-III-тетракислоты (а. с. СССР N1707539, класс МКИ G01N 33/532). Соединение имеет следующие характеристики: максимум возбуждения 381 нм; максимум люминесценции (фосфоресценции) 645 нм; полуширина в полосах возбуждения 20 нм; полуширина максимума люминесценции 21 нм; время затухания люминесценции в е раз в водном растворе с 2 мг/мл сульфита натрия и 0,1% тритона Х-100 при рН 7,4 0,75•103 с.
Маркер получают реакцией тетраметилового эфира копропорфирина с солью двухвалентной платины в бензонитриле, а затем омылением платинового комплекса тетраметилового эфира действием 2N едкого кали в тетрагидрофуране до платинового комплекса тетракислоты копропорфирина.
Использование конъюгатов белка с Рt-копропорфирином обеспечивает высокий уровень люминесценции, однако при использовании в качестве маркера для проведения иммуноанализа обладает следующими техническими недостатками.
Рt-копропорфирин слабо растворим в водных растворах с рН 6,5. Поэтому для получения конъюгатов с белками по методике, описанной в ЕР N0027797, 1984 г. требуется введение органических растворителей таких, как диметилсульфоксид, диметилформамид и др. а также проведение реакции при неоптимальных условиях для карбодиимидного метода синтеза конъюгатов. Это приводит к избыточному расходу Рt-копропорфирина и антител, а также к необходимости очистки от агрегатов. Кроме того, достаточно высокая степень гидрофобности Рt-копропорфирина приводит к неспецифической адсорбции конъюгатов в процессе иммуноанализа и увеличению фонового уровня люминесценции, что в итоге снижает чувствительность, специфичность и надежность анализа при выявлении низких концентраций искомого биоагента.
Задачей изобретения является создание маркера для люминесцентного иммуноанализа с временным разрешением на основе класса металлопорфиринов, который при использовании его в качестве люминесцентной метки для антигенов и антител позволит исключить указанные недостатки.
Поставленная задача решается синтезом по схеме 1 соединения Рt-уропорфирина кислоты.
Соединение (3) получают реакцией октаметилового эфира уропорфирина с солью двухвалентной платины в бензонитриле, а затем омылением комплекса октаметилового эфира действием 2 М едкого кали в тетрагидрофуране до платинового комплекса октакислоты уропорфирина.
Соединение (3) представляет собой после перекристаллизации из хлороформа с метанолом игольчатые кристаллы красновато-оранжевого цвета с температурой плавления > 300oС.
Figure 00000001

Электронный спектр в хлороформе, λмакс(ε•10-3) нм: 381.2 (266.0); 502.5 (13,7); 536.7 (53.0).
Мас. спектр (РDMS), м. вес. вычисл. 1136,3; м. вес. найд. 1136.7. Элементный состав: вычислено, С 50,74; Н 4,61; N 4,93; найдено, С 50,44; Н 4,83; N 5,01. С48H52N4O16Pt.
Изобретение считается новым, так как по сравнению с прототипом позволяет получить новый технический эффект, заключающийся в том, что повышается уровень сигнала люминесценции при иммуноанализе за счет лучшей растворимости уропорфиринов в водных растворах и большей степени их мономеризации. Кроме того, более высокая степень растворимости уропорфиринов в нейтральных и слабокислых средах, в которых проводится реакция синтеза конъюгатов, позволяет увеличить выход готовой продукции (соотношение "порфирин-белок") на единицу белка при синтезе карбодиимидным методом. Большая растворимость уропорфирина по сравнению с копропорфирином достигается за счет увеличения числа корбоксильных групп в соединении (см. "Способ получения уропорфирина", положительное решение по заявке N 92-009671/13).
Техническое решение имеет изобретательский уровень, так как авторам из существующего уровня техники не известно соединение подобного вида, используемое в качестве маркера для иммуноанализа.
Пример 1. Платиновый комплекс октаметилового эфира уропорфирина 50 мг октаметилового эфира уропорфирина, приготовленного микробиологическим путем по методике, описанной в ЕР N0027797, 1984 г. растворяют в 40 мл бензонитрила, добавляют 50 мг хлорплатинида калия К2PtCl4 (D.Dolphin "The Porphurin in Academic Press", N4, 1978, v.1, р. 471) и кипятят 15 ч в токе азота до исчезновения полосы поглощения при 625 нм. Бензонитрил отгоняют в вакууме, платиновый комплекс очищают с помощью колоночной хроматографии на оксиде алюминия в хлороформе. Отбирают наиболее подвижную красновато-оранжевую зону. Растворитель упаривают, вещество перекристаллизовывают из хлороформа с метанолом, получая 36 мг (60%); т.пл. > 300oС.
Электронный спектр в хлороформе, λмакс(ε•10-3) нм: 381.2 (266.0); 502.5 (13.7); 536.7 (53.0).
Мас. спектр (РDMS), м. вес вычисл. 1136,3; м. вес. найд. 1136,7. Вычислено, С 50,74; Н 4,61; N 4,93. Найдено, С 50,44; Н 4,83; N 5,01. С48H52N4O16Pt.
Пример 2. Платиновый комплекс уропорфирина. К раствору 16 мг октаметилового эфира уропорфирина в 5 мл тетрагидрофурана добавляют 5 мг 2N едкого кали и нагревают 2 ч. Тетрагидрофуран удаляют в вакууме, остаток разбавляют в 10 раз водой и металлокомплекс высаживают при рН 2,8. Осадок отфильтровывают, промывают водой, сушат в эксикаторе над оксидом фосфора. Получают 13,8 мг (95%).
Электронный спектр в 1% растворе бикарбоната натрия, λмакс(ε•10-3) нм: 381 (191,0); 502.5 (9,5); 534.5 (28,0). Люминесцентные характеристики Рt-комплексов уропорфиринов октакислоты представлены ниже: максимум возбуждения 381 нм; максимум люминесценции (фосфоресценции) 646 нм; полуширина максимума возбуждения 20 нм; полуширина максимума фосфоресценции 21 нм; квантовый выход люминесценции 0,6-0,7; время τ затухания люминесценции в"е" раз 0,078•10-3.
Условия регистрации: водный раствор с 2 мг/мл сульфита натрия и 0,1%-ный тритон Х-100, рН 7,4.
В таблице представлены данные сравнительной оценки люминесцентных свойств конъюгатов антител с Рt-копропорфирином тетракислоты и Pt-уропорфирином октакислоты.
Условия регистрации: lвозб. 381 нм, λрегистр. 645 нм; нужная длина волны выделялась с помощью интерференционных фильтров; время задержки строба 50 мкс, длительность строба 100 мкс, время регистрации 1 с. Регистрация проводилась в полистироловых стрипах (ТУ-64-2-375-86). Анализ осуществлялся на приборе ИФИ-01 (производство ГосНИИ БП). Из данных таблицы видно, что предлагаемый реагент детектируется с пороговым уровнем детекции выше, чем Рt-копропорфирин тетракислота в среднем в 1,3 раза.
Пример 3. Получение конъюгатов Рt-уропорфирина октакислоты с иммуноглобулином человека класса IgG.
Для получения конъюгатов используют соотношение реакционных масс "белок-порфирин-карбодиимид", равное 1: 20:200 (см. ЕР N0027797, 1984 г.). Растворяют 0,5 мг Pt-уропорфирина октакислоты в 0,8 мл 0,01 М фосфатного буфера с 0,15 М хлористого натрия при рН 7,3. Растворяют 1 мг хлоргидрата 1-этил-3-диметиламинопропилкарбодиимида (фирма "Serva", ФРГ) в 0,2 мл 0,01 М фосфатного буфера. Доводят рН буфера с 7,3 до 6,0 добавлением 0,1N соляной кислоты, смешивают 0,2 мл раствора карбодиимида и 0,8 мл Рt-уропорфирина октакислоты и выдерживают смесь при рН 6,0 в течение 30 мин при 20oС. К реакционной массе добавляют 0,2 мл раствора белка в концентрации 20 мг/мл (IgG человека производства НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалея) в 0,01 М фосфатном буфере и доводят рН раствора до 7,5-8, используя 1N едкий натр. Смесь выдерживают 4 ч при комнатной температуре, затем добавляют 0,1 мл моноэтаноламина (фирма "Serva", ФРГ) и после инкубации в течение 15 мин проводят отделение конъюгатов белка от свободного Рt-уропорфирина октакислоты на колонке 1х28 см с сефадексом G-50 при элюировании 0,3 М трис-НСl буфером при рН 7,4 со скоростью 0,5 мл/мин.
Расчет содержания белка и порфирина в конъюгате осуществляют по формуле
Figure 00000002

Figure 00000003

Соотношение белок/порфирин в конъюгате 1,36/0,44 3,08.
Использование аналогичных концентраций и соотношений реакционных масс для Рt-копропорфирина тетракислоты обеспечивает получение конъюгатов с соотношением копропорфирин/белок 1,6.
Таким образом, использование Рt-уропорфирина октакислоты позволяет увеличить выход конъюгатов с белком по сравнению с Рt-копропорфирином почти в 2 раза.
Использование Pt-упропорфирина октакислоты при получении конъюгатов антигенов или антител с металлопорфирином позволяет улучшить соотношение металлопорфирин/белок, что приводит к увеличению выхода целевого продукта. Кроме того, Рt-уропорфирин обладает лучшими люминесцентными свойствами. Все это приводит к упрощению и удешевлению проведения иммуноанализов.
Получение Рt-уропорфирина и конъюгатов антигенов или антител с ним осуществляется на стандартном оборудовании по известным методикам с использованием выпускаемых промышленностью реагентов.
Предлагаемый реагент найдет применение в иммуноанализе в качестве люминесцентного маркера антигенов и антител, которые входят составной частью в диагностические тест-системы для анализов, и может быть использован в медицине, ветеринарии, микробиологии и др.

Claims (1)

  1. Pt-Уропорфирин октаксилота формулы
    Figure 00000004

    как маркер для люминесцентного иммуноанализа.
RU94006940A 1994-02-25 1994-02-25 Маркер для люминесцентного иммуноанализа RU2066455C1 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU94006940A RU2066455C1 (ru) 1994-02-25 1994-02-25 Маркер для люминесцентного иммуноанализа

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU94006940A RU2066455C1 (ru) 1994-02-25 1994-02-25 Маркер для люминесцентного иммуноанализа

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU94006940A RU94006940A (ru) 1996-08-10
RU2066455C1 true RU2066455C1 (ru) 1996-09-10

Family

ID=20152973

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU94006940A RU2066455C1 (ru) 1994-02-25 1994-02-25 Маркер для люминесцентного иммуноанализа

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2066455C1 (ru)

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
1. Авторское свидетельство СССР N 1707539, кл. G 01 N 37/532, 1992. 2. ДАН СССР, 1989, т.304, с. 1005-1008. *

Also Published As

Publication number Publication date
RU94006940A (ru) 1996-08-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP3224538B2 (ja) 蛍光プローブとしての蛍光性ポルフィリン、および蛍光性フタロシアニン―ポリエチレングリコール、ポリオール、およびサッカライド誘導体
US5585279A (en) Time-resolved luminescence binding assays using a fluorescent transition metal label other than ruthenium
DE3750503T2 (de) Chemilumineszierende Acridinium- und Phenantridiniumsalze.
JP2866419B2 (ja) 希土類クリプテート及びその製造方法とその合成中間体とその蛍光トレーサーとしての利用方法
EP2036953A2 (en) Long wavelength thiol-reactive fluorophores
JPH0714935B2 (ja) 巨大多環式化合物
CA1254829A (en) Fluorescent assay and compounds useful therein
JP2002529466A (ja) ポルフィリン化合物、それらの結合体および前記結合体の使用に基づく検定方法
JP3964374B2 (ja) 均一系アッセイにおけるアクリジニウム化合物および誘導体の新規用途
CA2360054A1 (en) Reagent system and method for increasing the luminescence of lanthanide (iii) macrocyclic complexes
JPH0718874B2 (ja) ▲蛍▼光複合体及び生物学的診断アッセイ
Bahr et al. Highly photoresistant chemosensors using acridone as fluorescent label
US7371524B2 (en) Substituted azaporphyrins as fluorescence labels
CN111675674A (zh) 一种aie分子及其合成方法
EP0255534B1 (en) Binding assay and assay reagent
CN109206351A (zh) 一种基于花菁结构测钯离子的近红外荧光探针、其制备方法及应用
WO1993019366A1 (en) Fluorescence immunoassays using fluorescent dyes free of aggregation and serum binding
JP3538277B2 (ja) 免疫測定用標識試薬及びそれに用いる蛍光性化合物及び錯体、及びそれらを用いる生物物質の免疫測定法
RU2066455C1 (ru) Маркер для люминесцентного иммуноанализа
CN113563298B (zh) 一类含水溶性取代基罗丹明荧光染料其制备方法和应用
CN114456114A (zh) 基于ict和pet双重机制的萘二酰亚胺荧光化学传感器及其合成方法和应用
JP3551984B2 (ja) アクリジン誘導体
EP0812823B1 (en) Chemiluminescent group-containing carbodiimide compound
CN115850174B (zh) 一种检测胺的荧光探针及其制备方法和应用
CN112851575B (zh) 具有聚集诱导发光性质的比率型溶酶体pH探针及应用