CN103773060B

CN103773060B - 有机荧光染料分子及其合成方法和应用

Info

Publication number: CN103773060B
Application number: CN201410005274.XA
Authority: CN
Inventors: 李猛; 王树; 冯丽恒; 陈传峰
Original assignee: Institute of Chemistry CAS
Current assignee: Institute of Chemistry CAS
Priority date: 2014-01-06
Filing date: 2014-01-06
Publication date: 2015-10-28
Anticipated expiration: 2034-01-06
Also published as: CN103773060A

Abstract

本发明属于细胞荧光成像领域，涉及有机荧光染料分子及其合成方法和应用。本发明以2ˊ,3"-二溴-1,2,7,8-四氢-2",3ˊ-二甲氧基-3,4:5,6-二苯并菲-9,10-二甲酸酐与正十二烷基胺于有机溶剂中进行加热反应，将得到的内酰亚胺与芳香硼酸、Na₂CO₃，在氩气保护及四（三苯基膦）钯存在的条件下于有机溶剂中进行反应，得到式（I）所示的有机荧光染料分子；所述的有机荧光染料分子在制备成纳米粒子后用于活细胞的荧光染料，并在活细胞的荧光成像中进行应用。所述有机荧光染料分子及有机荧光染料分子的纳米粒子的合成方法简单、原料廉价、稳定性好，并可方便大量制备。

Description

有机荧光染料分子及其合成方法和应用

技术领域

本发明属于细胞荧光成像领域，涉及一类具有多色荧光的有机荧光染料分子及其合成方法，以及由该有机荧光染料分子得到的纳米粒子用于活细胞的荧光染料，并在活细胞的细胞荧光成像中进行应用。

背景技术

细胞作为重要的生命单元，在生命体的生长等方面有重要的作用，比如细胞的细胞含有的遗传物质，在基因的表达、复制、重组和修复等方面有至关重要的作用。细胞的组织架构的变化与疾病的表型有密切的关系。比如，核修饰的阳离子和肿瘤细胞的癌变关系已经被科学家所发现（D.Zink,A.H.Fischer,J.A.Nickerson,Nat.Rev.Cancer2004,4,677）。因此，对细胞的研究，比如，细胞荧光成像及靶向定位细胞等，有着重要的意义。这不仅可以使人们深入了解基因组信息，还可以为病理学家提供早期诊断和预测病变信息。然而目前可以特异性定位到细胞的荧光染料（如：PI，DAPI，Hoechst33342等）存在诸多问题，比如：种类少、价格昂贵、可修饰性差等。所以细胞染料的研究作为前沿领域的热点和难点，长期备受研究人员的青睐。

目前在该领域，具有代表性的主要有基于量子点的纳米粒子对细胞的荧光成像（(a)X.Michalet,F.F.Pinaud,L.A.Bentolila,J.M.Tsay,S.Doose,J.J.Li,G.Sundaresan,A.M.Wu,S.S.Gambhir,S.Weiss,Science2005,307,538;(b)Y.He,Y.Su,X.Yang,Z.Kang,T.Xu,R.Zhang,C.Fan,S.T.Lee,J.Am.Chem.Soc.2009,131,4434）；尺寸小于核孔的有机小分子对细胞的荧光成像（K.Y.Pu,K.Li,X.H.Zhang,B.Liu,Adv.Mater.2010,22,4186）；金纳米粒子在细胞成像及癌细胞监测（ACS Nano,2012,6,3318;ACS Nano,2012,6,7692）等。

鉴于细胞荧光成像在细胞定位，细胞靶向载药和肿瘤细胞光动力杀伤等领域的重要的意义，以及纳米粒子的独特结构与性质，所以设计合成具有荧光性质的纳米粒子是目前生物医药等领域的新热点。因此合成新型的具有荧光性质的有机分子及其纳米粒子在细胞的荧光成像领域有很高的科研价值和应用价值。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一类有机荧光染料分子。

本发明的目的之二在于提供一类有机荧光染料分子的合成方法。

本发明的目的之三在于提供一类有机荧光染料分子的应用。

本发明的有机荧光染料分子的结构如式（I）所示：

其中：Ar选自杂环基或含有取代基的杂环基；Me为甲基。

所述的杂环基是2-噻吩基。

所述的含有取代基的杂环基是5-二苯胺基-2-噻吩基(5-Ph₂N-2-thienyl.命名参考：Wakamiya,A.;Mori,K.;Yamaguchi,S.,Angew.Chem.Int.Ed.2007,46,4273–4276)。

所述的有机荧光染料分子所发射的荧光颜色为黄绿色或红色。

本发明的有机荧光染料分子的合成方法，包括以下步骤：

1）将原料2',3"-二溴-1,2,7,8-四氢-2",3'-二甲氧基-3,4:5,6-二苯并菲-9,10-二甲酸酐（2',3"–dibromo-1,2,7,8–tetrahydro-2",3'–dimethoxy-3,4:5,6–dibenzoPhenanthrene-9,10-dicarboxylic anhydride命名参考：Blair,H.S.;Crawford,M.;Spence,J.M.;Supanekar,V.R.,J.Chem.Soc.1960,3313-3318）与正十二烷基胺于有机溶剂中进行反应，得到内酰亚胺；

2）将步骤（1）得到的内酰亚胺与芳香硼酸、Na₂CO₃及催化剂四（三苯基膦）钯于有机溶剂中进行反应，且反应是在氩气保护下进行，得到如式（I）所示的有机荧光染料分子。

所述的2',3"-二溴-1,2,7,8-四氢-2",3'-二甲氧基-3,4:5,6-二苯并菲-9,10-二甲酸酐可参考文献Blair,H.S.;Crawford,M.;Spence,J.M.;Supanekar,V.R.,J.Chem.Soc.1960,3313-3318进行合成得到。

所述的2',3"-二溴-1,2,7,8-四氢-2",3'-二甲氧基-3,4:5,6-二苯并菲 -9,10-二甲酸酐与正十二烷基胺的摩尔比为1:1～1:5，优选摩尔比为1:2。

步骤1）所述的有机溶剂是N,N-二甲基甲酰胺(DMF)或甲苯，优选DMF。

步骤2）所述的有机溶剂中的四（三苯基膦）钯：内酰亚胺：芳香硼酸：Na₂CO₃的摩尔比为0.02～0.1：1：2～3：4，优选摩尔比为0.043：1：3：4。

步骤2）所述的有机溶剂是甲苯：乙醇：水的体积比为5～8：3～4：1～3的混合液。

步骤1）所述的反应的温度为90～110℃，优选为95～100℃；反应的时间为6～24小时，优选为12～20小时。

步骤2）所述的反应的温度为90～110℃，优选为95～100℃；反应的时间为6～20小时，优选为8～12小时。

所述的芳香硼酸是2-噻吩硼酸或5-二苯胺基-2-噻吩硼酸。

本发明的有机荧光染料分子在制备成纳米粒子后可用于活细胞的荧光染料，并在活细胞的细胞荧光成像中进行应用。

所述的有机荧光染料分子制备成纳米粒子的方法是：

将如式（I）所示的有机荧光染料分子的四氢呋喃溶液快速分散在水中得到反应液，然后向反应液中通入氩气进行缓慢鼓气，以除去反应液中的四氢呋喃，得到含有有机荧光染料分子的纳米粒子的溶液。过滤含有有机荧光染料分子的纳米粒子的溶液，可得到有机荧光染料分子的纳米粒子。

所述的将如式（I）所示的有机荧光染料分子的四氢呋喃溶液分散到水中，是将5mL浓度为25μM的所述的有机荧光染料分子的四氢呋喃溶液，在超声的条件下，快速分散到12mL的水中，继续超声3～8分钟，优选为5分钟。

所述的向反应液中通入氩气进行缓慢鼓气，以除去反应液中的四氢呋喃，是先向室温的反应液中通入氩气（一般通入氩气的时间为1小时左右）后，再将反应液加热到90～110℃（优选为90～95℃）并同时向反应液中继续通入氩气进行缓慢鼓气，将反应液缩为3～8mL，优选为5mL。

所述的用于活细胞的荧光染料，并在活细胞的荧光成像中进行应用，是将100μL浓度为25μM的含有有机荧光染料分子的纳米粒子的水溶液加入到900μL含有活细胞的培养基中，混匀后加入到培养皿中，然后放置在37℃的恒温培养箱中培养24小时；吸去培养皿中的液体，加入多聚甲醛的水溶液（质量浓度为4%）对活细胞进行固定，再用市售的细胞荧光染料Hoechst染固定后的细胞5分钟，然后用PBS缓冲液洗去多余的细胞荧光染料Hoechst；在培养皿中重新加入1mL的PBS缓冲液，然后用激光共聚焦显微镜对细胞进行荧光成像。

所述的活细胞为Hela细胞。

所述的有机荧光染料分子的纳米粒子的粒径为0<粒径≤90nm，优选粒径为89nm。

本发明的有机荧光染料分子及有机荧光染料分子的纳米粒子的合成方法简单、原料廉价、稳定性好，并可方便大量制备。同时由有机荧光染料分子制备的有机荧光染料分子的纳米粒子可以对活的肿瘤细胞（如活的Hela细胞）进行荧光染色，是一类很好的细胞荧光染料，在生物成像领域有重要的应用前景。另外，本发明的有机荧光染料分子的纳米粒子也具有光动力杀伤肿瘤细胞的作用。

附图说明

图1为实施例1制备的有机荧光染料分子的核磁氢谱。

图2为实施例1制备的有机荧光染料分子的核磁碳谱。

图3为实施例1制备的有机荧光染料分子的纳米粒子的DLs粒径分布图。

图4为实施例1激光共聚焦显微镜拍摄的有机荧光染料分子的纳米粒子用于细胞成像的照片；其中a为叠加图；b为Hoechst核染料染色图；c为纳米粒子染色图；d为明场细胞图。

图5为实施例2制备的有机荧光染料分子的核磁氢谱。

图6为实施例2制备的有机荧光染料分子的核磁碳谱。

图7为实施例2制备的有机荧光染料分子的纳米粒子的DLs粒径分布图。

图8为实施例2激光共聚焦显微镜拍摄的有机荧光染料分子的纳米粒子用于细胞成像的照片；其中a为叠加图；b为Hoechst核染料染色图；c为纳米粒子染色图；d为明场细胞图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。

实施例1

合成路线如下：

式中：Me为甲基。

1）在2500ml圆底烧瓶中加入57g原料（2',3"-二溴-1,2,7,8-四氢-2",3'-二甲氧基-3,4:5,6-二苯并菲-9,10-二甲酸酐）与59g正十二烷基胺，及加入100ml DMF，在温度为70℃下进行反应24小时，然后旋干反应液，用二氯甲烷洗涤，得到42.6g内酰亚胺产物，产率70%；

2）取740mg步骤1）得到的内酰亚胺产物，384mg的2-噻吩硼酸和424mg的Na₂CO₃加入到25ml的二口瓶中，在氩气保护下用注射器加入50ml的甲苯、30ml的乙醇和20ml水溶液，通氩气5分钟后加入催化剂四（三苯基膦）钯50mg，在氩气保护下进行加热反应，加热温度为90～110℃，反应12小时，反应完成后取有机层并用MgSO₄干燥，过滤，旋干，经柱色谱(以体积比为1：3的乙酸乙酯和石油醚为淋洗剂，硅胶(200～300目))分离得到式（II）所示的2-噻吩基取代的有机荧光染料分子699mg，产率83%。

式（II）所示的2-噻吩基取代的有机荧光染料分子的结构检测结果如下：

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ7.61(s,2H),7.56–7.55(m,2H),7.35–7.33(m,2H),7.11–7.08(m,2H),6.86(s,2H),4.19–4.13(m,2H),3.70–3.65(m,2H),3.40(s,6H),3.00–2.81(m,4H),2.61–2.49(m,2H),1.74–1.63(m,2H),1.33–1.26(m,18H),0.87(t,J=6.6Hz,3H).

MALDI-TOF MS:m/z743.3[M]⁺。

式（II）所示的2-噻吩基取代的有机荧光染料分子的核磁氢谱如图1所示，核磁碳谱如图2所示。

由上述检测结果可知，该2-噻吩基取代的有机荧光染料分子的结构正确。

3）取125μL的浓度为1mM的上述2-噻吩基取代的有机荧光染料分子的四氢呋喃溶液，用四氢呋喃进行稀释，得到5mL浓度为25μM的所述的2-噻吩基取代的有机荧光染料分子的四氢呋喃溶液，在超声的条件下，将5mL所述的2-噻吩基取代的有机荧光染料分子的四氢呋喃溶液快速分散到装载有12mL水的单口瓶中，超声5分钟后得到反应液；向室温的反应液中通入氩气进行缓慢鼓气1小时后，再将反应液加热到90℃并同时向反应液中继续通入氩气进行缓慢鼓气，将反应液浓缩为5mL，以除去反应液中的四氢呋喃，得到含有2-噻吩基取代的有机荧光染料分子的纳米粒子的水溶液。

对所得含有2-噻吩基取代的有机荧光染料分子的纳米粒子的水溶液中的2-噻吩基取代的有机荧光染料分子的纳米粒子的表征结果如下：

通过动态光散射实验显示2-噻吩基取代的有机荧光染料分子的纳米粒子的平均粒径大小为54nm，DLs粒径分布图如图3所示。

4）将100μL浓度为25μM的含有2-噻吩基取代的有机荧光染料分子的纳米粒子的水溶液加入到900μL含有Hela细胞的培养基中，混匀后加入到培养皿中，然后放置在37℃的恒温培养箱中培养24小时；吸去培养皿中的液体，加入多聚甲醛的水溶液（质量浓度为4%）对Hela细胞进行固定，再用市售的细胞荧光染料Hoechst染固定后的Hela细胞5分钟，然后用PBS缓冲液洗去多余的细胞荧光染料Hoechst；在培养皿中重新加入1mL的PBS缓冲液，然后用激光共聚焦显微镜对细胞进行荧光成像。

成像结果显示2-噻吩基取代的有机荧光染料分子的纳米粒子对Hela细胞的细胞进行了染色，呈现为黄绿色，荧光成像照片见图4；其中a为叠加图；b为Hoechst核染料染色图；c为纳米粒子染色图；d为明场细胞图。

实施例2

合成路线如下：

式中：Me为甲基。

1）在2500ml圆底烧瓶中加入57g原料（2',3"-二溴-1,2,7,8-四氢-2",3' -二甲氧基-3,4:5,6-二苯并菲-9,10-二甲酸酐）与59g正十二烷基胺，及加入100ml DMF，在温度为70℃下进行反应24小时，然后旋干反应液，用二氯甲烷洗涤，得到42.6g内酰亚胺产物，产率70%；

2）取740mg步骤1）得到的内酰亚胺产物，1130mg的5-二苯胺基-2-噻吩硼酸和424mg的Na₂CO₃加入到25ml的二口瓶中，在氩气保护下用注射器加入5ml的甲苯、3ml的乙醇和2ml水溶液，通氩气5分钟后加入催化剂四（三苯基膦）钯50mg，在氩气保护下进行回流反应12小时，反应完成后取有机层并用MgSO₄干燥，过滤，旋干，经柱色谱(以体积比为1：3的乙酸乙酯和石油醚为淋洗剂，硅胶(200～300目))分离得到式（III）所示的5-二苯胺基-2-噻吩基取代的有机荧光染料分子918mg，产率80%。

式（III）所示的5-二苯胺基-2-噻吩基取代的有机荧光染料分子的结构检测结果如下：

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ7.68–7.60(m,12H),7.48–7.43(m,4H),7.39–7.33(m,4H),6.90(s,2H),4.21–4.16(m,2H),3.76–3.63(m,2H),3.38(s,6H),2.95–2.86(m,4H),2.66–2.54(m,2H),1.74–1.66(m,2H),1.35–1.26(m,18H),0.88(t,J=6.6Hz,3H).

MALDI-TOF MS:1078(M⁺)。

由上述检测结果可知，该化合物结构正确。

式（III）所示的5-二苯胺基-2-噻吩基取代的有机荧光染料分子的核磁氢谱如图5所示，核磁碳谱如图6所示。

由上述检测结果可知，该5-二苯胺基-2-噻吩基取代的有机荧光染料分子的结构正确。

3）取125μL的浓度为1mM的上述5-二苯胺基-2-噻吩基取代的有机荧光染料分子的四氢呋喃溶液，用四氢呋喃进行稀释，得到5mL浓度为25μM的所述的5-二苯胺基-2-噻吩基取代的有机荧光染料分子的四氢呋喃溶液，在超声的条件下，将5mL所述的5-二苯胺基-2-噻吩基取代的有机荧光染料分子的四氢呋喃溶液快速分散到装载有12mL水的单口瓶中，超声5分钟后得到反应液；向室温的反应液中通入氩气进行缓慢鼓气1小时后，再将反应液加热到90℃并同时向反应液中继续通入氩气进行缓慢鼓气，将反应液浓缩为5mL，以除去反应液中的四氢呋喃，得到含有5-二苯胺基-2-噻吩基取代的有机荧光染料分子的纳米粒子的水溶液。

对所得含有5-二苯胺基-2-噻吩基取代的有机荧光染料分子的纳米粒子的水溶液中的5-二苯胺基-2-噻吩基取代的有机荧光染料分子的纳米粒子的表征结果如下：

通过动态光散射实验显示5-二苯胺基-2-噻吩基取代的有机荧光染料分子的纳米粒子的平均粒径大小为86nm，DLs粒径分布图如图7所示。

4）将100μL浓度为25μM的含有5-二苯胺基-2-噻吩基取代的有机荧光染料分子的纳米粒子的水溶液加入到900μL含有Hela细胞的培养基中，混匀后加入到培养皿中，然后放置在37℃的恒温培养箱中培养24小时；吸去培养皿中的液体，加入多聚甲醛的水溶液（质量浓度为4%）对Hela细胞进行固定，再用市售的细胞荧光染料Hoechst染固定后的Hela细胞5分钟，然后用PBS缓冲液洗去多余的细胞荧光染料Hoechst；在培养皿中重新加入1mL的PBS缓冲液，然后用激光共聚焦显微镜对细胞进行荧光成像。

成像结果显示5-二苯胺基-2-噻吩基取代的有机荧光染料分子的纳米粒子对Hela细胞进行了染色，呈现为红色，荧光成像照片见8；其中a为叠加图；b为Hoechst核染料染色图；c为纳米粒子染色图；d为明场细胞图。

实施例3

对实施例1的含有2-噻吩基取代的有机荧光染料分子的纳米粒子的水溶液，及实施例2的含有5-二苯胺基-2-噻吩基取代的有机荧光染料分子的纳米粒子的水溶液进行紫外-可见吸收光谱和荧光光谱测定，光学性质数据如表1所示。

表1.

注：量子产率为水溶液中的绝对量子产率。

Claims

1.一种有机荧光染料分子，其特征是，所述的有机荧光染料分子的结构如式(I)所示：

其中：Ar选自5-二苯胺基-2-噻吩基；Me为甲基。

2.一种权利要求1所述的有机荧光染料分子的合成方法，其特征是，所述的合成方法包括以下步骤：

1)将原料2',3"-二溴-1,2,7,8-四氢-2",3'-二甲氧基-3,4:5,6-二苯并菲-9,10-二甲酸酐与正十二烷基胺于有机溶剂中进行反应，得到内酰亚胺；

2)将步骤1)得到的内酰亚胺与芳香硼酸、Na₂CO₃及催化剂四(三苯基膦)钯于甲苯：乙醇：水的体积比为5～8：3～4：1～3的混合液中进行反应，且反应是在氩气保护下进行，得到式(I)所示的有机荧光染料分子；所述的芳香硼酸是5-二苯胺基-2-噻吩硼酸；

式中：Ar选自5-二苯胺基-2-噻吩基；Me为甲基。

3.根据权利要求2所述的合成方法，其特征是：步骤1)中的2',3"-二溴-1,2,7,8-四氢-2",3'-二甲氧基-3,4:5,6-二苯并菲-9,10-二甲酸酐与正十二烷基胺的摩尔比为1:1～1:5；

步骤2)中的四(三苯基膦)钯：内酰亚胺：芳香硼酸：Na₂CO₃的摩尔比为0.02～0.1：1：2～3：4。

4.根据权利要求2所述的合成方法，其特征是：步骤1)所述的有机溶剂是N,N-二甲基甲酰胺或甲苯。

5.根据权利要求2所述的合成方法，其特征是：步骤1)所述的反应的温度为90～110℃；步骤2)所述的反应的温度为90～110℃。

6.根据权利要求2或5所述的合成方法，其特征是：步骤1)所述的反应的时间为6～24小时；步骤2)所述的反应的时间为6～20小时。

7.一种权利要求1所述的有机荧光染料分子的应用，其特征是：所述的有机荧光染料分子在制备成纳米粒子后用于体外活细胞的细胞荧光成像中的荧光染料进行应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征是：所述的活细胞为Hela细胞。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征是：所述的有机荧光染料分子制备成纳米粒子的方法是：

将所述的有机荧光染料分子的四氢呋喃溶液分散在水中得到反应液，然后向反应液中通入氩气进行鼓气，以除去反应液中的四氢呋喃，得到含有有机荧光染料分子的纳米粒子的溶液；过滤含有有机荧光染料分子的纳米粒子的溶液，得到有机荧光染料分子的纳米粒子。

10.根据权利要求7或9所述的应用，其特征是：所述的有机荧光染料分子的纳米粒子的粒径为0<粒径≤90nm。