CN103030989B - 一类水溶性吲哚方酸菁多功能细胞荧光染料的合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一类水溶性吲哚方酸菁多功能细胞荧光染料的合成方法。该类染料通过多步化学合成，最终使吲哚方酸菁含有带阳离子型的胺类官能团，提高了方酸菁的水溶性和生物相容性。该类荧光分子能与细胞核内的DNA或细胞膜中的磷脂分子相互作用，从而特异性标记活细胞的细胞膜和固定/死细胞的细胞核。结合这两种细胞标记特性，该类荧光染料成功地标记出活体组织中正在发生凋亡的细胞的细胞核。本方法合成工艺成熟、操作简单，产品具有安全无毒、分子可设计性强、水溶性优异、光稳定性好、pH敏感等优点，可作为多功能细胞荧光标记分子，应用于生物医药领域的科学研究、诊断和生产。
Description
技术领域
本发明属于有机染料合成及生物细胞标记领域，特别涉及一种结构可设计的阳离子型胺基功能化的方酸菁的合成方法。
背景技术
菁染料是一类比较特殊的染料，与传统染料不同，它不能用于织物的染色，因为它在光照下不稳定。事实上，在最初的研究阶段，菁染料在很长时间内，都是作为一种感光材料，用作卤化银凝胶的增感剂。至今它在感光材料领域的应用仍然占据着重要地位，特别是近年来它作为新型光存储介质在有机型存储光盘中得到广泛应用。例如在CD—ROM光盘感光层材料中，菁染料是目前最常用三种染料之一。
为了满足日新月异的生物分析应用对荧光染料的需求，研究开发出更多的具有良好荧光光谱性能的新型荧光染料，仍然是荧光分析技术发展的关键和核心。目前使用比较多的罗丹明类、荧光素类、BODIPY类和菁类等荧光染料，其中有些品种已经商品化。但这些商品化的染料大部分光谱都处在紫外可见区，而生物样品自身在这个区域有很强的吸收，荧光检测时会显现出一定强度的自发荧光，造成强的荧光背景，从而极大地降低了检测的灵敏度。近红外荧光染料由于能避开这个问题近年来受到了广泛的重视。
吲哚菁染料是菁染料中光稳定性比较突出的一类，吲哚方酸菁染料又是吲哚菁染料到目前为止光稳定性最好的一类。并且吲哚方酸菁染料在近红外区有着强烈而狭窄的吸收和发射光谱，这些特点使得它在光电领域成为研究的热点。但是，吲哚方酸菁染料易于聚集，水溶性较差等缺点限制了其在生物上的广泛应用。因此，迫切需求发明新型的可以进行细胞特异性荧光标记的吲哚方酸菁染料，并将其应用于生物医药的科研、诊断等领域。
发明内容
本发明的目的在于提供一类光稳定性好、水溶性好、pH敏感性、结构可设计性的胺基功能化吲哚方酸菁染料，具有细胞标记的多功能性。该方法首先通过成熟的合成方法制备具有羧基官能团修饰的吲哚方酸菁染料，然后通过羧基与胺基的缩合反应引入带有不同胺基官能团的结构，最终得到不同胺基官能团修饰的吲哚方酸菁染料。带有不同胺基官能团的吲哚方酸菁染料与活体或者固定/死细胞组织一同培养，应用于固定/死细胞的细胞核或者活体细胞的细胞膜的特异性生物标记，以及鉴定活体组织中正在发生凋亡的细胞。
一类水溶性吲哚方酸菁多功能细胞荧光染料的合成方法，其特征在于，其具体制备步骤为：
1）将苯肼盐酸盐类化合物和3-甲基-2-丁酮加入反应瓶中，摩尔比在1:0.1-1:6之间，并加入溶剂冰醋酸，使得溶液的浓度在10-2-10 mol/L；溶液在氮气气氛下加热至回流温度，反应3-24小时，得到3H-吲哚啉产物；
2）将3H-吲哚啉和含羧酸的烷基化试剂加入反应瓶中，摩尔比在1:0.1-1:6之间，并加入溶剂乙腈或邻氯苯或甲苯，使得溶液的浓度在10-2-10 mol/L；溶液在氮气气氛下加热至回流温度，反应6-48小时，得到季铵化的吲哚啉衍生物；
3）将季铵化的吲哚啉衍生物和方酸加入反应瓶，其摩尔比在1:0.1-1:3之间，并加入溶剂体积比为正丁醇:甲苯:吡啶=1:1:1的溶剂，使得溶液的浓度在10-2-10 mol/L；溶液在氮气气氛下回流反应3-72小时，得到羧基功能化的吲哚方酸菁；
4）将羧基功能化的吲哚方酸菁、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)和二异丙基乙胺(DIPEA)加入反应瓶，其摩尔比在1:2:2-1:10:40之间，并加入N-二甲基甲酰胺（DMF）或三氯甲烷，使得溶液的浓度在10-2-10 mol/L；溶液在氮气气氛下室温搅拌5-60 min，然后加入带有伯胺基的反应试剂；该反应试剂与方酸菁的摩尔比在1:1-1:30之间，反应0.5-12小时得到胺基功能化的吲哚方酸菁染料。
当胺基功能化的吲哚方酸菁染料为将叔丁酯Boc保护的伯胺基功能化的吲哚方酸菁染料，还需要进行以下步骤：
将叔丁酯Boc保护的伯胺基功能化的吲哚方酸菁染料加入反应瓶，并加入溶剂二氯甲烷或氯仿，使得溶液的溶度在10-2-10 mol/L；然后往溶液中加入三氟乙酸，其与溶剂的体积比为1:1；在氮气气氛下室温搅拌2-8小时，得到伯胺基功能化的吲哚方酸菁染料。
所述合成方法合成的染料的应用，其特征在于：
将胺基功能化的吲哚方酸菁染料稀释到缓冲液中，放入活体或者固定/死细胞组织中培养一段时间后，该类荧光分子和细胞核里的DNA或细胞膜里的磷脂分子极性头部相互作用，从而能够特异性标记活体细胞的细胞膜和固定/死细胞的细胞核；结合这两种细胞标记特性，该类荧光染料成功地标记出活体组织中正在发生细胞凋亡的细胞核。这种标记后的细胞组织可以制备成玻片样本在荧光显微镜和激光共聚焦显微镜下拍照分析后，长期冷冻保存。
步骤4)中所述的胺基功能化的吲哚方酸菁染料的结构式为：
其中，
本发明提供的设计合成的吲哚方酸菁染料，具有光稳定性好、水溶性好、pH敏感性、结构可设计性、阳离子性、细胞多功能标记等优点。本发明将阳离子型的胺基官能团成功地引入到吲哚方酸菁体系内，极大的提高了其水溶性，并且与方酸菁的光稳定性和pH敏感性结合，得到了一种多功能的新型吲哚方酸菁染料。果蝇及小鼠细胞毒性实验表明这种新型的吲哚方酸菁染料安全无毒，同时对细胞内亚细胞器的标记呈现出特异性好、荧光强、标记步骤简单、易于荧光成像、可与转基因遗传学标记和抗体免疫荧光标记的效果媲美等优点，使其在生物医药的科研、诊断、生产领域具有广阔的应用前景。
附图说明
图1 实施例1中产物的核磁氢谱表征。
图2 实施例1中产物的核磁碳谱表征。
图3 实施例1中产物的质谱表征。
图4 实施例1中产物的光学性能表征；（a）产物的紫外和荧光光谱，（b）产物在酸性条件下的荧光光谱
图5 实施例3中该类荧光染料的细胞毒性和细胞膜特异性标记表征。（a）该类荧光染料（红色）的细胞膜标记荧光显微镜照片。（b）该类荧光染料的细胞毒性实验。不同浓度处理下，细胞存活率都很高，说明该染料具有很低的细胞毒性。（c）表达细胞膜绿色荧光蛋白（GFP，绿色）的转基因果蝇唾液腺的激光共聚焦照片。（d）该类荧光染料（红色）特异性标记果蝇唾液腺细胞膜的激光共聚焦照片。（e）c和d图的双通道叠加照片。箭头指示细胞膜。*指示细胞核，该细胞在白色插入框中被放大，以显示细胞内复杂的膜结构。这些证据说明了该类荧光染料对活体细胞的细胞膜染色可与转基因遗传学标记物的效果相媲美。
图6 实施例4中该类荧光染料特异性标记经过福尔马林固定的细胞组织的细胞核共聚焦显微镜照片。（a）染料（红色）特异性标记果蝇唾液腺细胞核照片。（b）商业染料DAPI（蓝色）特异性标记果蝇唾液腺细胞核照片。（c）a和b图的双通道叠加照片。箭头指示细胞核。（d）染料（红色）特异性标记果蝇幼虫翅芽细胞核的照片。（e）商业染料（蓝色）特异性标记果蝇幼虫翅芽细胞核照片。（f）d和e图的双通道叠加照片。这些证据说明了该类荧光染料对固定组织的细胞核染色可与商业荧光标记物的效果相媲美。
图7 实施例5中该类荧光染料的活体组织中凋亡细胞特异性标记激光共聚焦显微镜照片。（a）转基因果蝇幼虫翅芽活体组织中正在发生细胞凋亡（共表达细胞核GFP和引起细胞凋亡的hepCA基因，绿色）的照片。（b）该类荧光染料（红色）特异性标记a图中凋亡细胞的照片。白色小框部位被放大后，置于右下角，相对于凋亡细胞的明亮的核染色，活细胞显示较弱的膜染色。（c）凋亡细胞的Caspase-3抗体免疫荧光染色（蓝色）照片。（d）a和b和c图的三通道叠加照片。这些证据说明了该类荧光染料对活体组织中正在发生凋亡的细胞的特异性标记可与转基因遗传学标记物和抗体免疫荧光染色的效果相媲美。
具体实施方式
下面结合具体的实施例，对本发明做进一步阐述。本发明不限于这些具体的实施例。
产物结构的表征使用：核磁1H 和 13C谱 （Bruker 400），质谱（XEVO-G2QTOF (ESI) (Waters, USA)）。
产物光学性能表征使用：紫外可见光谱 (Cintra 20, GBC, Australia)，荧光光谱 (Horiba Jobin Yvon FluoroMax-4 NIR, NJ, USA)。
产物的生物实验表征使用：荧光显微镜 （AMG EVOS f1 microscope），荧光共聚焦显微镜 （Leica TCS SP2 AOBS confocalmicroscope）。
实施实例1：伯胺基功能化的吲哚方酸菁染料的有机合成。
1）将对羧基苯肼盐酸盐（5.66 g, 30 mmol）和3-甲基-2-丁酮（9.6 mL, 90 mmol）（摩尔比在1:3）加入反应瓶中，并加入溶剂冰醋酸20 ml。溶液在氮气气氛下加热至回流温度，反应12小时，得到3H-吲哚啉产物。
2）将3H-吲哚啉（0.82 g, 4 mmol）和对羧基苄溴（0.86 g, 4mmol）（摩尔比在1:1）加入反应瓶中，并加入溶剂乙腈10 ml。溶液在氮气气氛下加热至回流温度，反应24小时，得到季铵化的吲哚啉衍生物。
3）将吲哚啉衍生物（836 mg, 2 mmol）和方酸（114 mg, 1 mmol）（摩尔比在1:0.5）加入反应瓶，并加入溶剂12 ml（正丁醇:甲苯:吡啶=1:1:1），在氮气气氛下回流反应24小时，得到羧基功能化的吲哚方酸菁。
4）将羧基功能化的方酸菁（301.2 mg, 0.4 mmol）、HATU（1.52g, 4 mmol）和DIPEA（1.32 mL, 8 mmol）（摩尔比在1:10:20）加入反应瓶，并加入溶剂DMF 10 ml，在氮气气氛下室温搅拌10分钟，然后加入单端Boc保护的乙二胺（512.6 mg, 3.2 mmol）反应2小时得到Boc胺基保护功能化的吲哚方酸菁染料。
5）将Boc胺基保护功能化的吲哚方酸菁染料（264 mg, 0.2 mmol）加入反应瓶，并加入溶剂二氯甲烷 3 ml和三氟乙酸 3 ml。溶液在氮气气氛下室温搅拌2小时，得到胺基功能化的吲哚方酸菁染料。其结构式如下：
实施实例2：叔胺基功能化的吲哚方酸菁染料的有机合成。
1）实施步骤1-3与实施实例1相同。
4）将羧基功能化的方酸菁（301.2 mg, 0.4 mmol）、HATU（1.52g, 4 mmol）和DIPEA（1.32 mL, 8 mmol）（摩尔比在1:10:20）加入反应瓶，并加入溶剂DMF 10 ml，在氮气气氛下室温搅拌10分钟，然后加入N, N’-二甲基乙二胺（282 mg, 3.2 mmol）反应0.5小时得到叔胺基功能化的吲哚方酸菁染料。其结构式如下所示：
实施实例3：该类染料对活体组织细胞的细胞膜特异性标记。
将该类染料与果蝇的活细胞和转基因果蝇的唾液腺组织一起培养1小时，染料能够对细胞的细胞膜进行特异性标记，并且与表达绿色荧光蛋白的细胞膜能够很好的重合。
实施实例4：该类染料对固定组织细胞的细胞核特异性标记。
将该类染料与果蝇固定细胞组织一起培养1小时，染料能够对细胞核进行特异性的标记，并且与商业化染料DAPI标记完全一致。
实施实例5：该类染料对凋亡细胞的细胞核特异性标记。
将该类染料与转基因诱导细胞凋亡的果蝇活体组织一起培养1小时，染料能够对正在发生凋亡的细胞的细胞核进行特异性的标记，并且与转基因遗传学标记物以及抗体免疫荧光标记一致。
Claims (3)
1.一类水溶性吲哚方酸菁多功能细胞荧光染料的合成方法，其特征在于，其具体制备步骤为：
1）将苯肼盐酸盐类化合物和3-甲基-2-丁酮加入反应瓶中，摩尔比在1:0.1-1:6之间，并加入溶剂冰醋酸，使得溶液的浓度在10-2-10mol/L；溶液在氮气气氛下加热至回流温度，反应3-24小时，得到3H-吲哚啉产物；
2）将3H-吲哚啉和含羧酸的烷基化试剂加入反应瓶中，摩尔比在1:0.1-1:6之间，并加入溶剂乙腈或邻氯苯或甲苯，使得溶液的浓度在10-2-10mol/L；溶液在氮气气氛下加热至回流温度，反应6-48小时，得到季铵化的吲哚啉衍生物；
3）将季铵化的吲哚啉衍生物和方酸加入反应瓶，其摩尔比在1:0.1-1:3之间，并加入溶剂体积比为正丁醇:甲苯:吡啶=1:1:1的溶剂，使得溶液的浓度在10-2-10mol/L；溶液在氮气气氛下回流反应3-72小时，得到羧基功能化的吲哚方酸菁；
4）将羧基功能化的吲哚方酸菁、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)和二异丙基乙胺(DIPEA)加入反应瓶，其摩尔比在1:2:2-1:10:40之间，并加入N-二甲基甲酰胺（DMF）或三氯甲烷，使得溶液的浓度在10-2-10mol/L；溶液在氮气气氛下室温搅拌5-60min，然后加入带有伯胺基的反应试剂；该反应试剂与方酸菁的摩尔比在1:1-1:30之间，反应0.5-12小时得到胺基功能化的吲哚方酸菁染料；
所述的带有伯胺基的反应试剂为N,N’-二甲基乙二胺或乙二胺；含羧酸的烷基化试剂为对羧基苄溴。
2.根据权利要求1所述的一类水溶性吲哚方酸菁多功能细胞荧光染料的合成方法，其特征在于：
当胺基功能化的吲哚方酸菁染料为将叔丁酯Boc保护的伯胺基功能化的吲哚方酸菁染料，还需要进行以下步骤：
将叔丁酯Boc保护的伯胺基功能化的吲哚方酸菁染料加入反应瓶，并加入溶剂二氯甲烷或氯仿，使得溶液的溶度在10-2-10mol/L；然后往溶液中加入三氟乙酸，其与溶剂的体积比为1:1；在氮气气氛下室温搅拌2-8小时，得到伯胺基功能化的吲哚方酸菁染料。
3.根据权利要求1或2所述合成方法合成的染料的应用，其特征在于：
将胺基功能化的吲哚方酸菁染料稀释到缓冲液中，放入活体或者固定/死细胞组织中培养一段时间后，该类荧光分子和细胞核里的DNA或细胞膜里的磷脂分子极性头部相互作用，从而能够特异性标记活体细胞的细胞膜和固定/死细胞的细胞核；结合这两种细胞标记特性，该类荧光染料成功地标记出活体组织中正在发生细胞凋亡的细胞核；这种标记后的细胞组织可以制备成玻片样本在荧光显微镜和激光共聚焦显微镜下拍照分析后，长期冷冻保存。
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|---|---|---|---|---|
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| CN111100636B (zh) * | 2019-12-25 | 2022-06-24 | 太原师范学院 | 苯乙烯类菁染料功能化碳点传感器及其制备方法及应用 |
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Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0172321A2 (en) * | 1984-07-27 | 1986-02-26 | International Business Machines Corporation | Squarylium charge generating dye and electrophotographic photoconductor |
| JP2003007359A (ja) * | 2001-06-20 | 2003-01-10 | Mitsubishi Paper Mills Ltd | 光電変換素子 |
| WO2004028449A2 (en) * | 2002-09-24 | 2004-04-08 | The General Hospital Corporation | Azulene dimer-quenched, near-infrared fluorescent probes |
| CN1939978A (zh) * | 2005-09-28 | 2007-04-04 | 华东理工大学 | 水溶性荧光菁染料 |
| CN101328319A (zh) * | 2008-07-02 | 2008-12-24 | 燕山大学 | 水溶性桥环多甲川3h-吲哚菁染料超声波合成方法 |
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| CN102356509A (zh) * | 2009-03-12 | 2012-02-15 | 新日铁化学株式会社 | 色素敏化太阳能电池、光电转换元件及其中使用的色素 |
Family Cites Families (1)
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|---|---|---|---|---|
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Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0172321A2 (en) * | 1984-07-27 | 1986-02-26 | International Business Machines Corporation | Squarylium charge generating dye and electrophotographic photoconductor |
| JP2003007359A (ja) * | 2001-06-20 | 2003-01-10 | Mitsubishi Paper Mills Ltd | 光電変換素子 |
| WO2004028449A2 (en) * | 2002-09-24 | 2004-04-08 | The General Hospital Corporation | Azulene dimer-quenched, near-infrared fluorescent probes |
| CN1939978A (zh) * | 2005-09-28 | 2007-04-04 | 华东理工大学 | 水溶性荧光菁染料 |
| CN101328319A (zh) * | 2008-07-02 | 2008-12-24 | 燕山大学 | 水溶性桥环多甲川3h-吲哚菁染料超声波合成方法 |
| CN102356509A (zh) * | 2009-03-12 | 2012-02-15 | 新日铁化学株式会社 | 色素敏化太阳能电池、光电转换元件及其中使用的色素 |
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Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| 宋波等.新型水溶性荧光标示剂吲哚方酸菁染料的合成及光谱性能.《高等学校化学学报》.2008,第29卷(第05期),932-935. |
| 新型水溶性荧光标示剂吲哚方酸菁染料的合成及光谱性能;宋波等;《高等学校化学学报》;20080510;第29卷(第05期);932-935 * |
| 方酸菁染料的结构效应对光物理性质的影响;林童等;《化学物理学报》;19971027;第10卷(第05期);436-439 * |
| 林童等.方酸菁染料的结构效应对光物理性质的影响.《化学物理学报》.1997,第10卷(第05期),436-439. |
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