CN110467621B - 一种次氯酸离子小分子荧光探针及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种次氯酸离子小分子荧光探针及其制备方法与应用，三苯胺肟和螺吡喃醛结构通过氮氮键连接的母体结构，具有很强共轭π电子，其中螺吡喃环容易开环，结构中螺吡喃环开环后能发射很强的荧光，可以实现荧光技术精确检测次氯酸，并且可以检测活细胞、细菌和斑马鱼体内的内源性的次氯酸，因此在次氯酸检测方面具有良好的应用前景，同时，本发明的合成方法简单、操作方便，不需要苛刻的条件。
Description
技术领域
本发明涉及荧光成像分子探针领域，尤其是涉及一种利用荧光成像技术检测ClO-离子的探针，具体涉及一种次氯酸离子分子探针及制备方法和应用。
背景技术
次氯酸是一种不稳定的弱酸，常用于消毒剂和漂白剂的主要成分。而且，在生物体内具有重要的生理功能，如免疫系统中可以充当抗菌抗病毒等重要功能。此外，次氯酸在维持生物体内环境中起着重要角色，如平衡体内氧化还原过程。但是，次氯酸在生物体内的量一旦超过机体所需的正常范围，便会对机体内环境造成一定损害，例如，过量的次氯酸也可能对一下磷脂，蛋白以及核酸物质产生严重损伤。因此，开发高灵敏度和高选择性的小分子探针来检测次氯酸仍然是一个艰巨的挑战。
目前，用于检测次氯酸的方法很多，例如比色法，电位分析法，化学发光发以及库仑滴定发等。但是，基于荧光探针的次氯酸检测技术正在成为一种重要研究方法。近几年报道了很多小分子探针对次氯酸选择性识别，尽管如此多的次氯酸识别探针被报道，但是目前对于荧光和可视化双功能识别的探针报道甚少，而且该类探针对次氯酸识别能力和选择性都不是很理想，鉴于此，本研究发明一种高选择性和高灵敏度的双功能次氯酸识别荧光探针。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种高选择性和高灵敏度的次氯酸识别荧光探针。
为实现上述目的，本发明提供一种次氯酸离子小分子荧光探针，所述分子探针分子式为C43H42N4O，其结构式为：
本发明还提供上述小分子荧光探针的制备方法：将分子式为C19H17N3的三苯胺肟和分子式为C24H27NO2的螺吡喃醛溶解在乙醇溶液中，并在室温下搅拌反应4-24h，反应得到黄色固体并用乙醇洗涤干燥得到目标产物；
所述三苯胺肟的结构式为
所述螺吡喃醛的结构式为
进一步的，原料的摩尔比为：
1～2份三苯胺肟；
1～2份螺吡喃醛。
本发明还提供上述小分子荧光探针在制备检测、识别环境中或生物样品中次氯酸检查试剂盒中的应用。
作为本发明的一种应用范围，所述小分子荧光探针在制备利用荧光成像检测正常细胞和癌细胞中外源性的ClO-离子的试剂盒中应用。
作为本发明的一种应用范围，所述小分子荧光探针在制备细胞体外ClO-离子检测试剂盒中的应用。
作为本发明上述应用的检测方式，通过紫外分光光度法，在200nm～650nm的波长范围内测定含有ClO-的样品溶液的吸光度；在最大吸收波长530nm下识别环境中或生物样品中ClO-离子。
作为本发明的一种应用方式，通过荧光分光光度法，以408nm为激发波长，在400nm到700nm的波长范围内测定含有CIO-离子样品溶液的荧光强度；在最大发射波长605nm下识别环境中或生物样品中的ClO-离子。
本发明具有如下优点：通过本发明所述制备方法合成小分子探针，以三苯胺肟和螺吡喃醛为基础，使用紫外和荧光光谱法检测次氯酸。三苯胺肟和螺吡喃醛通过氮氮键连接的母体结构，具有很强共轭π电子，三苯胺和螺吡喃醛通过氮氮键连接的母体结构中螺吡喃环容易开环，结构中螺吡喃环开环后能发射很强的荧光。小分子探针在次氯酸的存在下结构中螺吡喃环发生开环，使得其荧光从无到有，紫外吸收峰红移。可以实现荧光技术精确检测次氯酸，并且可以检测活细胞、细菌和斑马鱼体内的内源性的次氯酸。因此在次氯酸检测方面具有良好的应用前景。同时，本发明的合成方法简单、操作方便，不需要苛刻的条件。
附图说明
图1为实施例1中合成小分子探针的路线；
图2为实施例1中合成小分子探针的核磁氢谱；
图3为实施例1中合成小分子探针的质谱；
图4为实施例1中合成小分子探针对次氯酸识别的激发态分子内质子转移(ESIPT)机制；
图5为实施例2中小分子探针对次氯酸识别的紫外和荧光光谱；
图6为实施例4中验证小分子探针对次氯酸识别的密度泛函理论计算；
图7为实施例5中小分子探针在人胚肺细胞(MRC-5)中检测内源性次氯酸的生物成像；
图8为实施例6中小分子探针在大肠杆菌(E.coli)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)中检测内源性次氯酸的生物成像；
图9为实施例7中小分子探针在斑马鱼体内检测内源性次氯酸的生物成像；
图10(a)SPTPA(2.0μM)对各种物质(3.0eq.)以及ClO-在DMSO/H2O溶液体系中的发射光谱；(b)SPTPA添加分析物在605nm处的荧光强度变化，包括F-，Cl-，NO2 -，ClO4 -，HCO3 -，H2PO4 -，SO4 2-，S2O3 2-，CO3 -，H2O2和ClO-。
图11(a)用ClO-(3.0eq.)处理之前和之后SPTPA的时间依赖性荧光；(b)pH对SPTPA(2.0μM)的影响及其对ClO-的识别能力。数据表示在605nm处的荧光强度，并且在25℃下添加ClO-后3min获得光谱，条件：λex＝400nm，λem＝605nm。
具体实施方式
下面将结合实施例和效果例对本发明做进一步的详述，而非限制本发明的范围。
实施例1合成小分子探针
将三苯胺肟(0.238g，0.83mmol)和螺吡喃醛(0.300g，0.83mmol)溶解在30mL乙醇溶液中，其中三苯胺肟以及螺吡喃醛由安耐吉化学定制，结构式如图1中所示，并在室温下搅拌16小时，得到淡黄色沉淀；将上述淡黄色沉淀过滤，用乙醇反复洗涤，干燥得到黄色固体粉末0.183g，简写记为SPTPA，产率为35％，通过核磁和质谱可以确定该产物即为目标小分子探针。合成小分子探针的路线为图1，图1表示合成小分子荧光探针的路线图，其中EtOH为乙醇，RT为室温。
核磁表征为图2，质谱表征为图3以及小分子荧光探针对次氯酸识别机制模型图为图4。
探针质谱：
HR-MS(ESI)m/z[M+1]+：Calcd for C43H43N4O，631.3431，found，631.3425.
探针核磁氢谱：
1H NMR(600MHz，DMSO-d6)δin ppm：8.80(s，1H)，8.49(s，1H)，7.75(s，1H)，7.62-7.47(m，2H)，7.20(br s，6H)，7.11-6.87(m，10H)，6.76(br s，3H)，2.33(s，3H)，1.12(s，9H)，1.10(s，3H)，1.04(s，3H)；
实施例2小分子探针对次氯酸识别的紫外和荧光光谱
制备1mL小分子探针(10μM和2.0μM)的DMSO/H2O(v/v＝5∶1)溶液。同浓度的ClO-溶液滴加到探针溶液中，
如图5(a)所示，在探针溶液中加入ClO-后，在298nm和408nm处的吸收带逐渐减少，350nm～600nm处有一个新的吸收峰，并在530nm处出现最大吸收峰，其吸光强度随ClO-浓度增加并逐渐增加，最终两者化学计量比为1∶3。在荧光滴定实验中，制备1mL小分子探针(2.0μM)的DMSO/H2O(v/v＝5∶1)溶液。同浓度的ClO-溶液滴加到探针溶液中，以408nm为激发波长测量探针从400nm到700nm的荧光值，实验结果见图5(b)。可观察到探针的荧光强度随ClO-浓度增加而增强，当两者浓度比例为1∶3时，荧光强度达到饱和。
实施例3验证小分子探针对次氯酸选择性和竞争性。
制备5.0mL分子探针(5.0×10-6mol/L)的DMSO/H2O(v/v＝1∶1)溶液。通过将相应的盐溶于去离子水制备各种阴离子溶液[F-，Cl-，NO2 -，ClO4 -，HCO3 -，H2PO4 -，SO4 2-，S2O3 2-，CO3 -，H2O2，ClO-](1.0×10-3mol/L)。随后，将同等当量的阴离子溶液加入到探针溶液中。通过荧光光谱进行检测，实验结果见图10(a)。取荧光最大吸收波长进行对比，如图10(b)所示，离子包括F-，Cl-，NO2 -，ClO4 -，HCO3 -，H2PO4 -，SO4 2-，S2O3 2-，CO3 -，H2O2，ClO-。除次氯酸离子外，这些阴离子对探针的荧光都没有产生明显变化。在加入次氯酸离子后，小分子探针在605nm处的荧光强度完全淬灭，λex＝408nm。而且在探针结合次氯酸离子后，再加入其它阴离子，其它阴离子对体系的荧光强度也不产生干扰，可以判定探针和次氯酸离子具有很强的结合能力。
同时，检测了探针对次氯酸离子响应的时间动力学研究和不同pH值条件下的荧光强度变化，实验结果见图11(a、b)可以看出小分子探针对次氯酸离子有很快的响应，且SPTPA结合次氯酸离子荧光增强并达到值的时间在60s以内。在pH为2-12之间，探针以及探针与次氯酸离子的复合物荧光都能够保持好现有的荧光强度。
实施例4小分子探针对ClO-识别的密度泛函理论研究
为了进一步了解探针的分子结构，荧光和吸收光谱的传感机理，进行了有无ClO-情况下探究了小分子探针的理论计算，以密度泛函理论深入了解它们的电子跃迁(DFT).如图6所示，提出了SPTPA和ClO-反应前后的分子轨道图，并且优化的结构显示SPTPA可以与ClO-反应使C-O形成-OH。这与上述光谱实验的结果一致。此外，SPTPA基态的电子云主要位于分子结构的＝N-N＝结构中，当转移并分散到整个共轭体系和周围原子激发时，表明中等激发态分子内质子转移(ESIPT)在分子中的作用。此外，闭环和开环结构的能级从HOMO(-0.150/-0.195eV)到LUMO(-0.058/-0.111eV)的水平为0.092eV/0.084eV，SPTPA和其他轨道也是如此。
实施例5小分子探针的在癌细胞中成像效果
为了探索小分子探针对于活细胞中亚细胞标记和保护ClO-的潜在生物学可用性，在MRC-5细胞系中进行细胞生物成像。为了证明探针检测内源性ClO-细胞的能力，我们进行了阴性和阳性对照的成像分析作为有力的证据。当细胞与游离小分子探针一起温育时，观察到可见荧光信号，图7所示。之后，将这些预处理细胞与探针一起温育20分钟，加入ClO-(6.0μM)立即观察到红色通道中的显着荧光强度。这些结果清楚地表明SPTPA探针满足监测活细胞中内源ClO-的要求。
实施例6小分子探针的在正常细胞中成像效果
为了进一步探索其应用，使用探针通过使用荧光成像的生物成像来感测大肠杆菌和金黄色葡萄球菌中的ClO-。图8所示，单独用2.0μM探针染色的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌在大肠杆菌的红色通道中几乎没有荧光，在金黄色葡萄球菌中没有荧光。随着ClO-的加入，红色通道中的荧光变得更强大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的“棒状”和“球状”形状可以从荧光模式中清晰地看到。分别在缩放区域。这些结果证明探针可用于追踪大肠杆菌和金黄色葡萄球菌中的ClO-，这将是研究细菌中ClO-生物转化的潜在工具。
实施例7小分子探针的在斑马鱼中成像效果
在正常的代谢过程中，生物体的器官可以自发地产生各种ROS。到目前为止，大多数研究报告证明荧光成像的可能性是通过预先喂入/注射或将ROS诱导的化学物质添加到生物体中而引入额外的ROS。然而，荧光探针在正常生物中对自发ROS的生物成像仍然面临探针的灵敏度和稳定性及其通过各种生物屏障的能力的问题。在活体动物的数量上产生了许多生物过程，导致ROS(ClO-)在那里自我产生。因此，为了研究探针对生物体内源性和外源性ClO-的潜在生物学应用，5日龄斑马鱼是一种流行的脊椎动物模型，它们被选为我们的研究模型系统。图9所示，斑马鱼在胚胎培养基中培养，并与游离探针(2.0μM)孵育20分钟，以确保探针渗透到斑马鱼的整个组织中，在腹部显示出弱而可见的红色荧光。此外，斑马鱼用探针预处理，用PBS洗涤三次，分别与ClO-(6.0μM)一起孵育，在斑马鱼的头部和腹部显示出显着的红色荧光。因此，这些结果表明探针具有高组织穿透能力，并且可以实现斑马鱼中ClO-的可视化
本发明具有如下优点：通过本发明所述制备方法合成小分子探针，还可以实现紫外和荧光光谱法精确传感ClO-，并且可以快速、准确的检测细胞、细菌和斑马鱼体内中内源性的ClO-。因此在ClO-检测方面具有良好的应用前景。同时，本发明的合成方法简单、操作方便，不需要苛刻的条件。
以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种次氯酸离子小分子荧光探针，其特征在于：所述小分子荧光探针分子式为C43H42N4O，其结构式为：
2.根据权利要求1所述的一种次氯酸离子小分子荧光探针的制备方法，其特征在于：将分子式为C19H17N3的三苯胺肟和分子式为C24H27NO2的螺吡喃醛溶解在乙醇溶液中，并在室温下搅拌反应4-24h，反应得到黄色固体并用乙醇洗涤干燥得到目标产物；
所述三苯胺肟的结构式为
所述螺吡喃醛的结构式为
3.根据权利要求2所述的一种次氯酸离子小分子荧光探针的制备方法，其特征在于：原料的摩尔比为：
1～2份三苯胺肟；
1～2份螺吡喃醛。
4.根据权利要求1所述的次氯酸离子小分子荧光探针的应用，其特征在于，在制备检测、识别环境中或生物样品中次氯酸检查试剂盒中的应用。
5.根据权利要求4所述的次氯酸离子小分子荧光探针的应用，其特征在于，所述小分子荧光探针在制备利用荧光成像检测正常细胞和癌细胞中外源性的ClO-离子的试剂盒中应用。
6.根据权利要求1所述的次氯酸离子小分子荧光探针的应用，其特征在于，所述小分子荧光探针在制备细胞体外ClO-离子检测试剂盒中的应用。
7.根据权利要求4所述的次氯酸离子小分子荧光探针的应用，其特征在于，在制备通过紫外分光光度法，在200nm～650nm的波长范围内测定含有ClO-的样品溶液的吸光度；在最大吸收波长530nm下识别环境中或生物样品中ClO-离子的试剂盒中的应用。
8.根据权利要求4所述的次氯酸离子小分子荧光探针的应用，其特征在于，在制备通过荧光分光光度法，以408nm为激发波长，在400nm到700nm的波长范围内测定含有ClO-离子样品溶液的荧光强度；在最大发射波长605nm下识别环境中或生物样品中的ClO-离子的试剂盒中的应用。
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