CN111334076B - 一类高亮度、高光稳定性的细胞核荧光探针 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一类高亮度、高光稳定性的细胞核荧光探针。该探针为一类可用于细胞核荧光成像的4‑取代萘酰亚胺类染料，该类染料具有合成原料低廉、方法简单且易于衍生等优点。研究发现，这类染料在萘酰亚胺母体的4‑位引入的氮杂环丁烷结构，同时增加了染料的刚性和平面性，有效地抑制了TICT过程，此类染料在乙醇中的摩尔消光系数为15000M‑1cm‑1左右，荧光量子产率为0.6左右，有很高的亮度和光稳定性。在染料上引入吗啉环、N,N‑二甲基等碱性基团，使染料可以靶向细胞核，从而实现对细胞和的精准定位。该类细胞核染料有很高的亮度和光稳定性，能够快速标记细胞核并利用于细胞核荧光成像等领域。

Description

一类高亮度、高光稳定性的细胞核荧光探针
技术领域
本发明属于荧光成像技术领域，具体涉及一类高亮度、高光稳定性的细胞核荧光探针。
背景技术
荧光成像技术是现代生命科学领域强有力的工具之一，超分辨成像技术的出现更是将荧光成像技术推向一个新的高度。而更高亮度及光稳定性的染料是实现高分辨成像的必要条件之一，遗憾的是，大部分现有的荧光染料都缺乏足够的亮度和光稳定性来进行超分辨成像。萘酰亚胺类染料是典型的推-拉电子体系染料，在其4-位引入供电子基如N,N-二甲基等结构可以使其发射波长发生明显的红移，但同时N,N-二甲基结构也会使分子在激发态时容易通过TICT(分子内扭转电荷转移)的方式损耗大量能量，大大降低了染料的亮度及光稳定性，这类染料的荧光量子产率通常仅有0.01左右，极大地限制了它们的应用。
细胞核是细胞内最重要的细胞器，调控着细胞遗传和代谢等生理过程，对细胞核进行成像研究有着重要的意义。目前使用最广泛的商业细胞核染料如DAPI系列、Hoechst系列等其最佳激发波长仅为360nm左右，无法被现有的商业化激光器有效激发，且该波长的光能量较高，不仅细胞的光毒性较大，同时也容易造成染料的光漂白现象。这是由于染料被光激发到激发态后，会通过系间窜越的方式进入三线态，处于三线态的分子容易受到空气中氧分子的进攻致使染料结构被破坏，因而将染料分子与氧气隔离可以有效地避免光漂白现象，例如在氮气氛围中进行成像实验、用葫芦脲包裹荧光团等。然而这些方法大多费时费力，因而开发新型方法简单且高亮度、高光稳定性的细胞核染料迫在眉睫。
发明内容
本发明提供了一类高亮度、高光稳定性的细胞核荧光探针，该探针为一类4-取代萘酰亚胺类荧光探针，该探针在萘酰亚胺母体的4-位引入氮杂环丁烷，同时增加了染料的刚性和平面性；引入吗啉环、N,N-二甲基等碱性基团使其能够靶向细胞核。研究发现这类染料有很高的亮度、优异的光稳定性，能够快速透过细胞并富集在细胞核中，可进一步用于荧光成像。
本发明一类高亮度、高光稳定性的细胞核荧光探针。，是以4-取代萘酰亚胺染料为结构单元，其结构式如下所示：
Figure BDA0001910579930000021
其中
Figure BDA0001910579930000022
Figure BDA0001910579930000023
R2＝-H、-CH3，n＝0,1,2,3,4,5。
一类高亮度、高光稳定性的细胞核荧光探针的合成方法，合成步骤如下：
Figure BDA0001910579930000024
具体合成步骤如下：
步骤一：中间体4-氮杂环丁基-1,8-萘酐(Naph-Aze)的合成
称取4-溴-1,8-萘酐、水硫酸铜与干燥的N,N-二甲基甲酰胺中，氮气保护下加入氮杂环丁烷，升温至120-140℃反应10-20h。将反应液缓慢倒入冷水中，抽滤除去滤液。滤渣用二氯甲烷溶解后硅胶柱层析分离得到中间体4-氮杂环丁基-1,8-萘酐。
步骤二：不同N-取代的4-氮杂环丁基-1,8-萘酰亚胺细胞核探针的合成
将4-氮杂环丁基-1,8-萘酐、不同伯胺溶于无水乙醇中，升温至60-80℃反应10-20h，冷却反应液后减压除蒸溶剂后经硅胶柱色谱分离提纯得到不同N-取代的4-氮杂环丁基-1,8-萘酰亚胺细胞核探针。
步骤一中，4-溴-1,8-萘酐、无水硫酸铜与氮杂环丁烷的质量比为1:1-3:0.3-1，4-溴-1,8-萘酐的质量与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为1:2-6g/mL。
步骤二中，4-氮杂环丁基-1,8-萘酐与不同取代的伯胺的质量比为1:0.25-10，4-氮杂环丁基-1,8-萘酐的质量与无水乙醇的体积比为1:10-100g/mL。
上述细胞核荧光探针在活细胞及活体内能够对细胞核进行特异性标记并实现荧光成像。
一种高亮度、高光稳定性的细胞核荧光探针在荧光成像、分子探针及荧光传感领域的应用。
本发明具有以下特征：
这类探针拥有合成原料低价、方法简单且易于衍生等优点。
这类探针在萘酰亚胺母体的4-位引入的氮杂环丁烷结构可以有效地抑制TICT过程，此类染料在乙醇中的摩尔消光系数为15000M-1cm-1左右，荧光量子产率为0.6左右，有很高的亮度和光稳定性。
染料有很好的刚性和平面性，可以插入细胞核中的核酸链中，从而实现对细胞核的精准定位，可应用于细胞核与其他细胞器相互作用研究、细胞凋亡等研究中。
附图说明
图1为实施例1中制备的细胞核探针OMor-Aze的核磁氢谱；
图2为实施例1中制备的细胞核探针OMor-Aze的核磁碳谱；
图3为实施例1中制备的细胞核探针OMor-Aze的高分辨质谱；
图4为实施例5中制备的细胞核探针DPma-Aze的核磁氢谱；
图5为实施例5中制备的细胞核探针DPma-Aze的核磁碳谱；
图6为实施例5中制备的细胞核探针DPma-Aze的高分辨质谱；
图7为实施例1制备的细胞核探针OMor-Aze在乙醇中归一化荧光激发与发射谱图，横坐标为波长，纵坐标为归一化的荧光强度与吸收强度，荧光探针的浓度为10μM；
图8为实施例1制备的细胞核探针OMor-Aze与荧光素在PBS缓冲液(20mM,pH＝7.4)中，经过不同时间激光照射后后其最大荧光发射强度的变化，横坐标为激光照射时间，纵坐标为相对荧光强度，即最大荧光发射强度与初始最大荧光发射强度的比值；
图9为实施例1制备的细胞核染料OMor-Aze的HeLa细胞荧光成像图；
图10：实施例4制备的细胞核染料DEma-Aze的HeLa细胞荧光成像图；
图11：实施例7制备的细胞核染料BisPia-Aze的HeLa细胞荧光成像图。
具体实施方式
实施例1
细胞核探针OMor-Aze的合成。
中间体Naph-Aze合成路线和产物结构如下：
Figure BDA0001910579930000041
称取4-溴-1,8-萘酐(3.0g,10.9mmol)、无水硫酸铜(5.2g,32.7mmol)于10mL干燥的DMF中，在氮气保护下加入氮杂环丁烷(1.9g,32.7mmol)，升温至140℃反应20h，冷却反应液至室温后，将反应液缓慢倒入冰水中，有大量橙色固体析出。抽滤除去滤液，滤渣用二氯甲烷溶解后经硅胶柱色谱分离提纯(石油醚/二氯甲烷＝1/10，V/V)，得到橙色固体粉末Naph-Aze1.1g，产率40％。
其高分辨质谱数据如下：
HRMS(ESI)：m/z：[M+H]+：计算值：254.0817，实验值：254.0883。
经检测，其结构如上式Naph-Aze所示。
细胞核探针OMor-Aze合成路线和产物结构如下：
Figure BDA0001910579930000051
称取Naph-Aze(0.1g,0.4mmol)于5mL无水乙醇中，加入N-(2-(2-氨基)乙氧基乙基)吗啉(0.2g,1.2mmol)，将反应液加热至60℃反应8h后，反应液冷却至室温，减压蒸馏除去溶剂，残余物经硅胶柱(二氯甲烷/甲醇＝50/1，V/V)分离得到产物OMor-Aze，为橙色固体OMor-Aze 0.13g，产率82％。
其核磁谱图氢谱如下如图1所示，具体数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3,ppm):δ＝8.51(d,J＝7.2Hz,1H),8.35(d,J＝8.4Hz,1H),8.21(d,J＝8.4Hz,1H),7.49(t,J＝7.9Hz,1H),6.36(d,J＝8.4Hz,1H),4.48(t,J＝7.4Hz,4H),4.41(t,J＝6.0Hz,2H),3.78(t,J＝6.0Hz,2H),3.67(t,J＝5.3Hz,2H),3.61-3.53(m,4H),2.56(dd,J＝12.9,6.9Hz,4H),2.44(s,4H).
其核磁谱图碳谱如下如图2所示，具体数据如下：
13C NMR(101MHz,CDCl3,ppm):δ＝164.71,163.97,152.47,133.29,131.10,130.60,130.08,123.65,122.60,120.88,110.05,106.20,68.30,68.01,66.78,58.29,55.34,53.99,38.79,17.05.
其高分辨质谱谱图如下如图3所示，具体数据如下：
HRMS(ESI)：m/z：[M+H]+：计算值：410.2080，实验值：410.2080。
经检测，其结构如上式OMor-Aze所示，其在乙醇中的紫外吸收为450nm，荧光发射为550nm，有很高的亮度和光稳定性，能够准确定位活细胞细胞核。
将待测染料分别溶解于二甲基亚砜溶液中，配制成不同染料的2mM母液，根据需要制配成不同浓度测试溶液，对其光谱及细胞成像进行检测。
OMor-Aze在乙醇中的光谱测试。取20μLOMor-Aze母液，加入4mL乙醇中，配制成10μM的荧光探针测试液，并进行紫外和荧光光谱的测试。
OMor-Aze在乙醇中的归一化吸收光谱和荧光光谱如图7所示，其中荧光探针浓度为10μM，OMor-Aze在乙醇中摩尔消光系数达14630M-1cm-1，量子产率达到0.61，该探针具有很高的亮度。
OMor-Aze与荧光素在PBS缓冲液(20mM,pH＝7.4)中的光稳定性测试。取20μLOMor-Aze、荧光素母液，分别加入4mL PBS缓冲液中，配制成10μM的荧光探针测试液，并在500W钨灯下连续照射。光源距离样品50cm，每次将测试液温度稳定在25℃后进行荧光光谱测试。采取0,0.5,1,1.5,2,3,4,5,6,8,10h为时间点分别测试。
OMor-Aze与荧光素在不同时间激光照射后，最大荧光发射强度与初始最大荧光发射强度的比值如图8所示；其中荧光探针浓度均为10μM，在连续照射10h后，OMor-Aze的荧光发射强度相比初始最大荧光发射强度仅下降了约10％，而荧光素染料的发射强度下降了近90％，证明OMor-Aze有很好的光稳定性。
实施例2
细胞核探针Pid-Aze合成路线和产物结构如下：
Figure BDA0001910579930000061
称取Naph-Aze(0.1g,0.4mmol)于5mL无水乙醇中，加入1-氨基哌啶(1.2g,12mmol)，将反应液加热至80℃反应8h后，反应液冷却至室温，减压蒸馏除去溶剂，残余物经硅胶柱(二氯甲烷/甲醇＝50/1，V/V)分离得到产物Pid-Aze，为橙色固体0.11g，产率87％。
其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3,ppm):δ＝8.55(d,J＝6.9Hz,1H),8.39(d,J＝8.3Hz,1H),8.26(d,J＝8.2Hz,1H),7.52(t,J＝7.6Hz,1H),6.41(d,J＝8.3Hz,1H),4.51(t,J＝6.9Hz,4H),3.12(t,J＝7.2Hz,4H),2.61-2.52(m,2H),1.86(m,4H),1.52(m,2H).
经检测，其结构如上式Pid-Aze所示，其在乙醇中的紫外吸收为450nm，荧光发射为550nm，有很高的亮度和光稳定性，能够准确定位活细胞细胞核。
实施例3
细胞核探针Pia-Aze合成路线和产物结构如下：
Figure BDA0001910579930000071
称取Naph-Aze(0.1g,0.4mmol)于5mL无水乙醇中，加入1-(2-氨乙基)哌嗪(0.025g,0.4mmol)，将反应液加热至80℃反应8h后，反应液冷却至室温，减压蒸馏除去溶剂，残余物经硅胶柱(二氯甲烷/甲醇＝50/1，V/V)分离得到产物Pia-Aze，为橙色固体0.09g，产率63％。
其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3,ppm):δ＝8.55(d,J＝6.9Hz,1H),8.39(d,J＝8.3Hz,1H),8.26(d,J＝8.2Hz,1H),7.52(t,J＝7.6Hz,1H),6.41(d,J＝8.3Hz,1H),4.51(t,J＝6.9Hz,4H),4.32(d,J＝6.1Hz,2H),3.70(s,4H),2.70(s,2H),2.65-2.39(m,6H).
其核磁谱图碳谱数据如下：
13C NMR(101MHz,CDCl3,ppm):δ＝164.70,163.98,152.48,133.28,131.10,130.58,130.09,123.67,122.59,120.88,110.01,106.22,67.07,56.25,55.36,53.81,36.92,17.05.
经检测，其结构如上式Pia-Aze所示，其在乙醇中的紫外吸收为450nm，荧光发射为550nm，有很高的亮度和光稳定性，能够准确定位活细胞细胞核。
实施例4
细胞核探针DEma-Aze合成路线和产物结构如下：
Figure BDA0001910579930000081
称取Naph-Aze(0.1g,0.4mmol)于5mL无水乙醇中，加入N,N-二甲基乙胺(0.1g,1.2mmol)，将反应液加热至80℃反应8h后，反应液冷却至室温，减压蒸馏除去溶剂，残余物经硅胶柱(二氯甲烷/甲醇＝50/1，V/V)分离得橙色固体0.11g，产率86％。
其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.51(dt,J＝29.2,14.7Hz,1H),8.40-8.29(m,1H),8.24-8.14(m,1H),7.49(td,J＝8.5,2.3Hz,1H),6.44-6.29(m,1H),4.61-4.41(m,4H),4.32(t,J＝7.2Hz,2H),2.66(t,J＝7.2Hz,2H),2.61-2.52(m,2H),2.37(s,6H).
其核磁谱图碳谱数据如下：
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ164.77,164.06,152.51,133.34,131.16,130.63,130.10,123.68,122.63,120.90,110.10,106.24,57.00,55.36,45.70,37.81,17.06.
其高分辨质谱数据如下：
HRMS(ESI)：m/z：[M+H]+：计算值：324.1712，实验值：324.1695。
经检测，其结构如上式DEma-Aze所示，其在乙醇中的紫外吸收为450nm，荧光发射为550nm，有很高的亮度和光稳定性，能够准确定位活细胞细胞核。
实施例5
细胞核探针DPma-Aze合成路线和产物结构如下：
Figure BDA0001910579930000091
称取Naph-Aze(0.1g,0.4mmol)于5mL无水乙醇中，加入N,N-二甲基丙胺(0.1g,1.2mmol)，将反应液加热至80℃反应8h后，反应液冷却至室温，减压蒸馏除去溶剂，残余物经硅胶柱(二氯甲烷：甲醇＝50:1，V/V)分离得产物DPma-Aze，为橙色固体0.11g，产率85％。
其核磁谱图氢谱如下如图4所示，具体数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.53(dd,J＝12.3,7.3Hz,1H),8.34(t,J＝9.2Hz,1H),8.20(t,J＝9.1Hz,1H),7.54–7.45(m,1H),6.36(d,J＝8.5Hz,1H),4.57–4.40(m,4H),4.32–4.12(m,2H),2.67–2.48(m,4H),2.35(s,6H),1.98(dt,J＝14.8,7.5Hz,2H).
其核磁谱图碳谱如下如图5所示，具体数据如下：
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ164.69,164.00,152.49,133.30,131.12,130.55,130.11,123.67,122.57,120.87,110.00,106.22,57.12,55.36,44.96,38.25,25.70,17.06.
其高分辨质谱谱图如下如图6所示，具体数据如下：
HRMS(ESI)：m/z：[M+H]+：计算值：338.1869，实验值：338.1886。
经检测，其结构如上式DPma-Aze所示，其在乙醇中的紫外吸收为450nm，荧光发射为550nm，有很高的亮度和光稳定性，能够准确定位活细胞细胞核。
实施例6
细胞核探针BisEma-Aze合成路线和产物结构如下：
Figure BDA0001910579930000101
称取Naph-Aze(0.1g,0.4mmol)于5mL无水乙醇中，加入三亚乙基四胺(0.03g,0.2mmol)，将反应液加热至80℃反应8h后，反应液冷却至室温，减压蒸馏除去溶剂，残余物经硅胶柱(二氯甲烷：甲醇＝50:1，V/V)分离得产物BisEma-Aze，为橙色固体0.11g，产率85％。
其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.53(dt,J＝22.5,12.2Hz,2H),8.37(t,J＝7.2Hz,2H),8.22(m,2H),7.50(m,2H),6.37(m,2H),4.60-4.43(m,8H),4.35(t,J＝7.6Hz,4H),2.65(t,J＝7.6Hz,4H),2.63(t,J＝5.6Hz,4H),2.61-2.50(m,4H).
其核磁谱图碳谱数据如下：
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ164.72,164.03,152.51,133.32,131.13,130.58,130.11,123.66,122.55,120.89,110.05,106.22,57.16,55.37,45.23,43.87,37.81.
其高分辨质谱数据如下：
HRMS(ESI)：m/z：[M+H]+：计算值：617.2876，实验值：617.2895。
经检测，其结构如上式BisEma-Aze所示，其在乙醇中的紫外吸收为450nm，荧光发射为550nm，有很高的亮度和光稳定性，能够准确定位活细胞细胞核。
实施例7
细胞核探针BisPia-Aze合成路线和产物结构如下：
Figure BDA0001910579930000111
称取Naph-Aze(0.3g,1.2mmol)于5mL无水乙醇中，加入Bis-Pid(0.06g,0.4mmol)，将反应液加热至80℃反应8h后，反应液冷却至室温，减压蒸馏除去溶剂，残余物经硅胶柱(二氯甲烷/甲醇＝50/1，V/V)分离得到产物BisPia-Aze，为橙色固体0.23g，产率92％。
其高分辨质谱数据如下：
HRMS(ESI)：m/z：[M+H]+：计算值：643.3033，实验值：640.3086。
经检测，其结构如上式BisPia-Aze所示，其在乙醇中的紫外吸收为450nm，荧光发射为550nm，有很高的亮度和光稳定性，能够准确定位活细胞细胞核。
将待测染料分别溶解于二甲基亚砜溶液中，配制成不同染料的2mM母液，根据需要制配成不同浓度测试溶液，检测其细胞内细胞核荧光成像结果。
实施例8
OMor-Aze对活细胞染色后荧光成像检测。取1μLOMor-Aze母液溶于2mL细胞培养液中，37℃，5％CO2下孵育60分钟后分别进行荧光共聚焦成像。
OMor-Aze终浓度为2μM的细胞培养液孵育宫颈癌细胞(HeLa)60分钟后共聚焦荧光成像如图9所示；OMor-Aze能够对HeLa细胞的细胞核进行精准定位，细胞核清晰可见，达到免洗荧光成像。
实施例9
DEma-Aze对活细胞染色后荧光成像检测。取1μLDEma-Aze母液溶于2mL细胞培养液中，37℃，5％CO2下孵育60分钟后分别进行荧光共聚焦成像。
DEma-Aze终浓度为2μM的细胞培养液孵育宫颈癌细胞(HeLa)60分钟后共聚焦荧光成像如图10所示；DEma-Aze能够对HeLa细胞的细胞核进行精准定位，细胞核清晰可见，达到免洗荧光成像。
实施例10
BisPia-Aze对活细胞染色后荧光成像检测。取1μLBisPia-Aze母液溶于2mL细胞培养液中，37℃，5％CO2下孵育60分钟后分别进行荧光共聚焦成像。
BisPia-Aze终浓度为2μM的细胞培养液孵育宫颈癌细胞(HeLa)60分钟后共聚焦荧光成像如图11所示；BisPia-Aze能够对HeLa细胞的细胞核进行精准定位，细胞核清晰可见，达到免洗荧光成像。

Claims (5)

1.一类高亮度、高光稳定性的细胞核荧光探针，其特征在于：其结构式如下所示，
Figure FDA0003181872040000011
其中：
Figure FDA0003181872040000012
Figure FDA0003181872040000013
R2＝-H、-CH3，n＝0,1,2,3,4,5；
所述细胞核荧光探针的合成方法如下：
步骤一：中间体4-氮杂环丁基-1,8-萘酐的合成
称取4-溴-1,8-萘酐、无水硫酸铜与干燥的N,N-二甲基甲酰胺中，氮气保护下加入氮杂环丁烷，升温至120-140℃反应10-20h；将反应液缓慢倒入冷水中，抽滤除去滤液；滤渣用二氯甲烷溶解后硅胶柱层析分离得到中间体4-氮杂环丁基-1,8-萘酐；
步骤二：N-取代-4-氮杂环丁基-1,8-萘酰亚胺探针的合成
将4-氮杂环丁基-1,8-萘酐、不同取代的伯胺溶于无水乙醇中，升温至60-80℃反应10-20h，冷却反应液后减压除蒸溶剂后经硅胶柱色谱分离提纯得到N-取代-4-氮杂环丁基-1,8-萘酰亚胺探针。
2.一种如权利要求1所述的高亮度、高光稳定性的细胞核荧光探针的合成方法，其特征在于：该合成的具体方法如下：
步骤一：中间体4-氮杂环丁基-1,8-萘酐的合成
称取4-溴-1,8-萘酐、无水硫酸铜与干燥的N,N-二甲基甲酰胺中，氮气保护下加入氮杂环丁烷，升温至120-140℃反应10-20h；将反应液缓慢倒入冷水中，抽滤除去滤液；滤渣用二氯甲烷溶解后硅胶柱层析分离得到中间体4-氮杂环丁基-1,8-萘酐；
步骤二：N-取代-4-氮杂环丁基-1,8-萘酰亚胺探针的合成
将4-氮杂环丁基-1,8-萘酐、不同取代的伯胺溶于无水乙醇中，升温至60-80℃反应10-20h，冷却反应液后减压除蒸溶剂后经硅胶柱色谱分离提纯得到N-取代-4-氮杂环丁基-1,8-萘酰亚胺探针。
3.如权利要求2中所述的一种高亮度、高光稳定性的细胞核荧光探针的合成方法，其特征在于：步骤一中，4-溴-1,8-萘酐、无水硫酸铜与氮杂环丁烷的质量比为1:1-3:0.3-1，
4-溴-1,8-萘酐的质量与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为1:2-6g/mL。
4.如权利要求2中所述一种高亮度、高光稳定性的细胞核荧光探针的合成方法，其特征在于：步骤二中，4-氮杂环丁基-1,8-萘酐与不同取代的伯胺的质量比为1:0.25-10，
4-氮杂环丁基-1,8-萘酐的质量与无水乙醇的体积比为1:10-100g/mL。
5.如权利要求1所述的一类高亮度、高光稳定性的细胞核荧光探针在荧光成像、分子探针及荧光传感领域的应用。
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