CN111303153B - 一种高亮度的免洗SNAP-tag探针及其合成方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种高亮度的免洗SNAP‑tag探针及其合成方法和应用，该探针结构(1)所示，通过氮杂环丁烷抑制萘酰亚胺的分子内旋转，从而具有高光稳定性、高量子产率等特点，与SNAP‑tag蛋白作用后，荧光增强10倍。该探针能够在活细胞内对融合有SNAP‑tag标签的目标蛋白进行特异性标记，可以实现免洗荧光成像。该探针能够在蛋白标记、蛋白与蛋白的相互作用，以及超分辨荧光成像等领域具有广泛应用。

Description

一种高亮度的免洗SNAP-tag探针及其合成方法和应用
技术领域
本发明属于荧光成像技术领域，具体涉及一种高亮度的免洗SNAP-tag探针及其合成方法和应用。
背景技术
荧光成像技术对于蛋白的功能研究起到越来越重要的作用。蛋白标签技术由于结合了荧光蛋白的遗产编码特性与小分子荧光染料优良光物理性能已经成为蛋白可视化及揭示蛋白功能的一种重要的工具。该技术通过遗传编码技术将蛋白标签融合到目标蛋白，然后与底物分子特异性反应，从而将荧光分子标记到目标蛋白上，实现对蛋白灵活的、特异性的荧光标记。因此，染料分子的性质会直接影响免洗成像的效果。
目前报道的免洗SNAP-tag荧光探针主要有两类：淬灭释放型SNAP-tag荧光探针、环境敏感型SNAP-tag荧光探针。其中淬灭释放型SNAP-tag荧光探针虽然具有好的信噪比，但是由于其相对较大的分子体积，导致其较差的反应速率。一般环境敏感型的SNAP-tag荧光探针具有好的标记速率，但是亮度较低，光稳定性较差。因此具有快的标记速率及优良光物理性质的SNAP-tag荧光探针的设计仍然存在挑战性，而其也必将推动活细胞内对蛋白功能的研究。
发明内容
本发明提供一种高亮度的免洗SNAP-tag探针及其合成方法和应用。
本发明提供一种高亮度的免洗SNAP-tag探针，以4-氨基-1,8-萘酰亚胺为荧光基团，苄氧基为结合位点，该荧光探针具有如下结构：
Figure BDA0001902039390000021
本发明一种SNAP-tag蛋白标签荧光探，该探针能够特异性与SNAP-tag蛋白反应，并且反应后荧光强度增加10倍，可应用于活细胞中蛋白免洗荧光成像。
本发明一种SNAP-tag蛋白标签荧光探，该探针具有高光稳定性、高量子产率，荧光量子产率达到0.83(在氯仿中)。
本发明一种SNAP-tag蛋白标签荧光探针，该探针与SNAP-tag蛋白具有较快的反应速度，t1/2为9.6s。
一种SNAP-tag蛋白标签荧光探的合成方法，其合成路线如下：
Figure BDA0001902039390000022
具体合成步骤如下：
(1)中间体4-氨基(3-羧基环丁胺基)-N-(丁基)1,8-萘酰亚胺的合成：
将4-溴-N-(丁基)1,8-萘酰亚胺和3-羧基环丁胺溶于乙二醇单甲醚，向其中加入三乙胺，在120℃下搅拌8-12h。反应完成后，冷却至室温，减压蒸馏得到橙色固体。反应产物4-氨基(3-羧基环丁胺基)-N-(丁基)1,8-萘酰亚胺经硅胶柱分离纯化获得。
(2)中间体4-氨基(3-酰胺基(4-羟甲基苄基)环丁胺基)-N-(丁基)1,8- 萘酰亚胺的合成：
将4-氨基(3-羧基环丁胺基)-N-(丁基)1,8-萘酰亚胺、4-胺甲基苄醇、1- 羟基苯并三唑(HOBT)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)溶于N,N- 二甲基甲酰胺(DMF)中，室温下反应18-24h。反应结束后减压蒸馏除去溶剂，经硅胶柱分离纯化得到目标物。
(3)AN-BG的合成：
将4-氨基(3-酰胺基(4-羟甲基苄基)环丁胺基)-N-(丁基)-1,8-萘酰亚胺、嘌呤衍生物1和叔丁醇钾溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，室温下反应6-12h。反应结束后减压蒸馏除去溶剂，经硅胶柱分离纯化得到目标物。
步骤(1)中，4-溴-N-(丁基)1,8-萘酰亚胺与3-羧基环丁胺的质量比为 1:0.38-1.52；
4-溴-N-(丁基)1,8-萘酰亚胺与三乙胺的质量与体积比为1:3.8-15g/mL；
4-溴-N-(丁基)1,8-萘酰亚胺与乙二醇单甲醚的质量与体积比为1:20-50 g/mL。
步骤(2)中,
4-氨基(3-羧基环丁胺基)-N-(丁基)1,8-萘酰亚胺与4-胺甲基苄醇的质量比为1:0.22-0.88；
4-氨基(3-羧基环丁胺基)-N-(丁基)1,8-萘酰亚胺与1-羟基苯并三唑的质量比为1:0.64-2.6；
4-氨基(3-羧基环丁胺基)-N-(丁基)1,8-萘酰亚胺与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺的质量比为1:0.8-3.2；
4-氨基(3-羧基环丁胺基)-N-(丁基)1,8-萘酰亚胺与N,N-二甲基甲酰胺 (DMF)的质量与体积比为1:30-120g/mL。
步骤(3)中,4-氨基(3-酰胺基(4-羟甲基苄基)环丁胺基)-N-(丁基)-1,8- 萘酰亚胺与嘌呤衍生物的质量比为1:0.66-2.66；
4-氨基(3-酰胺基(4-羟甲基苄基)环丁胺基)-N-(丁基)-1,8-萘酰亚胺与叔丁醇钾的质量比为1:1.66-6.66；
4-氨基(3-酰胺基(4-羟甲基苄基)环丁胺基)-N-(丁基)-1,8-萘酰亚胺与 N,N-二甲基甲酰胺(DMF)的质量与体积比为1:2.5-10g/mL。
本发明的探针具有操作方便、成本低等优点。
该探针具有高的量子产率而且能够快速的与SNAP-tag蛋白反应，反应后荧光强度增加10倍，应用于活细胞中蛋白免洗荧光成像。
本发明提供一类SNAP-tag蛋白标签荧光探针的合成方法，该方法具有操作方便、成本低等优点。
附图说明
图1实施例1制备的中间体4-氨基(3-酰胺基(4-羟甲基苄基)环丁胺基)-N- (丁基)1,8-萘酰亚胺核磁谱图氢谱。
图2实施例1制备的中间体4-氨基(3-酰胺基(4-羟甲基苄基)环丁胺基)-N- (丁基)1,8-萘酰亚胺核磁谱图碳谱。
图3实施例1制备的荧光探针AN-BG核磁谱图氢谱。
图4实施例1制备的荧光探针AN-BG核磁谱图碳谱。
图5实施例1制备的荧光探针AN-BG在不同溶剂中的荧光谱图，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度，荧光探针的浓度为5μM。
图6实施例1制备的荧光探针AN-BG在与SNAP-tag反应前后荧光强度变化图，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度，荧光探针的浓度为2μM，SNAP-tag浓度为 1μM，测试环境为pH＝7.4PBS缓冲液。
图7实施例1制备的荧光探针AN-BG在与SNAP-tag反应过程中荧光强度变化图，横坐标为时间，纵坐标为荧光强度，荧光探针的浓度为2μM，SNAP-tag 浓度为1μM，测试环境为pH＝7.4PBS缓冲液。
图8实施例1制备的荧光探针AN-BG对细胞核内蛋白转染SNAP-tag后的活细胞荧光共聚焦成像。
具体实施方式
实施例1
一种具有特异快速标记能力的SNAP-tag蛋白标签荧光探针的合成方法。
中间体4-氨基(3-羧基环丁胺基)-N-(丁基)-1,8-萘酰亚胺的合成：
Figure BDA0001902039390000051
将4-溴-N-(丁基)1,8-萘酰亚胺(0.66g，2mmol)和3-羧基环丁胺(0.5g， 5mmol)溶于30mL乙二醇单甲醚，向其中加入5mL三乙胺，在120℃下搅拌 8h。反应完成后，冷却至室温，减压蒸馏得到橙色固体。反应产物4-氨基(3- 羧基环丁胺基)-N-(丁基)1,8--萘酰亚胺经硅胶柱(200-300目)以二氯甲烷和甲醇(10:1)为展开剂分离纯化获得橙色固体300mg,产率42％。
中间体4-氨基(3-酰胺基(4-羟甲基苄基)环丁胺基)-N-(丁基)-1,8-萘酰亚胺的合成：
Figure BDA0001902039390000061
将4-氨基(3-羧基环丁胺基)-N-(丁基)1,8-萘酰亚胺(0.176g，0.5mmol)、 4-胺甲基苄醇(0.0822g，0.6mmol)、1-羟基苯并三唑(0.226g，1.5mmol)、1- (3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(0.288g，1.5mmol)溶于10mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，室温下反应18h。反应结束后减压蒸馏除去溶剂，经硅胶柱(200-300目)以二氯甲烷和甲醇(30:1)为展开剂分离纯化得到黄色目标物90mg，产率40％。实施例1制备的中间体4-氨基(3-酰胺基(4-羟甲基苄基)环丁胺基)-N-(丁基)-1,8-萘酰亚胺其核磁谱图如图1、2所示，具体数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.64(t,J＝5.9Hz,1H),8.44(d,J＝7.3Hz, 1H),8.41(d,J＝8.5Hz,1H),8.25(d,J＝8.5Hz,1H),7.64(t,1H),7.28(d,J＝8.2 Hz,2H),7.24(d,J＝8.2Hz,2H),6.57(d,J＝8.6Hz,1H),5.13(s,1H),4.66(t,J＝ 8.7Hz,2H),4.51(dd,J＝8.5,6.1Hz,2H),4.48(s,2H),4.33(d,J＝5.8Hz,2H), 4.02(t,2H),3.74–3.63(m,1H),1.59(dt,J＝14.9,7.5Hz,2H),1.41–1.28(m,2H), 0.92(t,J＝7.4Hz,3H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ171.55,163.35,152.53, 137.94,133.24,131.22,127.60,126.96,124.66,120.69,106.89,63.14,57.87,42.66, 34.12,30.25,20.29,14.21.
AN-BG的合成：
Figure BDA0001902039390000071
将4-氨基(3-酰胺基(4-羟甲基苄基)环丁胺基)-N-(丁基)-1,8-萘酰亚胺(30.2mg，0.064mmol)、嘌呤衍生物1(0.0405g，0.16mmol)和叔丁醇钾 (0.036g，0.32mmol)溶于5mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，室温下反应 6-12h。反应结束后减压蒸馏除去溶剂，经硅胶柱(200-300目)以二氯甲烷和甲醇(30:1)为展开剂分离纯化得到黄色目标物20mg，产率50％。实施例1制备的AN-BG其核磁氢谱、碳谱图如图3、4所示，具体数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.41(s,1H),8.66(t,J＝5.8Hz,1H),8.44(d, J＝7.3Hz,1H),8.41(d,J＝8.5Hz,1H),8.25(d,J＝8.5Hz,1H),7.80(s,1H),7.64 (t,1H),7.48(d,J＝8.0Hz,2H),7.32(d,J＝8.0Hz,2H),6.57(d,J＝8.6Hz,1H), 6.27(s,2H),5.47(s,2H),4.65(t,J＝8.7Hz,2H),4.57–4.43(m,2H),4.35(d,J＝ 5.7Hz,2H),4.07–3.97(m,2H),3.69(dt,J＝20.2,7.1Hz,1H),1.64–1.53(m,2H), 1.40–1.29(m,2H),0.92(t,J＝7.3Hz,3H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6) δ171.61,160.32,160.11,152.54,138.26,133.25,131.27,129.07,127.92,122.26, 57.87,30.25,14.20.
经检测，其结构如上式AN-BG所示；其荧光性能如下：
将AN-BG溶解于DMSO溶液中，配制成2mM母液，根据需要配制成不同浓度测试溶液，以检测其荧光光谱及细胞内荧光成像。
探针AN-BG在氯仿、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、乙酸乙酯、乙醇、水、四氢呋喃、甲苯中的荧光光谱。每次取4μL探针母液分别加入4mL以上溶剂中，配制成2μM的荧光染料测试液，进行荧光发射光谱的测试。
探针AN-BG终浓度为2μM在不同溶剂中荧光谱图如图5所示，荧光发射波长在501-549nm，随着溶剂极性的发射波长逐渐增加。其在氯仿等非极性溶剂荧光强度很高，在水里荧光强度很低。
实施例2
中间体4-氨基(3-羧基环丁胺基)-N-(丁基)-1,8-萘酰亚胺的合成：
Figure BDA0001902039390000081
将4-溴-N-(丁基)1,8-萘酰亚胺(0.66g，2mmol)和3-羧基环丁胺(0.25g，2.5mmol)溶于40mL乙二醇单甲醚，向其中加入2.5mL三乙胺，在110℃下搅拌7h。反应完成后，冷却至室温，减压蒸馏得到橙色固体。反应产物4-氨基 (3-羧基环丁胺基)-N-(丁基)1,8--萘酰亚胺经硅胶柱(200-300目)以二氯甲烷和甲醇(10:1)为展开剂分离纯化获得橙色固体150mg,产率42％。
中间体4-氨基(3-酰胺基(4-羟甲基苄基)环丁胺基)-N-(丁基)-1,8-萘酰亚胺的合成：
Figure BDA0001902039390000091
将4-氨基(3-羧基环丁胺基)-N-(丁基)1,8-萘酰亚胺(0.176g，0.5mmol)、 4-胺甲基苄醇(0.0411g，0.3mmol)、1-羟基苯并三唑(0.113g，0.075mmol)、 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(0.144g，0.075mmol)溶于5mL N,N- 二甲基甲酰胺(DMF)中，室温下反应17h。反应结束后减压蒸馏除去溶剂，经硅胶柱(200-300目)以二氯甲烷和甲醇(30:1)为展开剂分离纯化得到黄色目标物50mg，产率50％。
AN-BG的合成：
Figure BDA0001902039390000092
将4-氨基(3-酰胺基(4-羟甲基苄基)环丁胺基)-N-(丁基)-1,8-萘酰亚胺(30mg，0.064mmol)、嘌呤衍生物1(0.02g，0.08mmol)和叔丁醇钾(0.018 g，0.16mmol)溶于2.5mLN,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，室温下反应5h。反应结束后减压蒸馏除去溶剂，经硅胶柱(200-300目)以二氯甲烷和甲醇(30:1) 为展开剂分离纯化得到黄色目标物15mg，产率40％。
经检测，其结构如上式AN-BG所示；其荧光性能如下：
将AN-BG溶解于DMSO溶液中，配制成2mM母液，根据需要配制成不同浓度测试溶液，以检测其荧光光谱及细胞内荧光成像。
探针AN-BG在氯仿、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、乙酸乙酯、乙醇、水、四氢呋喃、甲苯中的荧光光谱。每次取4μL探针母液分别加入4mL以上溶剂中，配制成2μM的荧光染料测试液，进行荧光发射光谱的测试。
探针AN-BG终浓度为2μM在不同溶剂中荧光谱图如图5所示，荧光发射波长在501-549nm，随着溶剂极性的增加发射波长逐渐增加。在水溶液中荧光强度很低。
实施例3
中间体4-氨基(3-羧基环丁胺基)-N-(丁基)-1,8-萘酰亚胺的合成：
Figure BDA0001902039390000101
将4-溴-N-(丁基)1,8-萘酰亚胺(0.99g，3mmol)和3-羧基环丁胺(1.5g， 15mmol)溶于50mL乙二醇单甲醚，向其中加入15mL三乙胺，在130℃下搅拌9h。反应完成后，冷却至室温，减压蒸馏得到橙色固体。反应产物4-氨基(3- 羧基环丁胺基)-N-(丁基)1,8--萘酰亚胺经硅胶柱(200-300目)以二氯甲烷和甲醇(10:1)为展开剂分离纯化获得橙色固体900mg,产率43％。
中间体4-氨基(3-酰胺基(4-羟甲基苄基)环丁胺基)-N-(丁基)-1,8-萘酰亚胺的合成：
Figure BDA0001902039390000111
将4-氨基(3-羧基环丁胺基)-N-(丁基)1,8-萘酰亚胺(0.25g，0.75mmol)、 4-胺甲基苄醇(0.32g，2.4mmol)、1-羟基苯并三唑(0.9g，6mmol)、1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(1.2g，6mmol)溶于40mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，室温下反应18h。反应结束后减压蒸馏除去溶剂，经硅胶柱(200-300 目)以二氯甲烷和甲醇(30:1)为展开剂分离纯化得到黄色目标物120mg，产率35％。
AN-BG的合成：
Figure BDA0001902039390000112
将4-氨基(3-酰胺基(4-羟甲基苄基)环丁胺基)-N-(丁基)-1,8-萘酰亚胺(60mg，0.128mmol)、嘌呤衍生物1(0.16g，0.64mmol)和叔丁醇钾(0.16 g，1.2mmol)溶于20mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，室温下反应12h。反应结束后减压蒸馏除去溶剂，经硅胶柱(200-300目)以二氯甲烷和甲醇(30:1) 为展开剂分离纯化得到黄色目标物80mg，产率50％。
经检测，其结构如上式AN-BG所示；其荧光性能如下：
将AN-BG溶解于DMSO溶液中，配制成2mM母液，根据需要配制成不同浓度测试溶液，以检测其荧光光谱及细胞内荧光成像。
探针AN-BG在氯仿、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、乙酸乙酯、乙醇、水、四氢呋喃、甲苯中的荧光光谱。每次取4μL探针母液分别加入4mL以上溶剂中，配制成2μM的荧光染料测试液，进行荧光发射光谱的测试。
探针AN-BG终浓度为2μM在不同溶剂中荧光谱图如图5所示，荧光发射波长在501-549nm，随着溶剂极性的增加发射波长逐渐增加。在不同溶剂中荧光强度具有很大的差别，具有很强的溶剂敏感特征。
实施例4
探针AN-BG与SNAP-tag反应前后荧光强度变化。将SNAP-tag加入到2μM AN-BG的PBS(pH＝7.4)缓冲溶液中，反应完全后进行荧光发射光谱的测试。
探针AN-BG终浓度为2μM与SNAP-tag反应之后的荧光光谱如图6所示，在与SNAP-tag反应之后由于嘌呤基团淬灭效应的消失与疏水环境的作用，荧光强度增强10倍，荧光发射波长由545nm蓝移至530nm。激发波长为440nm。
实施例5
探针AN-BG与SNAP-tag反应过程中荧光强度变化。将SNAP-tag快速加入到2μM AN-BG PBS(pH＝7.4)缓冲溶液中，进行荧光发射光谱的测试。
探针AN-BG终浓度为2μM与SNAP-tag反应之后的荧光强度随时间变化如图7所示，探针AN-BG与SNAP-tag反应快速，t1/2为9.6s。
实施例6
通过pSNAPf-H2B诱导表达融合有SNAP-tag的H2B。之后加入AN-BG 孵育20分钟，进行免洗活细胞荧光成像实验。
探针AN-BG终浓度为1 μM的细胞培养液孵育Hela细胞10分钟后荧光成像图如图8所示，(a)图为2 µM通道染色效果图（采集500-550 nm）；(b)为Hochest 33342（采集417-477nm）染色效果图。(c)为（a）与（b）整合图。AN-BG能够分别对表达融合有SNAP-tag的H2B进行特异性标记，从而达到对细胞核免洗成像，与商业染料能够有很好的共定位效果。

Claims (7)

1.一种高亮度的免洗SNAP-tag探针，其特征在于该探针以4-氨基-1,8-萘酰亚胺为荧光基团，苄氧基为结合位点，其结构如下所示：
Figure FDA0003611648440000011
2.一种如权利要求1所述的一种高亮度的免洗SNAP-tag探针的合成方法，其特征在于该方法包含步骤如下：
(1)中间体
Figure FDA0003611648440000012
的合成：
将
Figure FDA0003611648440000013
和3-羧基环丁胺溶于乙二醇单甲醚，向其中加入三乙胺，在120℃下搅拌8-12h；反应完成后，冷却至室温，减压蒸馏得到橙色固体；反应产物
Figure FDA0003611648440000021
经硅胶柱分离纯化获得；
(2)中间体
Figure FDA0003611648440000022
的合成：
将
Figure FDA0003611648440000023
4-胺甲基苄醇、1-羟基苯并三唑(HOBT)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，室温下反应18-24h；反应结束后减压蒸馏除去溶剂，经硅胶柱分离纯化得到目标物
Figure FDA0003611648440000024
(3)
Figure FDA0003611648440000031
的合成：
将
Figure FDA0003611648440000032
嘌呤衍生物和叔丁醇钾溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，室温下反应6-12h；反应结束后减压蒸馏除去溶剂，经硅胶柱分离纯化得到目标物。
3.根据权利要求2所述的一种高亮度的免洗SNAP-tag探针的合成方法，其特征在于步骤(1)中：
Figure FDA0003611648440000033
与3-羧基环丁胺的质量比为1:0.38-1.52；
Figure FDA0003611648440000034
与三乙胺的质量与体积比为1:3.8-15g/mL；
Figure FDA0003611648440000041
与乙二醇单甲醚的质量与体积比为1:20-50g/mL。
4.根据权利要求2所述的一种高亮度的免洗SNAP-tag探针的合成方法，其特征在于步骤(2)中：
Figure FDA0003611648440000042
与4-胺甲基苄醇的质量比为1:0.22-0.88；
Figure FDA0003611648440000043
与1-羟基苯并三唑的质量比为1:0.64-2.6；
Figure FDA0003611648440000044
与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺的质量比为1:0.8-3.2；
Figure FDA0003611648440000051
与N,N-二甲基甲酰胺(DMF)的质量与体积比为1:30-120g/mL。
5.根据权利要求2所述的一种高亮度的免洗SNAP-tag探针的合成方法，其特征在于步骤(3)中：
Figure FDA0003611648440000052
与嘌呤衍生物的质量比为1:0.66-2.66；
Figure FDA0003611648440000053
与叔丁醇钾的质量比为1:1.66-6.66；
Figure FDA0003611648440000054
与N,N-二甲基甲酰胺(DMF)的质量与体积比为1:2.5-10g/mL。
6.一种如权利要求1所述的高亮度的免洗SNAP-tag探针在细胞、组织及活体内的荧光成像领域的应用。
7.一种如权利要求1所述的高亮度的免洗SNAP-tag探针在SNAP-tag蛋白的识别与检测领域的应用。
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