CN111333621B - 一种488nm激发的免洗Halo-tag探针及其合成和生物应用 - Google Patents

一种488nm激发的免洗Halo-tag探针及其合成和生物应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种488nm激发的免洗Halo‑tag探针及其合成和生物应用，该探针基于萘酰亚胺染料，其结构式如(1)所示；该探针通过具有强烈环张力的氮杂环丁烷实现了对分子内扭转的抑制，从而使该Halo‑tag探针能够保持高的量子产率与稳定性。此外，该探针在水中的最大激发在482nm，适用于488nm激发下进行荧光成像。该探针能够实现对活细胞内融合有Halo‑tag的目标蛋白特异性标记，达到免洗荧光成像，在单分子检测、超分辨荧光成像等领域有较好的应用前景。

Description

一种488nm激发的免洗Halo-tag探针及其合成和生物应用
技术领域
本发明属于蛋白标签领域，具体涉及一种488nm激发的免洗Halo-tag探针及其合成和生物应用。
背景技术
有机小分子荧光染料具有尺寸小、荧光发射光谱宽泛、可选择荧光颜色多样等优点，这也使其逐渐成为荧光蛋白的替代者被广泛应用与蛋白荧光标记。标签蛋白的出现使小分子荧光染料能够通过特异性的酶促反应共价连接至标签蛋白，从而间接实现对目标蛋白的稳定标记。其中，Halo-tag作为一种非人源的脱卤素酶的变异体被广大研究工作者所青睐，Halo-tag能够与含有卤代脂肪烃的荧光染料发生特异性反应，使两者之间通过稳定的酯键连接。
Halo-tag的应用也伴随着不同荧光探针的开发，其中488nm激发下的探针应用最为广泛。此波段的探针的识别基团通常为氯代己烷，荧光团位荧光素或罗丹明123类染料。荧光素的发光形态为负离子形式，不仅稳定性较差，同时细胞渗透性较低；而罗丹明类染料虽然克服了细胞渗透性和光稳定性问题，但是线粒体聚集的特点使活细胞内荧光成像信噪比较差，会造成荧光信号的误差。因此，488nm波段下的Halo-tag探针仍然匮乏，稳定性、细胞渗透性、相容性需要进一步提高。此外，近几年迅速发展的单分子荧光成像技术对此类探针稳定性要求更为苛刻。
发明内容
本发明的目的一种488nm激发的免洗Halo-tag探针及其合成和生物应用。一种488nm激发的免洗Halo-tag探针，该探针能够实现活细胞内的免洗荧光成像。
一种488nm激发的免洗Halo-tag探针的合成方法，该方法步骤简单、纯化简单、原料低廉等优点。
本发明一种488nm激发的免洗Halo-tag探针，通过在萘酰亚胺分子4,5-位引入两个刚性四元环结构提高了荧光稳定性、亮度，该探针在水中量子产率大于0.20，所述的Halo-tag荧光探针具有如下结构：
Figure BDA0001911518620000021
一种488nm激发的免洗Halo-tag探针，通过具有强烈环张力的氮杂环丁烷实现了对分子内扭转的抑制，从而使该Halo-tag探针能够保持高的量子产率与稳定性。
该探针在水中的最大激发在482nm，适用于488nm激发下进行荧光成像。
一种488nm激发的免洗Halo-tag探针的合成方法，该荧光探针的合成方法及合成路线，如下：
Figure BDA0001911518620000022
具体合成步骤如下：
(1)中间体N-(2-(2-羟基)-乙氧基)乙基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺(OAN-NBr)的合成：
将4-溴-5-硝基-1,8-萘酐和二甘醇胺溶于无水乙醇中。将反应液加热至 40-90℃，搅拌1-10h；将反应液泠却至室温后，减压除去溶剂后，硅胶柱分离，以体积比为800-100:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，减压除去溶剂得米白色固体 N-2-(2-羟基)-乙氧基)乙基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(OAN-NBr)；
(2)中间体N-(2-(2-羟基)-乙氧基)乙基-4,5-二氮杂环丁基-1,8-萘酰亚胺(Halo-OH)的合成：
将中间体OAN-NBr溶于乙二醇甲醚中，并向其中加入氮杂环丁烷；将反应液缓慢升温至50-140℃，并在氮气保护下反应10-24h。减压除去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为400-30:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂，得棕黄色固体Halo-OH；
(3)Halo-tag探针(Halo-DAze)的合成：
将中间体Halo-OH与氢化钠置于史莱克瓶中，并氮气置换2-5次；将1-碘 -6-氯己烷溶于干燥的N,N-二甲基甲酰胺后，加入反应液中；室温下搅拌1-5h 后，减压除去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为400-100:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂得到靶向Halo-tag蛋白的荧光探针Halo-DAze。
步骤(1)中，4-溴-5-硝基-1,8-萘酐：二甘醇胺的质量比为3:1-12；
4-溴-5-硝基-1,8-萘酐的质量与无水乙醇的体积比为1:20-80g/mL。
步骤(2)中，中间体OAN-NBr：氮杂环丁烷的质量比为3:1-30；
中间体OAN-NBr的质量与乙二醇甲醚的体积比为1:100-600g/mL。
步骤(3)中，中间体Halo-OH：氢化钠的质量比为10:1-15；
中间体Halo-OH的质量与1-碘-6-氯己烷的体积比为6:2-15g/mL；
中间体Halo-OH的质量与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为1:100-250g/mL。
一种488nm激发的免洗Halo-tag探针能够特异性识别Halo-tag蛋白，在活细胞等复杂环境中实现对Halo-tag的免洗荧光成像。
一种488nm激发的免洗Halo-tag探针在活细胞及组织内对Halo-tag及其融合蛋白成像领域的应用。
一种488nm激发的免洗Halo-tag探针在Halo-tag蛋白的识别与检测领域的应用。
一种488nm激发的免洗Halo-tag探针在单分子检测中的应用。
一种488nm激发的免洗Halo-tag探针在STED及SIM超分辨成像中的应用。
本发明的Halo-tag探针拥有合成原料低廉、提纯简单等优点。该Halo-tag 探针分子在水中荧光量子产率均大于0.20，摩尔消光系数大于40000M-1cm-1，亮度高，光稳定性高于同波段的荧光素、罗丹明类染料。
该Halo-tag探针能够对活细胞内Halo-tag蛋白进行特异性识别，达到免洗荧光成像，信噪比高。此外，该探针可用于SIM等超分辨荧光成像。
该Halo-tag探针能够实现对活细胞内融合有Halo-tag的目标蛋白特异性标记，达到免洗荧光成像，在单分子检测、超分辨荧光成像等领域有较好的应用前景。
附图说明
图1为实施例1制备的Halo-DAze的核磁谱图氢谱。
图2为实施例1制备的Halo-DAze的高分辨质谱。
图3为实施例1制备的探针Halo-DAze在水中归一化的荧光激发光谱与荧光发射谱图，横坐标为波长，纵坐标为归一化强度，荧光染料的浓度为10μM。
图4为实施例1制备的探针Halo-DAze在500W钨灯照射下495nm处荧光强度随时间变化图，选取商业罗丹明123、荧光素作为参比染料，横坐标为时间，纵坐标为归一化荧光强度。
图5为实施例1制备的探针Halo-DAze在转染的pHALOf-H2B的HeLa细胞荧光共聚焦成像图，荧光探针的浓度为1μM。
图6为实施例1制备的探针Halo-DAze在在转染的Hela细胞SIM超分辨荧光成像图，荧光探针的浓度为1μM。
具体实施方式
实施例1
Halo-tag探针(Halo-DAze)的合成方法。
中间体N-(2-(2-羟基)-乙氧基)乙基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺(OAN-NBr) 的合成：
Figure BDA0001911518620000051
4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(2.00g，6.24mmol)溶于80mL乙醇中，并向其中滴加二甘醇胺(1.97g，18.7mmol)。70℃下2h后，减压蒸馏除去溶剂，残余物经硅胶柱(石油醚：二氯甲烷＝3-1:1，V/V)分离得米白色固体996mg，产率39％。其核磁谱图氢谱和碳谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3/DMSO-d6)δ8.70(d,J＝7.8Hz,1H),8.50(d,J＝ 7.9Hz,1H),8.28(d,J＝7.9Hz,1H),8.13(d,J＝7.8Hz,1H),4.37(t,J＝5.9Hz, 2H),4.21(s,1H),3.78(t,J＝5.9Hz,2H),3.58(s,4H).
13C NMR(101MHz,CDCl3/DMSO)δ167.48,166.76,155.77,140.86,137.11, 136.25,135.21,130.44,128.84,128.34,127.29,125.60,77.28,72.13,65.73.
其高分辨质谱数据如下：
C16H14BrN2O6[M+H]+理论值：409.0035，实际值：409.0031。
中间体N-(2-(2-羟基)-乙氧基)乙基-4,5-二氮杂环丁基-1,8萘酰亚胺 (Halo-OH)的合成：
Figure BDA0001911518620000061
将中间体OAN-Br(50mg，0.12mmol)溶于20mL乙二醇甲醚中，并向其中加入氮杂环丁烷(200mg，3.5mmol)。将反应液缓慢加热至120℃，并反应 10h。减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝80:1， V/V)，得黄色固体25mg，产率52％。其核磁谱图氢谱和碳谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.37(d,J＝8.5Hz,2H),6.38(d,J＝8.5Hz,2H), 4.42(d,J＝5.3Hz,2H),4.09(s,8H),3.83(t,J＝5.4Hz,2H),3.68(s,4H),2.42(s, 4H).
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ164.74,155.77,133.31,133.16,109.85,107.84,106.39,72.18,68.91,61.94,55.25,38.99,16.89.
其高分辨质谱数据如下：
C22H26N3O4[M+H]+理论值：396.1923，实际值：396.1919。
Halo-tag探针(Halo-DAze)的合成：
Figure BDA0001911518620000071
将中间体Halo-OH(30mg，0.08mmol)与氢化钠(9mg，0.38mmol)置于10mL史莱克瓶中，用氮气置换三次。将20μL 1-碘-6-氯己烷溶于3mL干燥的DMF后，并加入反应液。室温下搅拌3h后减压除去溶剂，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝200:1，V/V)，得棕色固体20mg，产率50％。其核磁谱图氢谱如图1所示，氢谱和碳谱的具体数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.37(d,J＝8.5Hz,2H),6.38(d,J＝8.5Hz,2H), 4.41(t,J＝6.5Hz,2H),4.07(s,8H),3.78(t,J＝6.5Hz,2H),3.71–3.65(m,2H), 3.60–3.54(m,2H),3.43(t,J＝6.6Hz,2H),2.43(s,4H),2.02(dd,J＝14.1,7.1Hz, 2H),1.80–1.70(m,2H),1.54(dd,J＝13.8,6.9Hz,2H),1.41(dd,J＝15.2,7.8Hz, 2H).
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ164.41,155.61,133.22,132.94,110.11,108.02,107.86,106.32,77.22,71.21,70.13,68.21,54.55,38.61,33.56,29.70,26.74,25.42,25.38.
其高分辨质谱如图2所示，具体数据如下：
C28H37ClN3O4[M+H]+理论值：514.2473，实际值：514.2477。
经检测，其结构如上式Halo-DAze所示。其荧光性能如下：
将该染料溶解于DMSO溶液中，配制成浓度为2mM的母液，每次取20μL Halo-DAze母液加入4mL水中，配制成10μM的荧光染料测试液，进行荧光激发与发射光谱的测试。Halo-DAze在水中荧光激发与发射光谱图如图3所示：
Halo-DAze在水光发射波长在493nm左右，激发波长在482nm，该探针较为适合488nm激光激发下进行荧光成像。
实施例2
Halo-tag探针(Halo-DAze)的合成方法。
中间体N-(2-(2-羟基)-乙氧基)乙基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺(OAN-NBr) 的合成：
Figure BDA0001911518620000081
4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(1.75g，5.45mmol)溶于35mL乙醇中，并向其中滴加二甘醇胺(0.58g，5.55mmol)。40℃下10h后，减压蒸馏除去溶剂，残余物经硅胶柱(石油醚：二氯甲烷＝3-1:1，V/V)分离得米白色固体756mg，产率34％。
中间体N-(2-(2-羟基)-乙氧基)乙基-4,5-二氮杂环丁基-1,8萘酰亚胺 (Halo-OH)的合成：
Figure BDA0001911518620000091
将中间体OAN-Br(75mg，0.18mmol)溶于7.5mL乙二醇甲醚中，并向其中加入氮杂环丁烷(25mg，0.44mmol)。将反应液缓慢加热至50℃，并反应 24h。减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝80:1， V/V)，得黄色固体34mg，产率48％。
Halo-tag探针(Halo-DAze)的合成：
Figure BDA0001911518620000092
将中间体Halo-OH(48mg，0.12mmol)与氢化钠(4.8mg，0.21mmol) 置于10mL史莱克瓶中，用氮气置换三次。将16μL 1-碘-6-氯己烷溶于4.8mL干燥的N,N-二甲基甲酰胺后，并加入反应液。室温下搅拌1h后减压除去溶剂，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝200:1，V/V)，得棕色固体25mg，产率40％。
经检测，其结构如上式Halo-DAze所示。其荧光性能如下：
Halo-DAze在水光发射波长在493nm左右，激发波长在482nm，该探针较为适合488nm激光激发下进行荧光成像。
实施例3
Halo-tag探针(Halo-DAze)的合成方法。
中间体N-(2-(2-羟基)-乙氧基)乙基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺(OAN-NBr) 的合成：
Figure BDA0001911518620000101
4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(2.25g，7.02mmol)溶于225mL乙醇中，并向其中滴加二甘醇胺(9.0g，85.2mmol)。90℃下1h后，减压蒸馏除去溶剂，残余物经硅胶柱(石油醚：二氯甲烷＝3-1:1，V/V)分离得米白色固体1.044g，产率31％。
中间体N-(2-(2-羟基)-乙氧基)乙基-4,5-二氮杂环丁基-1,8萘酰亚胺 (Halo-OH)的合成：
Figure BDA0001911518620000111
将中间体OAN-Br(100mg，0.24mmol)溶于60mL乙二醇甲醚中，并向其中加入氮杂环丁烷(900mg，15.7mmol)。将反应液缓慢加热至140℃，并反应12h。减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝ 80:1，V/V)，得黄色固体42mg，产率44％。
Halo-tag探针(Halo-DAze)的合成：
Figure BDA0001911518620000112
将中间体Halo-OH(60mg，0.16mmol)与氢化钠(90mg，3.8mmol)置于10mL史莱克瓶中，用氮气置换三次。将150μL 1-碘-6-氯己烷溶于15mL干燥的N,N-二甲基甲酰胺后，并加入反应液。室温下搅拌5h后减压除去溶剂，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝200:1，V/V)，得棕色固体29mg，产率35％。
经检测，其结构如上式Halo-DAze所示，其荧光性能如下：
Halo-DAze在水光发射波长在493nm左右，激发波长在482nm，该探针较为适合488nm激光激发下进行荧光成像。
实施例4
Halo-DAze在500W钨灯照射下荧光强度随时间变化测试。取20μL BuAN-DAze及商业染料母液加入4mL PBS(磷酸缓冲液，pH＝7.4)中，而后加入螺纹比色皿中，正面放置于钨灯50cm处，分别采取0,1,2,3,4,6,8,10h 为时间节点进行荧光光谱测试，并选取各自染料荧光发射峰值对时间进行曲线图。
Halo-DAze在500W钨灯照射下荧光强度随时间变化图如图4所示： Halo-DAze荧光强度在光照10h后仍然能够保持较高强度(96％)，而商业罗丹明123、荧光素等荧光强度均大幅降低，这说明Halo-DAze光稳定性极高，有望用于超分辨荧光成像。
实施例5
探针Halo-DAze在转染细胞中荧光共聚焦成像及超分辨成像。取0.5μL Halo-DAze母液溶于1mL培养液中，而后置于37℃下孵育30分钟后进行荧光成像。激发波长为488nm，采集为500-550nm。
探针Halo-DAze在转染细胞中荧光共聚焦及超分辨成像图如图5、6所示：
通过Halo-H2B诱导Hela细胞表达融合有Halo-tag的H2B。探针能够对融合有Halo-tag的H2B进行特异性标记，达到对细胞核免洗成像，细胞核轮廓清晰，信噪比较高。
1μM探针Halo-DAze通道染色效果图(采集500-550nm)探针能够对融合有Halo-tag的H2B进行特异性标记，染料稳定性的提升使其能够应用于SIM成像，达到更高的分辨率。

Claims (9)

1.一种488nm激发的免洗Halo-tag探针，其特征在于该探针的结构如下所示：
Figure FDA0003414091130000011
2.一种如权利要求1所述的一种488nm激发的免洗Halo-tag探针的合成方法，其特征在于包含步骤如下：
(1)中间体
Figure FDA0003414091130000012
的合成：
将4-溴-5-硝基-1,8-萘酐和二甘醇胺溶于无水乙醇中；将反应液加热至40-90℃，搅拌1-10h；将反应液冷却至室温后，减压除去溶剂后，硅胶柱分离，以体积比为800-100:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，减压除去溶剂得米白色固体
Figure FDA0003414091130000013
(2)中间体
Figure FDA0003414091130000021
的合成：
将中间体
Figure FDA0003414091130000022
溶于乙二醇甲醚中，并向其中加入氮杂环丁烷；将反应液缓慢升温至50-140℃，并在氮气保护下反应10-24h；减压除去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为400-30:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂，得棕黄色固体
Figure FDA0003414091130000023
(3)Halo-tag探针的合成：
将中间体
Figure FDA0003414091130000031
与氢化钠置于史莱克瓶中，并氮气置换2-5次；将1-碘-6-氯己烷溶于干燥的N,N-二甲基甲酰胺后，加入反应液中；室温下搅拌1-5h后，减压除去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为400-100:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂得到免洗Halo-tag探针。
3.根据权利要求2所述的一种488nm激发的免洗Halo-tag探针的合成方法，其特征在于步骤(1)中，4-溴-5-硝基-1,8-萘酐：二甘醇胺的质量比为3:1-12；
4-溴-5-硝基-1,8-萘酐的质量与无水乙醇的体积比为1:20-80g/mL。
4.根据权利要求2所述的一种488nm激发的免洗Halo-tag探针的合成方法，其特征在于步骤(2)中，中间体
Figure FDA0003414091130000032
氮杂环丁烷的质量比为3:1-30；
中间体
Figure FDA0003414091130000033
的质量与乙二醇甲醚的体积比为1:100-600g/mL。
5.根据权利要求2所述的一种488nm激发的免洗Halo-tag探针的合成方法，其特征在于步骤(3)中，中间体
Figure FDA0003414091130000041
氢化钠的质量比为10:1-15；
中间体
Figure FDA0003414091130000042
的质量与1-碘-6-氯己烷的体积比为6:2-15g/mL；
中间体
Figure FDA0003414091130000043
的质量与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为1:100-250g/mL。
6.一种如权利要求1所述的一种488nm激发的免洗Halo-tag探针在活细胞及组织内对Halo-tag及其融合蛋白成像领域的应用。
7.一种如权利要求1所述的488nm激发的免洗Halo-tag探针在Halo-tag蛋白的识别与检测领域的应用。
8.一种如权利要求1所述的488nm激发的免洗Halo-tag探针在单分子检测中的应用。
9.一种如权利要求1所述的488nm激发的免洗Halo-tag探针在STED及SIM超分辨成像中的应用。
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