CN111334083B - 一类高亮度、高稳定性的活性荧光染料及其合成和应用 - Google Patents

一类高亮度、高稳定性的活性荧光染料及其合成和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一类高亮度、高稳定性的活性荧光染料及其合成和应用，该染料通过萘酰亚胺4,5‑位刚性环的引入达到了荧光稳定性、亮度得到大幅度提升，其结构如图(1)所示。该类染料荧光亮度高，半峰宽窄(最高可达25nm)，对pH、黏度、温度、极性等均不敏感，在不同微环境下该类染料能够保持荧光信号的稳定性。此外，通过内酰胺位置可以简单实现多种活性基团的引入，以通过多种方式达到对目标分子的标记，这类染料能够广泛应用于生物大分子、纳米颗粒等荧光标记中。

Description

一类高亮度、高稳定性的活性荧光染料及其合成和应用
技术领域
本发明属于荧光标记领域，具体涉及一类高亮度、高稳定性的活性荧光染料及其合成和应用。
背景技术
有机小分子荧光染料作为历史最为久远的荧光材料在基于荧光分析法的相关研究中的应用已逐渐趋于成熟。由于具有尺寸小、化学修饰多样性和简易性、荧光发射光谱宽泛、可选择荧光颜色多样等优点，在荧光领域有机小分子荧光染料逐渐成为荧光蛋白的替代者。从作用方式的角度考虑，荧光染料在生物领域的应用主要分为荧光识别和荧光标记两类。荧光识别是将目标分析物的识别信息转变成荧光信号为外界所感知，其中的荧光响应机制至关重要，决定着荧光识别的准确性与灵敏度；荧光标记中则要求染料在标记目标物后荧光信号稳定且不受外界干扰。
目前，商业化用于荧光标记的荧光染料主要为罗丹明、花菁染料、荧光素类染料，窄的吸收与发射峰、溶剂不敏感、斯托克斯位移小、高摩尔消光系数及高量子产率等特点。然而，不同类型的染料母体都带有电荷，这也给各自带来巨大缺陷：荧光素分子负离子容易被氧化为淬灭，不易穿透细胞膜；花菁染料的聚甲炔链极易被单线态氧进攻，烯烃的扭转导致量子产率降低；罗丹明类染料极易非特异性标记线粒体等。此外，这类染料的改造较为复杂，染料与目标物连接所需的活性基团(如：NHS，羧基，氨基，叠氮等)不易引入。随着荧光染料在超分辨技术及单分子检测中的逐步应用，其稳定性、亮度仍亟需进一步提高，实现标记方式的多样性、分子的简化。
发明内容
本发明的目的之一是提供一类高亮度、高稳定性的活性荧光染料，该类染料为不带电荷中性分子，荧光亮度、稳定性高，带有NHS、四嗪、羧基、氨基、叠氮、炔基等活性基团以便于荧光标记。
本发明的另一目的是提供一类高亮度、高稳定性的活性荧光染料的合成方法，该方法简单易操作、分离简单、通用性好等优点。
本发明提供一类高亮度、高稳定性的活性荧光染料，通过萘酰亚胺4,5-位刚性环引入达到荧光稳定性、亮度得到大幅度提升。该类染料亮度高、半峰宽窄等优势的同时保持自身不带电荷的特性，对多种微环境变化均不敏感，保持了荧光信号的准确性。
一类高亮度、高稳定性的活性荧光染料，具有如下结构：
Figure BDA0001910611140000021
R1为
Figure BDA0001910611140000022
中的一种；
R2为
Figure BDA0001910611140000023
Figure BDA0001910611140000024
中的一种；
其中n为0-2整数。
一类高亮度、高稳定性的活性荧光染料，其优选结构如下：
Figure BDA0001910611140000031
R1为
Figure BDA0001910611140000032
中的一种；
其中n为0-2整数。
上述高亮度、高稳定性含活性酯的荧光染料合成路线，如下：
Figure BDA0001910611140000033
具体合成步骤如下：
(1)中间体N-(1-酯基)烷基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺的合成：
将4-溴-5-硝基-1,8-萘酐，1-氨基烷基酸乙酯，三乙胺溶于无水乙醇中。将反应液加热至40-90℃，搅拌1-24h。将反应液泠却至室温后，减压除去溶剂后，硅胶柱分离，以体积比为1:6-4:1的二氯甲烷和石油醚或体积比为1:0～0.01的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，减压除去溶剂得米白色固体N-(1-酯基)烷基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺；
(2)探针N-(1-酯基)烷基-4,5-二脂肪胺基-1,8-萘酰亚胺的合成：
将N-(1-酯基)烷基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺，溶于乙二醇甲醚中，并向其中依次加入脂肪环胺。将反应液缓慢升温至100-140℃，并在氮气保护下反应10-24h。减压除去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为50～400:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂，得棕黄色固体N-(1-酯基)烷基-4,5-二脂肪胺基-1,8-萘酰亚胺。
(3)中间体N-(1-羧基)烷基-4,5-二脂肪胺基-1,8-萘酰亚胺系列化合物
N-(1-酯基)烷基-4,5-二脂肪胺基-1,8-萘酰亚胺系列化合物溶于甲醇中，并向反应液中滴加2M氢氧化钠溶液。室温下反应1-3h后，减压蒸馏除去甲醇，过滤并用水洗涤滤饼干燥后得N-(1-羧基)烷基-4,5-二脂肪胺基-1,8-萘酰亚胺系列化合物；
(4)带有NHS活性基团的荧光染料合成
将N-(1-羧基)烷基-4,5-二脂肪胺基-1,8-萘酰亚胺系列化合物，DCC溶于干燥的N,N-二甲基甲酰胺后，室温搅拌10-40min。N-羟基琥珀酰亚胺溶于1mL干燥的N,N-二甲基甲酰胺并加入反应液中。2-5h后减压除去溶剂，硅胶柱分离，以体积比4～20:1的二氯甲烷和乙酸乙酯为洗脱剂，除去溶剂后得NHS活性基团的荧光染料染料；
步骤(1)中，4-溴-5-硝基-1,8-萘酐、1-氨基烷基酸乙酯、三乙胺的质量比为1:1-3:1-3；4-溴-5-硝基-1,8-萘酐的质量与乙醇的体积比为1:20-80g/mL；
步骤(2)中，N-(1-酯基)烷基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺与脂肪环胺的质量比为1:0.5-3；N-烷基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺的质量与乙二醇甲醚的体积比为10-20:1mg/mL；
所述脂肪环胺为氮丙啶、氮杂环丁烷、四氢吡咯、环己二胺；
步骤(3)中，N-(1-酯基)烷基-4,5-二脂肪胺基-1,8-萘酰亚胺系列化合物的质量与甲醇的体积比为10-20:1mg/mL；N-(1-酯基)烷基-4,5-二脂肪胺基-1,8-萘酰亚胺系列化合物的质量与2M氢氧化钠溶液的体积比为10-20:1mg/mL；；N-(1-酯基)烷基-4,5-二脂肪胺基-1,8-萘酰亚胺系列化合物的质量与水的体积比为10-20:1mg/mL；
步骤(4)中，N-(1-羧基)烷基-4,5-二脂肪胺基-1,8-萘酰亚胺系列化合物、DCC、NHS质量比为1:1-5:1-10；N-(1-羧基)烷基-4,5-二脂肪胺基-1,8-萘酰亚胺系列化合物的质量与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为10-20:1mg/mL；
一类高亮度、高稳定性的活性荧光染料，其优选结构如下：
Figure BDA0001910611140000051
R1为
Figure BDA0001910611140000052
中的一种；
其中n为0-2整数。
上述高亮度、高稳定性含叠氮活性基团的荧光染料的合成路线如下：
Figure BDA0001910611140000053
具体步骤如下：
(5)中间体N-叠氮基烷基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺的合成：
将4-溴-5-硝基-1,8-萘酐，叠氮基脂肪胺溶于无水乙醇中。将反应液加热至40-90℃，搅拌1-24h。将反应液泠却至室温后，减压除去溶剂后，硅胶柱分离，以体积比为1:0.25～6的二氯甲烷和石油醚或体积比为1:0～0.01的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，减压除去溶剂得米白色固体N-叠氮基烷基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺；
(6)探针N-叠氮基烷基-4,5-二脂肪胺基-1,8-萘酰亚胺的合成：
将N-叠氮基烷基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺，溶于乙二醇甲醚中，并向其中依次加入脂肪环胺。将反应液缓慢升温至100-140℃，并在氮气保护下反应10-24h。减压除去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为50～400:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂，得棕黄色固体N-叠氮基烷基-4,5-二脂肪胺基-1,8-萘酰亚胺。
步骤(5)中，4-溴-5-硝基-1,8-萘酐、叠氮基脂肪胺的质量比为1:1-3；4-溴-5-硝基-1,8-萘酐的质量与乙醇的体积比为1:20-80g/mL；
步骤(6)中，N-叠氮基烷基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺与脂肪环胺的质量比为1:0.5-3；N-叠氮基烷基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺的质量与乙二醇甲醚的体积比为10-20:1mg/mL；
所述脂肪环胺为氮丙啶、氮杂环丁烷、四氢吡咯、环己二胺。
一类高亮度、高稳定性的活性荧光染料，其优选结构如下：
Figure BDA0001910611140000061
R1为
Figure BDA0001910611140000062
中的一种；
其中n为0-2整数。
上述含氨基活性基团系列荧光染料合成路线，如下：
Figure BDA0001910611140000071
具体合成步骤如下：
(7)中间体N-(三氟乙酰氨基)烷基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺的合成：
将4-溴-5-硝基-1,8-萘酐，(三氟乙酰氨基)脂肪胺溶于无水乙醇中。将反应液加热至40-90℃，搅拌1-24h。将反应液泠却至室温后，减压除去溶剂后，硅胶柱分离，以体积比为1:0.25～6的二氯甲烷和石油醚或体积比为1:0～0.01的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，减压除去溶剂得米白色固体N-(三氟乙酰氨基)烷基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺；
(8)N-(三氟乙酰氨基)烷基-4,5-二脂肪胺基-1,8-萘酰亚胺的合成：
将N-叠氮基烷基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺，溶于乙二醇甲醚中，并向其中依次加入脂肪环胺。将反应液缓慢升温至100-140℃，并在氮气保护下反应10-24h。减压除去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为50～400:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂，得棕黄色固体N-(三氟乙酰氨基)烷基-4,5-二脂肪胺基-1,8-萘酰亚胺。
(9)带有氨基活性基团的荧光染料合成
将三氟乙酰基取代的染料溶于甲醇中，并向其中加入碳酸钾。将反应液缓慢加热至50-90℃，并反应2-10h。减压除去甲醇，残余物经硅胶柱分离残余物，得深黄色固体带有氨基活性基团的荧光染料Am-DR1；
步骤(7)中，4-溴-5-硝基-1,8-萘酐、(三氟乙酰氨基)脂肪胺的质量比为1:1-3；4-溴-5-硝基-1,8-萘酐的质量与乙醇的体积比为1:20-80g/mL；
步骤(8)中，N-(三氟乙酰氨基)烷基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺与脂肪环胺的质量比为1:0.5-3；N-(三氟乙酰氨基)烷基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺的质量与乙二醇甲醚的体积比为10-20:1mg/mL；
所述脂肪环胺为氮丙啶、氮杂环丁烷、四氢吡咯、环己二胺；
步骤(9)中，三氟乙酰基取代的染料与碳酸钾质量比为1:2-5；三氟乙酰基取代的染料的质量与甲醇的体积比为1：0.1-0.5mg/mL；
一类高亮度、高稳定性的活性荧光染料，其优选结构如下：
Figure BDA0001910611140000081
R1为
Figure BDA0001910611140000082
中的一种；
上述含炔基活性基团系列荧光染料合成路线，如下：
Figure BDA0001910611140000083
具体合成步骤如下：
(10)中间体N-(O-羟乙基)羟乙基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺的合成：
将4-溴-5-硝基-1,8-萘酐，二甘醇胺溶于无水乙醇中。将反应液加热至40-90℃，搅拌1-24h。将反应液泠却至室温后，减压除去溶剂后，硅胶柱分离，以体积比为1:6-4:1的二氯甲烷和石油醚或体积比为1:0～0.01的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，减压除去溶剂得米白色固体N-(O-羟乙基)羟乙基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺；
(11)N-(O-羟乙基)羟乙基-4,5-二脂肪胺基-1,8-萘酰亚胺的合成：
将N-(O-羟乙基)羟乙基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺，溶于乙二醇甲醚中，并向其中依次加入脂肪环胺。将反应液缓慢升温至100-140℃，并在氮气保护下反应10-24h。减压除去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为50～400:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂，得棕黄色固体N-(O-羟乙基)羟乙基-4,5-二脂肪胺基-1,8-萘酰亚胺。
(12)带有炔基活性基团的荧光染料合成
将N-(O-羟乙基)羟乙基-4,5-二脂肪胺基-1,8-萘酰亚胺与置于史莱克瓶中，并氮气置换2-5次。将溴丙炔溶于干燥的N,N-二甲基甲酰胺后，加入反应液中。室温下搅拌1-5h后，减压除去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为100～400:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂得到含炔基活性基团系列荧光染料；
步骤(10)中，4-溴-5-硝基-1,8-萘酐、二甘醇胺的质量比为1:1-3；4-溴-5-硝基-1,8-萘酐的质量与乙醇的体积比为1:20-80g/mL；
步骤(11)中，N-(O-羟乙基)羟乙基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺与脂肪环胺的质量比为1:0.5-3；N-(O-羟乙基)羟乙基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺的质量与乙二醇甲醚的体积比为10-20:1mg/mL；
所述脂肪环胺为氮丙啶、氮杂环丁烷、四氢吡咯、环己二胺；
步骤(12)中，N-(O-羟乙基)羟乙基-4,5-二脂肪胺基-1,8-萘酰亚胺与NaH的质量比为2-10:1；N-(O-羟乙基)羟乙基-4,5-二脂肪胺基-1,8-萘酰亚胺的质量与溴丙炔的体积比为1:0.5-1mg/μL；N-(O-羟乙基)羟乙基-4,5-二脂肪胺基-1,8-萘酰亚胺的质量与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为10-15:1mg/mL。
上述一类高亮度、高稳定性的活性荧光染料能够通过羧酸与酰胺的缩合、click等反应对目标物进行稳定的荧光标记，该类染料荧光亮度高、稳定性强，在荧光成像、标记领域有较大应用前景。
一类高亮度、高稳定性的活性荧光染料通过羧酸与酰胺的缩合、click反应对目标物进行稳定的荧光标记。
一类高亮度、高稳定性的活性荧光染料用于荧光成像。
本发明具有以下特征：
本发明涉及的荧光染料拥有合成原料低价、方法通用、便于引入功能基团等优点。
本发明涉及的荧光染料4,5-位刚性结构的引入使荧光量子产率大幅升，水中量子产率在0.80以上，荧光半峰宽变窄，水中摩尔消光系数达到40000M-1/cm-1以上。
本发明涉及的荧光染料能够通过羧酸与酰胺的缩合、click等反应达到对生物大分子的稳定荧光标记。
本发明涉及的荧光染料对于温度、黏度、极性等微环境均不敏感，能够最大限度保持荧光信号的准确性。
附图说明
图1实施例1制备的COOH-DAze的核磁谱图氢谱。
图2实施例6制备的NHSB-DAC的核磁谱图氢谱。
图3实施例9制备的EDA-DAC的核磁谱图氢谱。
图4实施例10制备的OAN-DAze的核磁谱图氢谱。
图5实施例11制备的OAN-DAC的核磁谱图氢谱。
图6实施例1制备的探针COOH-DAze在不同溶剂中的荧光发射光谱图，横坐标为波长，纵坐标为归一化荧光强度，荧光染料的浓度为10μM。
图7实施例1制备的探针COOH-DAze在不同溶剂中的紫外吸收光谱图，横坐标为波长，纵坐标为归一化吸收强度，荧光染料的浓度为10μM。
图8实施例6制备的探针NHSB-DAC标记的细胞内骨架结构的荧光共聚焦成像图。
具体实施方式
实施例1
COOH-DAze的合成
中间体2-(N-(4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺))氨基乙酸乙酯(COMe-NBr)的合成
Figure BDA0001910611140000111
4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(1.00g,3.11mmol)溶于80mL乙醇中，并向其中加入甘氨酸乙酯盐酸盐(1000mg，7.17mmol)与1.00g三乙胺。90℃下反应24h后，减压蒸馏除去溶剂，残余物经硅胶柱(二氯甲烷：石油醚＝3:1，V/V)分离得白色固体962mg，产率76％。其核磁谱图数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.73(d,J＝7.8Hz,1H),8.53(d,J＝7.9Hz,1H),8.24(d,J＝7.9Hz,1H),7.94(d,J＝7.8Hz,1H),4.92(s,2H),4.26(q,J＝7.1Hz,2H),1.31(t,J＝7.1Hz,3H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ167.36,162.48,161.75,151.56,136.06,132.66,131.64,130.74,125.26,124.71,123.60,122.00,121.35,61.94,41.64,14.16.
其高分辨质谱数据如下：高分辨质谱理论值C16H12BrN2O6[M+H]+406.9879,实测值406.9888.
COOH-DAze的合成
Figure BDA0001910611140000121
(1)COMe-DAze的合成
将COMe-NBr(200mg，0.49mmol)溶于10mL乙二醇甲醚中，并向其中加入氮杂环丁烷400mg。将反应液缓慢加热至120℃，并反应10h。减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝100:1，V/V)，得深黄色固体60mg，产率31％。其核磁谱图数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.74(d,J＝7.9Hz,1H),8.54(d,J＝7.7Hz,1H),8.24(d,J＝7.9Hz,1H),7.94(d,J＝7.8Hz,1H),4.93(s,2H),4.23(q,J＝7.2Hz,2H),4.19–3.90(m,8H),2.43(s,4H),1.32(t,J＝7.2Hz,3H).
(2)COOH-DAze的合成
COMe-DAze(40mg,0.10mmol)溶于4mL甲醇中，并向反应液中缓慢滴加2M氢氧化钠溶液4mL。滴加完毕后，反应液在室温下反应1h后，减压蒸馏除去甲醇，浑浊液过滤并用4mL水洗涤滤饼干燥后得COOH-DAze 32mg，产率86％。实施例1制备的COOH-DAze核磁谱图氢谱如图1所示，具体数据如下:
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.15(d,J＝8.3Hz,2H),6.48(d,J＝8.3Hz,2H),4.49(s,2H),4.06(s,8H),2.39(s,4H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ163.49,155.72,133.21,132.50,109.02,107.32,106.59,54.80,43.24,16.81.
其高分辨质谱数据如下：高分辨质谱理论值C20H20N3O4[M+H]+366.1454,实测值366.1440.
经检测，其结构如上式COOH-DAze所示，其荧光性能如下：
将COOH-DAze溶解于DMSO溶液中，配制成2mM母液，根据需要配制成不同浓度测试溶液，以检测其荧光光谱及紫外吸收光谱。
COOH-DAze在乙腈、二氯甲烷、二甲基亚砜、乙醇、水中荧光发射光谱与紫外吸收光谱测试。每次取20μL COOH-DAze母液加入4mL乙腈、二氯甲烷、二甲基亚砜、乙醇、水中，配制成10μM的荧光染料测试液，进行荧光发射光谱与紫外吸收光谱的测试。
COOH-DAze在乙腈、二氯甲烷、二甲基亚砜、乙醇、水中荧光发射光谱如图6所示：COOH-DAze在不同溶剂中的发射波长为480-495nm，荧光发射半峰宽小于35nm，且荧光波长不随极性变化而变化。
COOH-DAze在乙腈、二氯甲烷、二甲基亚砜、乙醇、水中紫外吸收光谱如图7所示：COOH-DAze在不同溶剂中的紫外吸收波长为470-485nm，吸收波长不随极性变化而变化，能够尽可能保持荧光信号稳定性。
实施例2
COOH-DAC的合成
Figure BDA0001910611140000141
(1)COMe-DAC的合成
将COMe-NBr(200mg，0.49mmol)溶于20mL乙二醇甲醚中，并向其中加入1,2-环己二胺400mg。将反应液缓慢加热至100℃，并反应12h。减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝80:1，V/V)，得深黄色固体124mg，产率64％。
其高分辨质谱数据如下：高分辨质谱理论值C22H24N3O4[M+H]+394.1767,实测值394.1788.
(2)COOH-DAC的合成
COMe-DAC(60mg,0.10mmol)溶于3mL甲醇中，并向反应液中缓慢滴加2M氢氧化钠溶液3mL。滴加完毕后，反应液在室温下反应3h后，减压蒸馏除去甲醇，浑浊液过滤并用3mL水洗涤滤饼干燥后得COOH-DAC46mg，产率83％。其核磁谱图氢谱与碳谱数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.72(s,1H),8.03(d,J＝8.6Hz,2H),7.59(s,2H),6.84(d,J＝8.7Hz,2H),4.62(s,2H),3.16(d,J＝5.9Hz,2H),2.20(d,J＝11.7Hz,2H),1.73(d,J＝6.9Hz,2H),1.31(dt,J＝31.3,16.1Hz,4H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ170.62,163.06,154.85,135.08,133.45,110.71,107.28,106.37,59.46,41.02,32.06,23.62.
其高分辨质谱数据如下：高分辨质谱理论值C20H20N3O4[M+H]+366.1454,实测值652.3109.
经检测，其结构如上式COOH-DAC所示，其在水中紫外吸收波长为481nm，荧光发射波长为489nm，荧光量子产率高达0.80。
实施例3
BCOOH-DAC的合成
中间体6-(N-(4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺))氨基丁酸乙酯(BCOMe-NBr)的合成
Figure BDA0001910611140000151
4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(1.00g,3.11mmol)溶于80mL乙醇中，并向其中加入4-氨基丁酸乙酯盐酸盐(1.00g，6.21mmol)与3.00g三乙胺。80℃下反应10h后，减压蒸馏除去溶剂，残余物经硅胶柱(二氯甲烷：石油醚＝3:1，V/V)分离得白色固体608mg，产率45％。其核磁谱图氢谱与碳谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.71(d,J＝7.8Hz,1H),8.52(d,J＝7.9Hz,1H),8.22(d,J＝7.9Hz,1H),7.93(d,J＝7.8Hz,1H),4.25(t,J＝7.1Hz,2H),4.10(q,J＝7.1Hz,2H),2.44(t,J＝7.4Hz,2H),2.09(p,J＝7.3Hz,2H),1.24(t,J＝7.1Hz,3H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ172.72,162.85,162.09,151.33,136.00,132.40,131.30,130.57,125.65,124.24,123.56,122.36,121.24,60.53,40.11,31.82,23.20,14.23.
其高分辨质谱数据如下：高分辨质谱理论值C18H16BrN2O6[M+H]+435.0192,实测值435.0193.
BCOOH-DAC的合成
Figure BDA0001910611140000161
(1)BCOMe-DAC的合成
将BCOMe-NBr(200mg，0.46mmol)溶于10mL乙二醇甲醚中，并向其中加入1,2-环己二胺600mg。将反应液缓慢加热至100℃，并反应12h。减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝80:1，V/V)，得深黄色固体103mg，产率53％。其核磁谱图氢谱与碳谱数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.04(d,J＝8.6Hz,2H),7.51(s,2H),6.82(d,J＝8.7Hz,2H),4.00(dt,J＝14.1,5.3Hz,4H),3.14(d,J＝8.8Hz,2H),2.30(t,J＝7.5Hz,2H),2.19(d,J＝11.7Hz,2H),1.89–1.80(m,2H),1.73(d,J＝6.8Hz,2H),1.31(dt,J＝30.1,15.8Hz,4H),1.14(t,J＝7.1Hz,3H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ172.88,163.49,154.56,134.79,133.35,110.58,107.74,106.44,60.18,59.48,38.55,32.07,31.80,23.75,23.63,14.53.
其高分辨质谱数据如下：高分辨质谱理论值C24H28N3O4[M+H]+422.2080,实测值422.2108.
(2)BCOOH-DAC的合成
BCOMe-DAC(80mg,0.19mmol)溶于5mL甲醇中，并向反应液中缓慢滴加2M氢氧化钠溶液8mL。滴加完毕后，反应液在室温下反应1h后，减压蒸馏除去甲醇，浑浊液过滤并用5mL水洗涤滤饼干燥后得BCOOH-DAC 65mg，产率87％。其核磁谱图氢谱与碳谱数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.01(s,1H),8.04(d,J＝8.6Hz,2H),7.51(s,2H),6.82(d,J＝8.7Hz,2H),3.99(dd,J＝9.2,4.6Hz,2H),3.15(d,J＝9.1Hz,2H),2.21(dd,J＝16.7,9.3Hz,4H),1.88–1.76(m,2H),1.72(d,J＝8.0Hz,2H),1.42–1.19(m,4H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ174.48,163.50,154.57,134.79,133.36,110.58,107.76,106.47,59.50,47.97,33.82,32.08,31.90,25.79,24.93,23.86,23.63.
其高分辨质谱数据如下：高分辨质谱理论值C22H24N3O4[M+H]+394.1767,实测值394.1824.
经检测，其结构如上式BOOH-DAC所示，其在水中紫外吸收波长为481nm，荧光发射波长为489nm，荧光量子产率高达0.80。
实施例4
NHSM-DAze的合成
Figure BDA0001910611140000181
COOH-DAze(30mg,0.08mmol)与二环己基碳亚(DCC)(30mg,0.15mmol)溶于1mL N,N-二甲基甲酰胺中，并在室温下搅拌20min。N-羟基琥珀酰亚胺(100mg,0.87mmol)溶于3mLN,N-二甲基甲酰胺后，滴加至反应液。2h后减压除去溶剂，硅胶柱分离，以二氯甲烷：乙酸乙酯＝5:1为洗脱剂，除去溶剂得土黄色固体32mg，产率85％。其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.18(d,J＝8.2Hz,2H),6.38(d,J＝8.4Hz,2H),4.51(s,2H),4.06(b,8H),2.87(s,4H),2.39(s,4H).
经检测，其结构如上式NHSM-DAze所示，其在水中荧光发射波长为493nm，能够与活性氨基进行室温缩合。
实施例5
NHSM-DAC的合成
Figure BDA0001910611140000182
COOH-DAC(20mg,0.05mmol)与二环己基碳亚(DCC)(100mg,0.50mmol)溶于1mL N,N-二甲基甲酰胺中，并在室温下搅拌30min。N-羟基琥珀酰亚胺(200mg,1.74mmol)溶于2mLN,N-二甲基甲酰胺后，滴加至反应液。5h后减压除去溶剂，硅胶柱分离，以二氯甲烷：乙酸乙酯＝6:1为洗脱剂，除去溶剂得土黄色固体22mg，产率87％。其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.10–7.83(m,2H),7.56(s,2H),6.84(d,J＝8.7Hz,2H),4.25(s,2H),3.18(d,J＝9.1Hz,2H),2.82(s,4H),2.19(d,J＝11.4Hz,2H),1.73(d,J＝7.2Hz,2H),1.33(dt,J＝27.8,15.1Hz,4H).
经检测，其结构如上式NHSM-DAC所示，其在水中荧光发射波长为487nm，能够与活性氨基进行室温缩合。
实施例6
NHSB-DAC的合成
Figure BDA0001910611140000191
BCOOH-DAC(50mg,0.12mmol)与二环己基碳亚(DCC)(112mg,0.54mmol)溶于2mL N,N-二甲基甲酰胺中，并在室温下搅拌20min。N-羟基琥珀酰亚胺(200mg,1.74mmol)溶于2mLN,N-二甲基甲酰胺后，滴加至反应液。3h后减压除去溶剂，硅胶柱分离，以二氯甲烷：乙酸乙酯＝5:1为洗脱剂，除去溶剂得土黄色固体55mg，产率89％。实施例6制备的NHSB-DAC核磁谱图氢谱如图2所示，具体数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.19–7.93(m,2H),7.53(s,2H),6.83(d,J＝8.7Hz,2H),4.05(t,J＝6.5Hz,2H),3.15(d,J＝9.2Hz,2H),2.80(s,4H),2.72(t,J＝7.7Hz,2H),2.19(d,J＝11.4Hz,2H),1.97–1.88(m,2H),1.73(d,J＝7.2Hz,2H),1.31(dt,J＝28.8,15.2Hz,4H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ170.66,169.11,163.47,154.65,134.87,133.42,110.63,107.66,106.43,59.48,38.35,32.07,28.69,25.90,23.73,23.63.
其高分辨质谱数据如下：高分辨质谱理论值C26H27N4O6[M+H]+491.1931,实测值491.1981.
经检测，其结构如上式NHSB-DAC所示，其在水中荧光发射波长为487nm，能够与活性氨基进行室温缩合。
实施例7
NEAN-DAC的合成
中间体N-(3-叠氮)丙基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺(N3AN-NBr)的合成
Figure BDA0001910611140000201
4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(0.50g,1.56mmol)溶于10mL乙醇中，并向其中加入3-叠氮-正丙胺(500mg，5.00mmol)。60℃下反应1h后，减压蒸馏除去溶剂，残余物经硅胶柱(二氯甲烷：石油醚＝1:2，V/V)分离得黄色固体429mg，产率68％。其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.72(d,J＝7.8Hz,1H),8.52(d,J＝7.9Hz,1H),8.21(d,J＝7.9Hz,1H),7.95(d,J＝7.8Hz,1H),3.69(t,J＝6.5Hz,2H),2.28(t,J＝6.6Hz,2H),1.40(m,2H).
NEAN-DAC的合成
Figure BDA0001910611140000211
将NEAN-NBr(50mg，0.12mmol)溶于5mL乙二醇甲醚中，并向其中加入环己二胺100mg。将反应液缓慢加热至120℃，并反应12h。减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝100:1，V/V)，得黄色固体13mg，产率27％。其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.06(d,J＝8.7Hz,2H),7.48(s,2H),6.85(d,J＝8.6Hz,2H),4.02–3.79(m,2H),2.36(t,J＝7.0Hz,2H),2.21(d,J＝11.2Hz,2H),1.73-1.65(m,4H),1.54(dt,J＝14.9,7.6Hz,2H),1.30(dq,J＝14.3,7.2Hz,6H).
经检测，其结构如上式NEAN-DAC所示，其在水中荧光发射波长在487nm，可用于与炔基的生物正交反应。
实施例8
NEBAN-DAzi的合成
中间体N-(4-叠氮)丁基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺(N3BAN-NBr)的合成
Figure BDA0001910611140000221
4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(0.50g,1.56mmol)溶于50mL乙醇中，并向其中加入4-叠氮基-丁胺(300mg，2.63mmol)。40℃下反应2h后，减压蒸馏除去溶剂，残余物经硅胶柱(二氯甲烷：石油醚＝1:2，V/V)分离得黄色固体339mg，产率52％。其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.73(d,J＝7.7Hz,1H),8.52(d,J＝7.9Hz,1H),8.19(d,J＝7.7Hz,1H),7.98(d,J＝7.8Hz,1H),3.74(t,J＝6.4Hz,2H),2.32(t,J＝6.5Hz,2H),1.44(m,2H)，1.40(m,2H).
NEBAN-DAzi的合成
Figure BDA0001910611140000222
将N3BAN-NBr(80mg，0.19mmol)溶于5mL乙二醇甲醚中，并向其中加入氮丙啶40mg。将反应液缓慢加热至100℃，并反应24h。减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝150:1，V/V)，得黄色固体5mg，产率7％。其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.13(d,J＝8.7Hz,2H),6.11(d,J＝8.8Hz,2H),3.71(t,J＝6.5Hz,2H),2.52(s,8H),2.31(t,J＝6.6Hz,2H),1.43(m,2H)，1.40(m,2H).
经检测，其结构如上式NEBAN-DAzi所示，其在水中荧光发射波长在475nm，吸收波长为468nm，可用于与炔基的生物正交反应。
实施例9
EDA-DAC的合成
中间体N-(N-三氟乙酰基)胺乙基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺(CFAN-NBr)的合成
Figure BDA0001910611140000231
4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(1.00g,3.11mmol)溶于60mL乙醇中，并向其中加入N-三氟乙酰基乙二胺(1000mg，6.25mmol)。80℃下反应6h后，减压蒸馏除去溶剂，残余物经硅胶柱(二氯甲烷：石油醚＝3:1，V/V)分离得黄色固体1.02g，产率71％。其核磁谱图氢谱与碳谱数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.45(t,J＝5.9Hz,1H),8.65(d,J＝7.9Hz,1H),8.53–8.35(m,3H),4.23(t,J＝5.6Hz,2H),3.55(dd,J＝11.2,5.8Hz,2H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ163.33,162.61,157.26,156.91,150.69,136.75,132.30,131.41,130.53,126.38,124.97,123.17,122.93,120.34,117.69,39.45,37.51.
CFAN-DAC的合成
Figure BDA0001910611140000241
将CFAN-NBr(150mg，0.33mmol)溶于15mL乙二醇甲醚中，并向其中加入1,2-环己二胺400mg。将反应液缓慢加热至120℃，并反应10h。减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝100:1，V/V)，得深黄色固体73mg，产率50％。其核磁谱图氢谱与碳谱数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.46(s,1H),8.05(d,J＝8.4Hz,2H),7.52(s,2H),6.83(d,J＝8.6Hz,2H),4.16(s,2H),3.46(d,J＝4.8Hz,2H),3.16(s,2H),2.20(d,J＝10.7Hz,2H),1.73(s,2H),1.30(dd,J＝28.5,18.2Hz,4H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ163.68,156.68,154.59,134.95,133.35,110.56,107.83,106.50,59.52,38.24,38.19,32.08,23.64.
EDA-DAC的合成
Figure BDA0001910611140000242
将CFAN-DAC(50mg，0.11mmol)溶于5mL甲醇中，并向其中加入碳酸钾250mg。将反应液缓慢加热至70℃，并反应6h。减压除去甲醇，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝40:1，V/V)，得深黄色固体33mg，产率85％。实施例9制备的EDA-DAC的核磁谱图氢谱与碳谱如图3所示，具体数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.05(d,J＝8.6Hz,2H),7.57(s,2H),6.84(d,J＝8.7Hz,2H),4.12(t,J＝6.4Hz,2H),3.15(d,J＝8.8Hz,2H),2.91(t,J＝6.4Hz,2H),2.20(d,J＝11.5Hz,2H),1.73(d,J＝6.7Hz,2H),1.49–1.16(m,4H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ163.74,154.68,134.97,133.40,110.64,107.69,106.35,59.48,55.39,32.06,23.62.
经检测，其结构如上式NEBAN-DAzi所示，其在水中荧光发射波长在488nm，吸收波长为481nm，可用于与羧基、活性酯缩合。
实施例10
Pyne-DAze的合成
OAN-DAze的合成
Figure BDA0001910611140000251
将OAN-Br(50mg，0.12mmol)溶于20mL乙二醇甲醚中，并向其中加入氮杂环丁烷200mg。将反应液缓慢加热至120℃，并反应10h。减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝80:1，V/V)，得黄色固体25mg，产率52％。实施例10制备的OAN-DAze的核磁谱图氢谱如图4所示，具体数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.37(d,J＝8.5Hz,2H),6.38(d,J＝8.5Hz,2H),4.42(d,J＝5.3Hz,2H),4.09(s,8H),3.83(t,J＝5.4Hz,2H),3.68(s,4H),2.42(s,4H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ164.74,155.77,133.31,133.16,109.85,107.84,106.39,72.18,68.91,61.94,55.25,38.99,16.89.
高分辨质谱理论值C22H26N3O4[M+H]+396.1923,实测值396.1919.
经检测，其结构如上式OAN-DAze所示，其在水中荧光发射波长在493nm，吸收波长为484nm。
Pyne-DAze的合成
Figure BDA0001910611140000261
将OAN-DAze(30mg，0.08mmol)与NaH(15mg，0.63mmol)置于10mL史莱克瓶中，用氮气置换三次。将30μL溴丙炔溶于1mL干燥的DMF后，并加入反应液。室温下搅拌5h后减压除去溶剂，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝100:1，V/V)，得棕色固体5mg，产率15％。其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.36(d,J＝8.6Hz,2H),6.36(d,J＝8.5Hz,2H),4.42(t,J＝6.7Hz,2H),4.27(s,2H),4.05(s,8H),3.80(t,J＝6.6Hz,2H),3.70–3.63(m,2H),3.44(t,J＝6.6Hz,2H),3.11(s,1H),2.44(s,4H).
经检测，其结构如上式OAN-DAze所示，其在水中荧光发射波长在492nm，吸收波长为484nm，可用于与叠氮的生物正价反应。
实施例11
Pyne-DAC的合成
OAN-DAC的合成
Figure BDA0001910611140000271
将OAN-NBr(100mg，0.24mmol)溶于20mL乙二醇甲醚中，并向其中加入1,2-环己二胺300mg。将反应液缓慢加热至100℃，并反应12h。减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝70:1，V/V)，得黄色固体34mg，产率35％。实施例11制备的OAN-DAC的核磁谱图氢谱如图5所示，具体数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.04(d,J＝8.6Hz,21H),7.54(s,2H),6.83(d,J＝8.7Hz,2H),4.59(t,J＝4.7Hz,1H),4.15(t,J＝6.8Hz,2H),3.56(t,J＝6.8Hz,2H),3.46(s,4H),3.15(d,J＝9.4Hz,2H),2.20(d,J＝12.0Hz,2H),1.73(d,J＝7.2Hz,2H),1.43–1.22(m,4H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ163.43,154.65,134.84,133.40,110.63,107.62,106.40,72.53,67.69,60.66,59.48,46.17,32.07,23.63.
其高分辨质谱数据如下：高分辨质谱理论值C22H26N3O4[M+H]+396.1923,实测值396.1919.
经检测，其结构如上式OAN-DAC所示，其在水中荧光发射波长在488nm，吸收波长为481nm。
Pyne-DAC的合成
Figure BDA0001910611140000281
将OAN-DAC(30mg，0.08mmol)与NaH(3mg，0.13mmol)置于10mL史莱克瓶中，用氮气置换三次。将15μL溴丙炔溶于2mL干燥的DMF后，并加入反应液。室温下搅拌5h后减压除去溶剂，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝100:1，V/V)，得棕色固体7mg，产率21％。
其高分辨质谱数据如下：高分辨质谱理论值C25H28N3O4[M+H]+434.2080,实测值434.2108.
经检测，其结构如上式Pyne-DAC所示，其在水中荧光发射波长在487nm，吸收波长为480nm，可用于与叠氮的生物正交反应。
将该类染料分别溶解于DMSO溶液中，配制成不同染料的2mM母液，根据需要配制成不同浓度测试溶液，以检测其荧光、紫外光谱，蛋白标记及细胞内荧光成像。
实施例12
实施例6制备的荧光探针NHSB-DAC标记多克隆抗体并纯化。
NHSB-DAC母液10μL加入到含有多克隆抗体羊抗小鼠IgG(0.5mg/mL)的100μL溶液中，室温下静置1h，过葡聚糖凝胶柱G-25除去多余的荧光小分子。
实施例13
实施例6制备的NHSB-DAC标记多克隆抗体标记微管蛋白。将NHSB-DAC标记多克隆抗体溶于水溶液中配制成0.5mg/mL的母液备用。将Hela细胞(增殖表皮癌细胞)铺在培养皿中，皿中含有10％胎牛血清的DMED高糖培养基1mL，在37℃和5％二氧化碳条件下培养至细胞密度约为70％，用PBS缓冲液轻柔洗涤细胞2次后，用4％多聚甲醛固定30min，弃掉固定液用PBS洗3次，然后用0.2％的TritonX-100透化20min后用PBS洗3次，每次5min，然后用5％的BSA封闭液封闭20分钟后再用PBS洗3次。加入含有抗α-微管蛋白的单克隆抗体(约10μg/mL)的200μLPBS溶液，4℃孵育过夜。第二天用PBS洗3遍后加入含NHSB-DAC标记的多克隆抗体(约10μg/mL)的200μLPBS溶液，37℃孵育3小时。最后用PBS清洗3遍后在荧光共聚焦显微镜下成像。
细胞骨架结构共聚焦成像图如图6所示：NHSB-DAC标记的细胞骨架结构清晰，荧光背景较低。

Claims (23)

1.一类高亮度、高稳定性的活性荧光染料，其特征在于该荧光染料结构如下：
Figure FDA0003385628160000011
R1为
Figure FDA0003385628160000012
中的一种；
R2为
Figure FDA0003385628160000013
Figure FDA0003385628160000014
中的一种；
其中n为0-2整数。
2.如权利要求1所述的一类高亮度、高稳定性的活性荧光染料，其特征在于该荧光染料结构如下：
Figure FDA0003385628160000015
R1为
Figure FDA0003385628160000016
中的一种；
其中n为0-2整数。
3.如权利要求1所述的一类高亮度、高稳定性的活性荧光染料，其特征在于该荧光染料结构如下：
Figure FDA0003385628160000021
R1为
Figure FDA0003385628160000022
中的一种；
其中n为0-2整数。
4.如权利要求1所述的一类高亮度、高稳定性的活性荧光染料，其特征在于该荧光染料结构如下：
Figure FDA0003385628160000023
R1为
Figure FDA0003385628160000024
中的一种；
其中n为0-2整数。
5.如权利要求1所述的一类高亮度、高稳定性的活性荧光染料，其特征在于该荧光染料结构如下：
Figure FDA0003385628160000031
R1为
Figure FDA0003385628160000032
中的一种。
6.如权利要求2所述的一类高亮度、高稳定性的活性荧光染料的合成方法，其特征包含步骤如下：
(1)中间体N-(1-酯基)烷基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺的合成：
将4-溴-5-硝基-1,8-萘酐，1-氨基烷基酸乙酯，三乙胺溶于无水乙醇中；将反应液加热至40-90℃，搅拌1-24h；将反应液泠却至室温后，减压除去溶剂后，硅胶柱分离，以体积比为1:0.25～6的二氯甲烷和石油醚或体积比为1:0～0.01的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，减压除去溶剂得米白色固体N-(1-酯基)烷基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺；
(2)探针N-(1-酯基)烷基-4,5-二脂肪胺基-1,8-萘酰亚胺的合成：
将N-(1-酯基)烷基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺，溶于乙二醇甲醚中，并向其中依次加入脂环胺；将反应液缓慢升温至100-140℃，并在氮气保护下反应10-24h；减压除去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为50～400:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂，得棕黄色固体N-(1-酯基)烷基-4,5-二脂肪胺基-1,8-萘酰亚胺，
(3)中间体N-(1-羧基)烷基-4,5-二脂肪胺基-1,8-萘酰亚胺系列化合物
N-(1-酯基)烷基-4,5-二脂肪胺基-1,8-萘酰亚胺系列化合物溶于甲醇中，并向反应液中滴加2M氢氧化钠溶液，室温下反应1-3h后，减压蒸馏除去甲醇，过滤并用水洗涤滤饼干燥后得N-(1-羧基)烷基-4,5-二脂肪胺基-1,8-萘酰亚胺系列化合物；
(4)带有NHS活性基团的荧光染料合成
将N-(1-羧基)烷基-4,5-二脂肪胺基-1,8-萘酰亚胺系列化合物，DCC溶于干燥的N,N-二甲基甲酰胺后，室温搅拌10-40min；N-羟基琥珀酰亚胺溶于1mL干燥的N,N-二甲基甲酰胺并加入反应液中，2-5h后减压除去溶剂，硅胶柱分离，以体积比4～20:1的二氯甲烷和乙酸乙酯为洗脱剂，除去溶剂后得NHS活性基团的荧光染料。
7.根据权利要求6所述的一类高亮度、高稳定性的活性荧光染料的合成方法，其特征在于步骤(1)中，4-溴-5-硝基-1,8-萘酐、1-氨基烷基酸乙酯、三乙胺的质量比为1:1-3:1-3；4-溴-5-硝基-1,8-萘酐的质量与乙醇的体积比为1:20-80g/mL。
8.根据权利要求6所述的一类高亮度、高稳定性的活性荧光染料的合成方法，其特征在于步骤(2)中，N-(1-酯基)烷基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺与脂环胺的质量比为1:0.5-3；N-烷基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺的质量与乙二醇甲醚的体积比为10-20:1mg/mL；
所述脂环胺为氮丙啶、氮杂环丁烷、四氢吡咯、环己二胺。
9.根据权利要求6所述的一类高亮度、高稳定性的活性荧光染料的合成方法，其特征在于步骤(3)中，N-(1-酯基)烷基-4,5-二脂肪胺基-1,8-萘酰亚胺系列化合物的质量与甲醇的体积比为10-20:1mg/mL；N-(1-酯基)烷基-4,5-二脂肪胺基-1,8-萘酰亚胺系列化合物的质量与2M氢氧化钠溶液的体积比为10-20:1mg/mL；N-(1-酯基)烷基-4,5-二脂肪胺基-1,8-萘酰亚胺系列化合物的质量与水的体积比为10-20:1mg/mL。
10.根据权利要求6所述的一类高亮度、高稳定性的活性荧光染料的合成方法，其特征在于步骤(4)中，N-(1-羧基)烷基-4,5-二脂肪胺基-1,8-萘酰亚胺系列化合物、DCC、NHS质量比为1:1-5:1-10；N-(1-羧基)烷基-4,5-二脂肪胺基-1,8-萘酰亚胺系列化合物的质量与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为10-20:1mg/mL。
11.如权利要求3所述的一类高亮度、高稳定性的活性荧光染料的合成方法，其特征包含步骤如下：
(1)中间体N-叠氮基烷基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺的合成：
将4-溴-5-硝基-1,8-萘酐，叠氮基脂肪胺溶于无水乙醇中；将反应液加热至40-90℃，搅拌1-24h；将反应液泠却至室温后，减压除去溶剂后，硅胶柱分离，以体积比为1:0.25～6的二氯甲烷和石油醚或体积比为1:0～0.01的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，减压除去溶剂得米白色固体N-叠氮基烷基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺；
(2)探针N-叠氮基烷基-4,5-二脂肪胺基-1,8-萘酰亚胺的合成：
将N-叠氮基烷基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺，溶于乙二醇甲醚中，并向其中依次加入脂环胺；将反应液缓慢升温至100-140℃，并在氮气保护下反应10-24h；减压除去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为50～400:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂，得棕黄色固体N-叠氮基烷基-4,5-二脂肪胺基-1,8-萘酰亚胺。
12.根据权利要求11所述的一类高亮度、高稳定性的活性荧光染料的合成方法，其特征在于步骤(1)中，4-溴-5-硝基-1,8-萘酐、叠氮基脂肪胺的质量比为1:1-3；4-溴-5-硝基-1,8-萘酐的质量与乙醇的体积比为1:20-80g/mL。
13.根据权利要求11所述的一类高亮度、高稳定性的活性荧光染料的合成方法，其特征在于步骤(2)中，N-叠氮基烷基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺与脂环胺的质量比为1:0.5-3；N-叠氮基烷基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺的质量与乙二醇甲醚的体积比为10-20:1mg/mL；
所述脂环胺为氮丙啶、氮杂环丁烷、四氢吡咯、环己二胺。
14.如权利要求4所述的一类高亮度、高稳定性的活性荧光染料的合成方法，其特征包含步骤如下：
(1)中间体N-(三氟乙酰氨基)烷基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺的合成：
将4-溴-5-硝基-1,8-萘酐，(三氟乙酰氨基)脂肪胺溶于无水乙醇中；将反应液加热至40-90℃，搅拌1-24h；将反应液泠却至室温后，减压除去溶剂后，硅胶柱分离，以体积比为1:0.25～6的二氯甲烷和石油醚或体积比为1:0～0.01的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，减压除去溶剂得米白色固体N-(三氟乙酰氨基)烷基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺；
(2)N-(三氟乙酰氨基)烷基-4,5-二脂肪胺基-1,8-萘酰亚胺的合成：
将N-叠氮基烷基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺，溶于乙二醇甲醚中，并向其中依次加入脂环胺；将反应液缓慢升温至100-140℃，并在氮气保护下反应10-24h；减压除去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为50～400:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂，得棕黄色固体N-(三氟乙酰氨基)烷基-4,5-二脂肪胺基-1,8-萘酰亚胺；
(3)带有氨基活性基团的荧光染料合成
将三氟乙酰基取代的染料溶于甲醇中，并向其中加入碳酸钾；将反应液缓慢加热至50-90℃，并反应2-10h；减压除去甲醇，残余物经硅胶柱分离残余物，得深黄色固体带有氨基活性基团的荧光染料。
15.根据权利要求14所述的一类高亮度、高稳定性的活性荧光染料的合成方法，其特征在于步骤(1)中，4-溴-5-硝基-1,8-萘酐、(三氟乙酰氨基)脂肪胺的质量比为1:1-3；4-溴-5-硝基-1,8-萘酐的质量与乙醇的体积比为1:20-80g/mL。
16.根据权利要求14所述的一类高亮度、高稳定性的活性荧光染料的合成方法，其特征在于步骤(2)中，N-(三氟乙酰氨基)烷基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺与脂环胺的质量比为1:0.5-3；N-(三氟乙酰氨基)烷基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺的质量与乙二醇甲醚的体积比为10-20:1mg/mL；
所述脂环胺为氮丙啶、氮杂环丁烷、四氢吡咯、环己二胺。
17.根据权利要求14所述的一类高亮度、高稳定性的活性荧光染料的合成方法，其特征在于步骤(3)中，三氟乙酰基取代的染料与碳酸钾质量比为1:2-5；三氟乙酰基取代的染料的质量与甲醇的体积比为1：0.1-0.5mg/mL。
18.如权利要求5所述的一类高亮度、高稳定性的活性荧光染料的合成方法，其特征包含步骤如下：
(1)中间体N-(O-羟乙基)羟乙基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺的合成：
将4-溴-5-硝基-1,8-萘酐，二甘醇胺溶于无水乙醇中；将反应液加热至40-90℃，搅拌1-24h；将反应液泠却至室温后，减压除去溶剂后，硅胶柱分离，以体积比为1:0.25～6的二氯甲烷和石油醚或体积比为1:0～0.01的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，减压除去溶剂得米白色固体N-(O-羟乙基)羟乙基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺；
(2)N-(O-羟乙基)羟乙基-4,5-二脂肪胺基-1,8-萘酰亚胺的合成：
将N-(O-羟乙基)羟乙基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺，溶于乙二醇甲醚中，并向其中依次加入脂环胺；将反应液缓慢升温至100-140℃，并在氮气保护下反应10-24h；减压除去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为50～400:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂，得棕黄色固体N-(O-羟乙基)羟乙基-4,5-二脂肪胺基-1,8-萘酰亚胺；
(3)带有炔基活性基团的荧光染料合成
将N-(O-羟乙基)羟乙基-4,5-二脂肪胺基-1,8-萘酰亚胺与置于史莱克瓶中，并氮气置换2-5次；将溴丙炔溶于干燥的N,N-二甲基甲酰胺后，加入反应液中；室温下搅拌1-5h后，减压除去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为100～400:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂得到含炔基活性基团系列荧光染料。
19.根据权利要求18所述的一类高亮度、高稳定性的活性荧光染料的合成方法，其特征在于步骤(1)中，4-溴-5-硝基-1,8-萘酐、二甘醇胺的质量比为1:1-3；4-溴-5-硝基-1,8-萘酐的质量与乙醇的体积比为1:20-80g/mL。
20.根据权利要求18所述的一类高亮度、高稳定性的活性荧光染料的合成方法，其特征在于步骤(2)中，N-(O-羟乙基)羟乙基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺与脂环胺的质量比为1:0.5-3；N-(O-羟乙基)羟乙基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺的质量与乙二醇甲醚的体积比为10-20:1mg/mL；
所述脂环胺为氮丙啶、氮杂环丁烷、四氢吡咯、环己二胺。
21.根据权利要求18所述的一类高亮度、高稳定性的活性荧光染料的合成方法，其特征在于步骤(3)中，N-(O-羟乙基)羟乙基-4,5-二脂肪胺基-1,8-萘酰亚胺与NaH的质量比为2-10:1；N-(O-羟乙基)羟乙基-4,5-二脂肪胺基-1,8-萘酰亚胺的质量与溴丙炔的体积比为1:0.5-1mg/μL；N-(O-羟乙基)羟乙基-4,5-二脂肪胺基-1,8-萘酰亚胺的质量与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为10-15:1mg/mL。
22.一类如权利要求1所述的高亮度、高稳定性的活性荧光染料通过羧酸与酰胺的缩合、click反应对目标物进行稳定的荧光标记。
23.一类如权利要求1所述的高亮度、高稳定性的活性荧光染料用于荧光成像。
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