CN111333574B - 一类高亮度、高光稳定性的碳酸酐酶检测荧光探针 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一类高亮度、高光稳定性的碳酸酐酶检测荧光探针。该类荧光探针拥有合成原料低价、方法简单且易于衍生等优点。该荧光探针在保持萘酰亚胺这一中性分子基础上，在4‑、5‑位同时引入具有环张力基团以达到分子的对称性及供体部分的高刚性结构。研究表明，这类染料在乙醇中的摩尔消光系数最高可达36675M‑1cm‑1，在乙醇中的量子产率最高可达到0.615。这类碳酸酐酶荧光探针均有很高的亮度和优异的光稳定性、波长不敏感性，且细胞透膜性好，能够快速标记细胞内碳酸酐酶，可以用于检测和超分辨成像。

Description

一类高亮度、高光稳定性的碳酸酐酶检测荧光探针
技术领域
本发明属于荧光成像技术领域，具体涉及一类高亮度、高光稳定性的碳酸酐酶检测荧光探针。
背景技术
碳酸酐酶是一种含Zn2+的金属酶，研究表明其在生物体内承担着多种生理学功能，并参与多种癌症的发生和发展。近年来高速发展的超分辨荧光成像技术可以提供纳米尺度及单分子水平的分辨率，极大地推动了生命科学领域的进步。
超分辨荧光成像技术在给生命科学的研究提供了极大的便利的同时，也对荧光染料的光性能提出了更高层次的要求。在高功率的激光照射下，染料需要有足够的亮度才能使发出的荧光信号被检测到，此外还需要光稳定性才能在长时间的观测中不被漂白，现有的荧光染料大多难以满足这样苛刻的要求。例如传统的染料母体4-氨基萘酰亚胺的亮度和光稳定性均有待提升，将4-位的氨基替换为有较强环张力的氮杂环丁烷结构使染料在水中的荧光量子产率提高到了 0.27，然而其荧光发射峰仍然很宽，易与其他染料的发射峰发生重叠，极大地限制了其在多色成像领域的应用，且其光稳定性相比罗丹明染料仍略显不足。此外，其荧光强度易受到周围环境的影响，染料的发射波长会随溶剂极性增大发生红移并伴随荧光发射强度的明显降低，成像信号的准确性大为降低。因而，开发新型高亮度、高光稳定性且环境不敏感的碳酸酐酶荧光探针迫在眉睫。
发明内容
本发明提供了一类高亮度、高光稳定性的碳酸酐酶检测荧光探针，该探针为一种可用于碳酸酐酶超分辨成像的4,5-双取代萘酰亚胺类染料，在保持萘酰亚胺这一中性分子基础上，在4,5-位同时引入具有环张力基团以达到分子的对称性及供体部分的高刚性结构。研究发现这类染料具有很高的亮度、优异的光稳定性、波长不敏感性，且细胞透膜性好，能够快速标记细胞内碳酸酐酶，可以用于检测和超分辨成像。
本发明一类高亮度、高光稳定性的碳酸酐酶检测荧光探针，是以4,5-双取代萘酰亚胺染料为结构单元，其结构式如下所示：
Figure BDA0001910300510000021
其中，R1与R2分别为
Figure BDA0001910300510000022
一类高亮度、高光稳定性的碳酸酐酶检测荧光探针的合成方法，合成步骤如下：
Figure BDA0001910300510000023
其中，R1为
Figure BDA0001910300510000024
一类高亮度、高光稳定性的碳酸酐酶检测荧光探针，优选一类高亮度、高光稳定性的碳酸酐酶检测的对称型荧光探针，其结构如下：
Figure BDA0001910300510000031
上述一类高亮度、高光稳定性的碳酸酐酶检测的对称型荧光探针的合成方法具体方法如下：
步骤一：中间体N-(4-氨甲基)苯磺胺-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺的合成
将4-溴-5-硝基-1,8-萘酐与4-(氨甲基)苯磺酰胺盐酸盐、三乙胺溶于无水乙醇中，升温至60-80℃反应10-20h，减压除蒸溶剂后经硅胶柱色谱分离提纯得到中间体N-(4-氨甲基)苯磺胺-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺；
步骤二：探针N-(4-氨甲基)苯磺胺-4,5-二氮杂环烷基-1,8-萘酰亚胺的合成
将N-(4-氨甲基)苯磺胺-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺与氮杂环烷烃溶解于乙二醇单甲醚中，加热至120-140℃并反应10-20h，减压除蒸溶剂后经过硅胶柱色谱分离得到探针N-(4-氨甲基)苯磺胺-4,5-二氮杂环烷基-1,8-萘酰亚胺。
步骤一中，4-溴-5-硝基-1,8-萘酐、4-(氨甲基)苯磺酰胺盐酸盐及三乙胺的质量比为1:1-4:0.7-3，4-溴-5-硝基-1,8-萘酐的质量与无水乙醇的体积比为1:5-30 g/mL。
步骤二中，N-(4-氨甲基)苯磺胺-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺与氮杂环烷烃的质量比为1:0.2-6，N-(4-氨甲基)苯磺胺-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺的质量与乙二醇单甲醚的体积比为1:50-200g/mL。
一类高亮度、高光稳定性的碳酸酐酶检测荧光探针，优选一类高亮度、高光稳定性的碳酸酐酶检测的不对称型荧光探针，其结构如下：
Figure BDA0001910300510000041
上述一类高亮度、高光稳定性的碳酸酐酶检测的不对称型荧光探针的合成方法，具体如下：
步骤一：中间体N-(4-氨甲基)苯磺胺-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺的合成
将4-溴-5-硝基-1,8-萘酐与4-(氨甲基)苯磺酰胺盐酸盐、三乙胺溶于无水乙醇中，升温至60-80℃反应10-20h，减压除蒸溶剂后经硅胶柱色谱分离提纯得到中间体N-(4-氨甲基)苯磺胺-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺；
步骤二：探针N-(4-氨甲基)苯磺胺-4-氮杂环丁基-5-氮杂环戊基-1,8-萘酰亚胺的合成
将N-(4-氨甲基)苯磺胺-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺与氮杂环丁烷溶解于乙二醇单甲醚中，60-80℃反应5-10h后减压旋除溶剂，无需后处理直接加入乙二醇单甲醚和四氢吡咯，升温至120℃回流10-20h，减压除蒸溶剂后经过硅胶柱色谱分离得到探针N-(4-氨甲基)苯磺胺-4-氮杂环丁基-5-氮杂环戊基-1,8-萘酰亚胺。
步骤一中，4-溴-5-硝基-1,8-萘酐、4-(氨甲基)苯磺酰胺盐酸盐及三乙胺的质量比为1:1-4:0.7-3，4-溴-5-硝基-1,8-萘酐的质量与无水乙醇的体积比为1:5-30 g/mL。
步骤二中，N-(4-氨甲基)苯磺胺-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺、氮杂环丁烷与四氢吡咯的质量比为1:0.02-0.5:0.2-7，N-(4-氨甲基)苯磺胺-4-溴-5-硝基-1,8- 萘酰亚胺的质量与乙二醇单甲醚的体积比为1:20-200g/mL。
上述三种碳酸酐酶荧光染料在活细胞及活体内能够对碳酸酐酶进行特异性标记并实现活细胞实时荧光成像。
一类高亮度、高光稳定性的碳酸酐酶检测荧光探针在超分辨荧光成像、分子探针及荧光传感等领域的应用。
本发明具有以下特点：
该染料拥有合成原料低价、方法简单且易于衍生等优点。
SML-DAze在乙醇中的摩尔消光系数达36675M-1cm-1，量子产率达到0.615； SML-AzeAzo在乙醇中的摩尔消光系数达25405M-1cm-1，量子产率达到0.184； SML-DAzo在乙醇中的摩尔消光系数达35410M-1cm-1，量子产率达到0.167；这三种碳酸酐酶荧光探针均有很高的亮度。
在4-、5-位同时引入具有环张力基团增加了分子的对称性，且高刚性结构的供体部分显著提高料的稳定性的同时使染料表现出环境不敏感的荧光性质，能够碳酸酐酶的超分辨荧光成像。
该类染料在活细胞中能够实时对碳酸酐酶进行精准标记；同时能够监测细胞中的碳酸酐酶的变化，可应用于碳酸酐酶分布及其分子机制等研究中。
附图说明
图1为实施例1中中间体SML-NBr的核磁氢谱。
图2为实施例1中中间体SML-NBr的核磁碳谱。
图3为实施例1中制备的碳酸酐酶探针SML-DAze的核磁氢谱。
图4为实施例1中制备的碳酸酐酶探针SML-DAze的核磁碳谱。
图5为实施例2中制备的碳酸酐酶探针SML-AzeAzo的核磁氢谱。
图6为实施例3中制备的碳酸酐酶探针SML-DAzo的核磁氢谱。
图7为实施例3中制备的碳酸酐酶探针SML-DAzo的核磁碳谱。
图8为实施例1中制备的染料SML-DAze在乙醇中归一化荧光发射谱图，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度，荧光探针的浓度为10μM。
图9为实施例1中制备的染料SML-DAze与荧光素在PBS缓冲液(20mM,pH＝ 7.4)中，经过不同时间激光照射后其最大荧光发射强度的变化，横坐标为光照时间，纵坐标为最大荧光发射强度与初始最大荧光发射强度的比值。
图10为实施例1中制备的染料SML-DAze在不同溶剂中的归一化荧光发射谱图，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度，荧光探针的浓度为10μM。
图11为实施例3中制备的染料SML-DAzo在PBS缓冲液(20mM，pH＝7.4) 中加入人碳酸酐酶I前后的荧光发射光谱，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度，荧光探针的浓度为1μM，碳酸酐酶浓度为1μM。
具体实施方式
实施例1
碳酸酐酶探针SML-DAze的合成。
中间体SML-NBr合成路线和产物结构如下：
Figure BDA0001910300510000061
将4-溴-5-硝基-1,8-萘酐(0.5g,1.56mmol)与4-(氨甲基)苯磺酰胺盐酸盐(1.0g,4.67mmol,1g)与三乙胺(0.7g,7mmol)加入10mL乙醇中，并将反应液加热至80℃反应8h后，将反应液冷却至室温，减压除去溶剂，残余物经硅胶柱(二氯甲烷/甲醇＝150/1，V/V)分离得橙色固体0.63g，产率82％。
其核磁谱图氢谱谱图如下图1所示，具体数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.67(d,J＝7.9Hz,1H),8.47(d,J＝8.0Hz, 1H),8.45–8.40(m,2H),7.76(d,J＝8.2Hz,2H),7.58(d,J＝8.3Hz,2H),7.31(s, 2H),5.31(s,2H).
其核磁谱图碳谱谱图如下图2所示，具体数据如下：
13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ163.22,162.50,150.84,143.41,141.14, 136.70,132.58,131.72,130.84,128.27,126.36,126.20,124.92,123.15,120.46, 43.57.
经检测，其结构如上式SML-NBr所示。
碳酸酐酶探针SML-DAze合成路线和产物结构如下：
Figure BDA0001910300510000071
取SML-NBr(0.1g,0.2mmol)、氮杂环丁烷(0.13g,2mmol)于5mL乙二醇单甲醚中，升温至140℃反应12h后，冷却反应液至室温后减压除蒸溶剂，残余物经硅胶柱色谱分离(二氯甲烷/甲醇＝50/1，V/V)得0.06g SML-Daze，为橙色固体，产率为60％。
其核磁谱图氢谱谱图如下图3所示，具体数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.38(d,J＝8.5Hz,2H),7.80(d,J＝8.2Hz,2H), 7.61(d,J＝8.2Hz,2H),6.40(d,J＝8.5Hz,2H),5.41(s,2H),4.78(s,2H),4.14(s, 8H),2.43(s,4H).
其核磁谱图碳谱谱图如下图4所示，具体数据如下：
13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ159.52,151.17,139.17,135.63,128.66, 128.54,124.32,121.70,104.75,102.98,101.71,53.72,37.96,12.12.
经检测，其结构如上式SML-DAze所示，其在乙醇中的发射波长为485nm，有很高的亮度和光稳定性，能够快速标记细胞内碳酸酐酶。
将待测染料分别溶解于DMSO溶液中，配制成2mM母液，根据需要制配成不同浓度测试溶液，检测其荧光光谱变化。
SML-DAze在乙醇中的荧光光谱测试。取20μLSML-DAze母液，加入4mL 乙醇中，配制成10μM的荧光探针测试液，进行荧光光谱的测试。
SML-DAze在乙醇中的归一化荧光光谱如图8所示，其中荧光探针浓度为 10μM，SML-DAze在乙醇中摩尔消光系数高达36675M-1cm-1，量子产率达到 0.615，该分子具有很高的亮度。
SML-DAze与荧光素在水中的PBS缓冲液(20mM,pH＝7.4)稳定性测试。取20μLSML-DAze、荧光素母液，分别加入4mL PBS缓冲液中，配制成10μM 的荧光探针测试液，并在500W钨灯下连续照射。光源距离样品50cm，每次将测试液温度稳定在25℃后进行荧光光谱测试。采取0,0.5,1,1.5,2,3,4,6,8,10h 为时间点分别测试。
SML-DAze与荧光素在不同时间激光照射后，最大荧光发射强度与初始最大荧光发射强度的比值如图9所示；其中荧光探针浓度均为10μM，在连续照射10h后，SML-DAze的荧光发射强度相比初始最大荧光发射强度仅仅降低了 10％，然而荧光素则降低了54％，证明SML-DAze有很好的光稳定性。
SML-DAze在不同溶剂中的荧光发射光谱测试。每次取20μLSML-DAze 母液，分别加入4mL待测溶剂中，配制成10μM的荧光探针测试液，并进行荧光光谱的测试。
SML-DAze在乙醇、乙腈等不同溶剂中的荧光发射光谱如图10所示；其中荧光探针浓度为10μM，在极性差异很大的溶剂中，SML-DAze的发射波长和强度均无明显变化，证明SML-DAze为环境不敏感染料。
实施例2
碳酸酐酶探针SML-AzeAzo合成路线和产物结构如下：
Figure BDA0001910300510000081
取SML-NBr(0.1g,0.2mmol)、氮杂环丁烷(0.01g,0.2mmol)于5mL 乙二醇甲醚中，升温至60℃反应5h后冷却反应液至室温，减压除蒸溶剂后无需后处理过程，加入5mL乙二醇甲醚及四氢吡咯(0.15g,2mmol)，升温至140℃反应12h后，冷却反应液至室温后减压除蒸溶剂，残余物经硅胶柱色谱分离(二氯甲烷/甲醇＝40/1，V/V)得0.04g SML-AzeAzo，为橙色固体，产率为40％。
其核磁谱图氢谱谱图如下图5所示，具体数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.13(dd,J＝15.6,8.0Hz,2H),7.74(d,J＝ 7.8Hz,2H),7.41(d,J＝7.9Hz,2H),7.26(s,1H),6.88–6.70(m,1H),6.46(d,J＝ 8.6Hz,1H),5.27(s,2H),4.16(s,2H),3.66(s,4H),3.19(s,2H),2.34(s,2H),2.02(s, 2H),1.86(s,2H).
经检测，其结构如上式SML-DAzeAzo所示，其在乙醇中的发射波长为485 nm，有很高的亮度和光稳定性，能够快速标记细胞内碳酸酐酶。
实施例3
碳酸酐酶探针SML-DAzo合成路线和产物结构如下：
Figure BDA0001910300510000091
取SML-NBr(0.1g,0.2mmol)、四氢吡咯(0.15g,2mmol)于5mL乙二醇甲醚中，升温至140℃反应12h后，冷却反应液至室温后减压除蒸溶剂，残余物经硅胶柱色谱分离(二氯甲烷/甲醇＝50/1，V/V)得0.06g SML-DAzo，为橙色固体，产率为60％。
其核磁谱图氢谱谱图如下图6所示，具体数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.11(d,J＝8.8Hz,2H),7.73(d,J＝8.3Hz, 2H),7.41(d,J＝8.3Hz,2H),7.26(s,2H),6.78(d,J＝8.9Hz,2H),5.26(s,2H),3.82 –3.61(m,2H),3.38(dd,J＝13.5,7.3Hz,2H),3.27–3.16(m,2H),2.23–1.86(m, 8H),1.66–1.47(m,2H).
其核磁谱图碳谱谱图如下图7所示，具体数据如下：
13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ163.31,154.79,143.36,142.89,134.19, 132.66,127.92,126.11,108.56,106.94,52.51,49.80,42.32,25.96,25.42.
经检测，其结构如上式SML-DAzo所示，其在乙醇中的发射波长为495nm，有很高的亮度和光稳定性，能够快速标记细胞内碳酸酐酶。
将待测染料分别溶解于DMSO溶液中，配制成2mM母液，根据需要制配成不同浓度测试溶液，检测其加入碳酸酐酶前后荧光光谱变化。
SML-DAzo在加入人碳酸酐酶I前后荧光发射光谱测试。取2μLSML-DAzo 母液，加入4mL PBS缓冲液(20mM，pH＝7.4)中，配制成1μM的荧光探针测试液进行荧光光谱测试；后加入人碳酸酐酶I使酶的终浓度为1μM，混匀10 分钟后进行荧光光谱测试。
SML-DAzo在加入碳酸酐酶前后的荧光发射谱图如图11所示；其中荧光探针浓度为1μM，人碳酸酐酶I的浓度为1μM。在加入碳酸酐酶后，SML-DAzo 的荧光发射强度有近5倍的增强，证明SML-DAzo能够与人碳酸酐酶I结合且发生荧光增强，可用于碳酸酐酶的检测和荧光成像中。

Claims (10)

1.一类高亮度、高光稳定性的碳酸酐酶检测荧光探针，其特征在于：结构式如下所示，
Figure FDA0003539871000000011
其中，R1与R2分别为
Figure FDA0003539871000000012
2.如权利要求1所述一类高亮度、高光稳定性的碳酸酐酶检测荧光探针，其特征在于，结构式如下：
Figure FDA0003539871000000013
3.如权利要求1所述一类高亮度、高光稳定性的碳酸酐酶检测荧光探针，其特征在于，结构式如下：
Figure FDA0003539871000000014
4.如权利要求2所述一类高亮度、高光稳定性的碳酸酐酶检测荧光探针的合成方法，其特征在于具体方法如下：
步骤一：中间体
Figure FDA0003539871000000021
的合成
将4-溴-5-硝基-1,8-萘酐与4-(氨甲基)苯磺酰胺盐酸盐、三乙胺溶于无水乙醇中，升温至60-80℃反应10-20h，减压除蒸溶剂后经硅胶柱色谱分离提纯得到中间体
Figure FDA0003539871000000022
步骤二：探针
Figure FDA0003539871000000023
的合成
将
Figure FDA0003539871000000024
与氮杂环丁烷或四氢吡咯溶解于乙二醇单甲醚中，加热至120-140℃并反应10-20h，减压除蒸溶剂后经过硅胶柱色谱分离得到探针；其中，R1为
Figure FDA0003539871000000025
5.如权利要求4所述的一类高亮度、高光稳定性的碳酸酐酶检测荧光探针的合成方法，其特征在于：步骤一中，4-溴-5-硝基-1,8-萘酐、4-(氨甲基)苯磺酰胺盐酸盐及三乙胺的质量比为1:1-4:0.7-3，
4-溴-5-硝基-1,8-萘酐的质量与无水乙醇的体积比为1:5-30g/mL。
6.如权利要求4所述的一类高亮度、高光稳定性的碳酸酐酶检测荧光探针的合成方法，其特征在于：步骤二中，
Figure FDA0003539871000000031
与氮杂环丁烷或四氢吡咯的质量比为1:0.2-6，
Figure FDA0003539871000000032
的质量与乙二醇单甲醚的体积比为1:50-200g/mL。
7.如权利要求3所述一类高亮度、高光稳定性的碳酸酐酶检测荧光探针的合成方法，其特征在于具体方法如下：
步骤一：中间体
Figure FDA0003539871000000033
的合成
将4-溴-5-硝基-1,8-萘酐与4-(氨甲基)苯磺酰胺盐酸盐、三乙胺溶于无水乙醇中，升温至60-80℃反应10-20h，减压除蒸溶剂后经硅胶柱色谱分离提纯得到中间体
Figure FDA0003539871000000041
步骤二：探针
Figure FDA0003539871000000042
的合成
将
Figure FDA0003539871000000043
与氮杂环丁烷溶解于乙二醇单甲醚中，60-80℃反应5-10h后减压旋除溶剂，无需后处理直接加入乙二醇单甲醚和四氢吡咯，升温至120℃回流10-20h，减压除蒸溶剂后经过硅胶柱色谱分离得到探针
Figure FDA0003539871000000044
8.如权利要求7所述的一类高亮度、高光稳定性的碳酸酐酶检测荧光探针的合成方法，其特征在于：步骤三中，4-溴-5-硝基-1,8-萘酐、4-(氨甲基)苯磺酰胺盐酸盐及三乙胺的质量比为1:1-4:0.7-3，
4-溴-5-硝基-1,8-萘酐的质量与无水乙醇的体积比为1:5-30g/mL。
9.如权利要求7所述的一类高亮度、高光稳定性的碳酸酐酶检测荧光探针的合成方法，其特征在于：步骤四中，
Figure FDA0003539871000000051
氮杂环丁烷与四氢吡咯的质量比为1:0.02-0.5:0.2-7，
Figure FDA0003539871000000052
的质量与乙二醇单甲醚的体积比为1:20-200g/mL。
10.如权利要求1所述的一类高亮度、高光稳定性的碳酸酐酶检测荧光探针在超分辨荧光成像、分子探针及荧光传感领域的应用。
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