CN111334081B - 一类高亮度、脂滴细胞核多色成像荧光探针 - Google Patents

一类高亮度、脂滴细胞核多色成像荧光探针 Download PDF

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Abstract

本发明提供了了一类高亮度、脂滴细胞核多色成像荧光探针，该探针为一类可用于活细胞中脂滴和细胞核多色荧光成像的4‑取代萘酰亚胺类染料，该类染料具有合成原料低廉、方法简单且易于衍生等优点。研究发现，这类染料在萘酰亚胺母体的4‑位引入的氮杂环丁烷结构，增加染料的刚性和平面性，有效地抑制了TICT过程，此类染料在乙醇中的摩尔消光系数为15000M‑1cm‑1左右，荧光量子产率为0.6左右，有很高的亮度和光稳定性。在染料上引入吗啉环、N,N‑二甲基等碱性基团，使染料可以靶向细胞核，且分子有合适的脂溶性，从而实现对细胞核与脂滴的精准定位。该类染料有很高的亮度和光稳定性，能够快速标记细胞核与脂滴并利用于多色荧光成像等领域。

Description

一类高亮度、脂滴细胞核多色成像荧光探针
技术领域
本发明属于荧光成像技术领域，具体涉及一类高亮度、脂滴细胞核多色成像荧光探针。
背景技术
细胞核是细胞内最重要的细胞器，调控着细胞遗传和代谢等生理过程；脂滴是细胞内中性脂的主要贮存场所，与脂肪代谢、脂肪变性等密切相关。近年来的研究表明，在一些生理活动中，细胞核与脂滴间有着紧密的关联。例如在细胞凋亡的过程中，细胞核中染色质会缩聚后裂解，这其中会伴随脂滴融合等过程；而脂滴中脂肪酸的代谢产物会激活某些蛋白，从而诱导细胞凋亡增加。多色荧光成像技术的出现为了解这些细胞器间的相互作用提供了强有力的工具。
多色荧光成像技术一般采用两种或两种以上具有不同荧光发光波长，但其激发波长处于同一范围内的染料对不同细胞器进行标记，可以实现对不同细胞器的实时监测。这对染料的荧光性质提出了很高的要求，染料不仅需要具有很高的亮度和光稳定性，还需要有较窄的发射光谱、较大的斯托克斯位移以避免成像时信号重叠，现有的荧光染料大多难以满足这样苛刻的需求；且在孵育细胞的过程中需要加入多种染料，不仅增加了实验成本，其细胞毒性也未可知。若仅使用一种染料进行多色荧光成像，为区分不同细胞器所产生的荧光信号，需要在对一种细胞器标记成像淬灭所有染料，再加入新的染料对第二种细胞器进行标记和成像，其实验过程十分繁复，且其淬灭过程需要加入一些化学试剂，这会造成细胞死亡，无法对活细胞进行多色成像过程。因而急需开发一种新型的荧光染料，既具有高亮度、高光稳定性，又能通过简单的成像手段分别对标记的不同细胞器进行观察，以实现简单高效地对活细胞中不同细胞器进行多色荧光成像的需求。
发明内容
本发明提供了一类高亮度、脂滴细胞核多色成像荧光探针，该探针为一类 4-取代萘酰亚胺类荧光探针，该探针在萘酰亚胺母体的4-位引入氮杂环丁烷，增加了染料的脂溶性的同时也增加了染料的刚性和平面性；引入吗啉环、N,N-二甲基等碱性基团使其能够对细胞核进行靶向。研究发现这类染料有很高的亮度、优异的光稳定性，能够快速透过细胞并同时富集于细胞核与脂滴中，且可以分别利用单、双光子荧光成像技术对细胞核和脂滴分别进行观察，实现了对活细胞简便且高时空分辨率的多色荧光成像。
本发明一类高亮度、脂滴细胞核多色成像荧光探针是以4-取代萘酰亚胺染料为结构单元，其结构式如下所示：
Figure BDA0001911607220000021
其中，
Figure BDA0001911607220000022
本发明还提供了一类高亮度、脂滴细胞核多色成像荧光探针的合成方法，合成步骤如下：
Figure BDA0001911607220000023
具体合成步骤如下：
步骤一：中间体4-氮杂环丁基-1,8-萘酐(Naph-Aze)的合成
称取4-溴-1,8-萘酐、水硫酸铜与干燥的N,N-二甲基甲酰胺中，氮气保护下加入氮杂环丁烷，升温至120-140℃反应10-20h。将反应液缓慢倒入冷水中，抽滤除去滤液。滤渣用二氯甲烷溶解后硅胶柱层析分离得到中间体4-氮杂环丁基-1,8-萘酐。
步骤二：不同N-取代的4-氮杂环丁基-1,8-萘酰亚胺细胞核探针的合成
将4-氮杂环丁基-1,8-萘酐、不同伯胺溶于无水乙醇中，升温至60-80℃反应 10-20h，冷却反应液后减压除蒸溶剂后经硅胶柱色谱分离提纯得到不同N-取代的4-氮杂环丁基-1,8-萘酰亚胺细胞核探针。
步骤一中，4-溴-1,8-萘酐、无水硫酸铜与氮杂环丁烷的质量比为1:1-3:0.3-1，4-溴-1,8-萘酐的质量与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为1:2-6g/mL。
步骤二中，4-氮杂环丁基-1,8-萘酐与不同取代的伯胺的质量比为1-0.25:10， 4-氮杂环丁基-1,8-萘酐的质量与无水乙醇的体积比为1:10-100g/mL。
上述荧光探针在活细胞及活体内能够对细胞核与脂滴进行特异性标记并实现荧光成像。
一类高亮度、脂滴细胞核多色成像荧光探针在荧光成像、分子探针及荧光传感领域的应用。
本发明具有以下特征：
这类探针拥有合成原料低价、方法简单且易于衍生等优点。
这类探针在萘酰亚胺母体的4-位引入的氮杂环丁烷结构可以有效地抑制 TICT过程，此类染料在乙醇中的摩尔消光系数为15000M-1cm-1左右，荧光量子产率为0.6左右，有很高的亮度和光稳定性。
染料有很好的刚性和平面性，可以插入细胞核中的核酸链中，且染料有合适的脂溶性，易于进入脂滴中，从而能同时实现对细胞核和脂滴的精准定位，可应用于细胞核和脂滴与其他细胞器相互作用研究、细胞凋亡等研究中。
附图说明
图1：为实施例2中制备的探针Mor-Aze的核磁氢谱；
图2：为实施例2中制备的探针Mor-Aze的核磁碳谱；
图3：为实施例2中制备的探针Mor-Aze的高分辨质谱；
图4：为实施例4中制备的探针DPma-Aze的核磁氢谱；
图5：为实施例4中制备的探针DPma-Aze的核磁碳谱；
图6：为实施例4中制备的探针DPma-Aze的高分辨质谱；
图7：为实施例1制备的探针OMor-Aze在乙醇中归一化荧光激发与发射谱图，横坐标为波长，纵坐标为归一化的荧光强度与吸收强度，荧光探针的浓度为10 μM；
图8：为实施例2制备的探针Mor-Aze与荧光素在PBS缓冲液(20mM,pH＝7.4) 中，经过不同时间激光照射后后其最大荧光发射强度的变化，横坐标为激光照射时间，纵坐标为相对荧光强度，即最大荧光发射强度与初始最大荧光发射强度的比值；
图9：实施例2制备的探针Mor-Aze的HeLa细胞单光子荧光成像图；
图10：实施例2制备的探针Mor-Aze的HeLa细胞双光子荧光成像图；
具体实施方式
实施例1
探针OMor-Aze的合成。
中间体Naph-Aze合成路线和产物结构如下：
Figure BDA0001911607220000041
称取4-溴-1,8-萘酐(3.0g,10.9mmol)、无水硫酸铜(5.2g,32.7mmol)于 10mL干燥的DMF中，在氮气保护下加入氮杂环丁烷(1.9g,32.7mmol)，升温至140℃反应20h，冷却反应液至室温后，将反应液缓慢倒入冰水中，有大量橙色固体析出。抽滤除去滤液，滤渣用二氯甲烷溶解后经硅胶柱色谱分离提纯 (石油醚/二氯甲烷＝1/10，V/V)，得到橙色固体粉末1.1g，产率40％。
其高分辨质谱数据如下：
HRMS(ESI)：m/z：[M+H]+：计算值：254.0817，实验值：254.0883。
经检测，其结构如上式Naph-Aze所示。
探针OMor-Aze合成路线和产物结构如下：
Figure BDA0001911607220000051
称取Naph-Aze(0.1g,0.4mmol)于5mL无水乙醇中，加入N-(2-(2-氨基)乙氧基乙基)吗啉(0.2g,1.2mmol)，将反应液加热至60℃反应20h后，反应液冷却至室温，减压蒸馏除去溶剂，残余物经硅胶柱(二氯甲烷/甲醇＝50/1， V/V)分离得到产物，为橙色固体0.13g，产率82％。
其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3,ppm):δ＝8.51(d,J＝7.2Hz,1H),8.35(d,J＝8.4 Hz,1H),8.21(d,J＝8.4Hz,1H),7.49(t,J＝7.9Hz,1H),6.36(d,J＝8.4Hz,1H), 4.48(t,J＝7.4Hz,4H),4.41(t,J＝6.0Hz,2H),3.78(t,J＝6.0Hz,2H),3.67(t,J＝ 5.3Hz,2H),3.61-3.53(m,4H),2.56(dd,J＝12.9,6.9Hz,4H),2.44(s,4H).
其核磁谱图碳谱数据如下：
13C NMR(101MHz,CDCl3,ppm):δ＝164.71,163.97,152.47,133.29,131.10,130.60,130.08,123.65,122.60,120.88,110.05,106.20,68.30,68.01,66.78,58.29,55.34,53.99,38.79,17.05.
其高分辨质谱数据如下：
HRMS(ESI)：m/z：[M+H]+：计算值：410.2080，实验值：410.2080。
经检测，其结构如上式OMor-Aze所示，能够准确定位活细胞细胞核与脂滴中进行活细胞中多色成像。
将待测染料分别溶解于二甲基亚砜溶液中，配制成不同染料的2mM母液，根据需要制配成不同浓度测试溶液，对其光谱及细胞成像进行检测。
OMor-Aze在乙醇中的光谱测试。取20μLOMor-Aze母液，加入4mL乙醇中，配制成10μM的荧光探针测试液，并进行紫外和荧光光谱的测试。
OMor-Aze在乙醇中的归一化吸收光谱和荧光光谱如图7所示，其中荧光探针浓度为10μM，OMor-Aze在乙醇中摩尔消光系数达14630M-1cm-1，量子产率达到0.61，该探针具有很高的亮度。
实施例2
探针Mor-Aze合成路线和产物结构如下：
Figure BDA0001911607220000061
称取Naph-Aze(0.1g,0.4mmol)于5mL无水乙醇中，加入4-(2-氨基乙基)吗啉(0.15g,1.2mmol)，将反应液加热至80℃反应12h后，反应液冷却至室温，减压蒸馏除去溶剂，残余物经硅胶柱(二氯甲烷/甲醇＝50/1，V/V) 分离得到产物，为橙色固体0.12g，产率87％。
其核磁谱图氢谱如下图1所示，具体数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3,ppm):δ＝8.55(d,J＝6.9Hz,1H),8.39(d,J＝8.3 Hz,1H),8.26(d,J＝8.2Hz,1H),7.52(t,J＝7.6Hz,1H),6.41(d,J＝8.3Hz,1H), 4.51(t,J＝6.9Hz,4H),4.32(d,J＝6.1Hz,2H),3.70(s,4H),2.70(s,2H),2.65-2.39 (m,6H).
其核磁谱图碳谱如下图2所示，具体数据如下：
13C NMR(101MHz,CDCl3,ppm):δ＝164.70,163.98,152.48,133.28,131.10,130.58,130.09,123.67,122.59,120.88,110.01,106.22,67.07,56.25,55.36,53.81,36.92,17.05.
其高分辨质谱谱图如下图3所示，具体数据如下：
HRMS(ESI)：m/z：[M+H]+：计算值：366.1818，实验值：366.1769。
经检测，其结构如上式Mor-Aze所示，能够准确定位活细胞细胞核与脂滴中进行活细胞中多色成像。
将待测染料分别溶解于二甲基亚砜溶液中，配制成不同染料的2mM母液，根据需要制配成不同浓度测试溶液，对其光谱及细胞成像进行检测。
Mor-Aze与荧光素在PBS缓冲液(20mM,pH＝7.4)中的光稳定性测试。取20μLMor-Aze、荧光素母液，分别加入4mL PBS缓冲液中，配制成10μM 的荧光探针测试液，并在500W钨灯下连续照射。光源距离样品50cm，每次将测试液温度稳定在25℃后进行荧光光谱测试。采取0,0.5,1,1.5,2,3,4,5,6,8, 10h为时间点分别测试。
Mor-Aze与荧光素在不同时间激光照射后，最大荧光发射强度与初始最大荧光发射强度的比值如图8所示；其中荧光探针浓度均为10μM，在连续照射 10h后，Mor-Aze的荧光发射强度相比初始最大荧光发射强度仅下降了约10％，而荧光素染料的发射强度下降了近90％，证明Mor-Aze有很好的光稳定性。
实施例3
探针DEma-Aze合成路线和产物结构如下：
Figure BDA0001911607220000071
称取Naph-Aze(0.1g,0.4mmol)于5mL无水乙醇中，加入N,N-二甲基乙胺(0.1g,1.2mmol)，将反应液加热至80℃反应10h后，反应液冷却至室温，减压蒸馏除去溶剂，残余物经硅胶柱(二氯甲烷/甲醇＝50/1，V/V)分离得橙色固体0.11g，产率86％。
其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.51(dt,J＝29.2,14.7Hz,1H),8.40-8.29(m, 1H),8.24-8.14(m,1H),7.49(td,J＝8.5,2.3Hz,1H),6.44-6.29(m,1H),4.61-4.41 (m,4H),4.32(t,J＝7.2Hz,2H),2.66(t,J＝7.2Hz,2H),2.61-2.52(m,2H),2.37(s, 6H).
其核磁谱图碳谱数据如下：
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ164.77,164.06,152.51,133.34,131.16,130.63,130.10,123.68,122.63,120.90,110.10,106.24,57.00,55.36,45.70,37.81,17.06.
其高分辨质谱数据如下：
HRMS(ESI)：m/z：[M+H]+：计算值：324.1712，实验值：324.1695。
经检测，其结构如上式DEma-Aze所示，能够准确定位活细胞细胞核与脂滴中进行活细胞中多色成像。
实施例4
探针DPma-Aze合成路线和产物结构如下：
Figure BDA0001911607220000081
称取Naph-Aze(0.1g,0.4mmol)于5mL无水乙醇中，加入N,N-二甲基丙胺(0.1 g,1.2mmol)，将反应液加热至80℃反应15h后，反应液冷却至室温，减压蒸馏除去溶剂，残余物经硅胶柱(二氯甲烷：甲醇＝50:1，V/V)分离得产物，为橙色固体0.11g，产率85％。
其核磁谱图氢谱如下图4所示，具体数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.53(dd,J＝12.3,7.3Hz,1H),8.34(t,J＝9.2Hz, 1H),8.20(t,J＝9.1Hz,1H),7.54–7.45(m,1H),6.36(d,J＝8.5Hz,1H),4.57–4.40(m,4H),4.32–4.12(m,2H),2.67–2.48(m,4H),2.35(s,6H),1.98(dt,J＝ 14.8,7.5Hz,2H).
其核磁谱图碳谱如下图5所示，具体数据如下：
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ164.69,164.00,152.49,133.30,131.12,130.55,130.11,123.67,122.57,120.87,110.00,106.22,57.12,55.36,44.96,38.25,25.70,17.06.
其高分辨质谱谱图如下图6所示，具体数据如下：
HRMS(ESI)：m/z：[M+H]+：计算值：338.1869，实验值：338.1886。
经检测，其结构如上式DPma-Aze所示，能够准确定位活细胞细胞核与脂滴中进行活细胞中多色成像。
实施例5
Mor-Aze对活细胞染色后荧光成像检测。取1μLMor-Aze母液溶于2mL 细胞培养液中，37℃，5％CO2下孵育60分钟后分别进行单光子荧光共聚焦成像和双光子荧光共聚焦成像。
Mor-Aze终浓度为2μM的细胞培养液孵育宫颈癌细胞(HeLa)60分钟后单光子荧光共聚焦成像如图9所示；Mor-Aze能够对HeLa细胞的细胞核进行精准定位，细胞核清晰可见，达到免洗荧光成像。
Mor-Aze终浓度为2μM的细胞培养液孵育宫颈癌细胞(HeLa)60分钟后双光子荧光共聚焦成像如图10所示；Mor-Aze能够对HeLa细胞的脂滴进行精准定位，脂滴清晰可见，达到免洗荧光成像。
结合图9和图10，可以证明可以仅利用Mor-Aze一种染料，即对活细胞的细胞核与脂滴进行简单且高时空分辨率的多色荧光成像。

Claims (5)

1.一类高亮度、脂滴细胞核多色成像荧光探针，其特征在于：其结构式如下所示，
Figure FDA0003228855490000011
其中，
Figure FDA0003228855490000012
2.如权利要求1所述的一类高亮度、脂滴细胞核多色成像荧光探针的合成方法，其特征在于：该合成的具体方法如下：
步骤一：中间体4-氮杂环丁基-1,8-萘酐的合成
称取4-溴-1,8-萘酐、无水硫酸铜与干燥的N,N-二甲基甲酰胺中，氮气保护下加入氮杂环丁烷，升温至120-140℃反应10-20h；将反应液缓慢倒入冷水中，抽滤除去滤液；滤渣用二氯甲烷溶解后硅胶柱层析分离得到中间体4-氮杂环丁基-1,8-萘酐；
步骤二：N-取代-4-氮杂环丁基-1,8-萘酰亚胺探针的合成
将4-氮杂环丁基-1,8-萘酐、不同取代的伯胺溶于无水乙醇中，升温至60-80℃反应10-20h，冷却反应液后减压除蒸溶剂后经硅胶柱色谱分离提纯得到N-取代-4-氮杂环丁基-1,8-萘酰亚胺探针；
所述不同取代的伯胺为：
Figure FDA0003228855490000013
Figure FDA0003228855490000014
3.如权利要求2中所述的一类高亮度、脂滴细胞核多色成像荧光探针的合成方法，其特征在于：步骤一中，4-溴-1,8-萘酐、无水硫酸铜与氮杂环丁烷的质量比为1:1-3:0.3-1，
4-溴-1,8-萘酐的质量与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为1:2-6g/mL。
4.如权利要求2中所述的一类高亮度、脂滴细胞核多色成像荧光探针的合成方法，其特征在于：步骤二中，4-氮杂环丁基-1,8-萘酐与不同取代的伯胺的质量比为1:0.25-10，
4-氮杂环丁基-1,8-萘酐的质量与无水乙醇的体积比为1:10-100g/mL。
5.如权利要求1所述的一类高亮度、脂滴细胞核多色成像荧光探针在荧光成像、分子探针及荧光传感领域的应用。
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