CN111333575B - 一类高亮度碳酸酐酶荧光寿命成像探针及其合成和应用 - Google Patents

一类高亮度碳酸酐酶荧光寿命成像探针及其合成和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一类高亮度碳酸酐酶荧光寿命成像探针及其合成和应用，该类染料拥有合成原料低廉、方法简单且易于衍生等优点。研究表明，该类染料有很高的亮度，在乙醇中的摩尔消光系数为15000M‑1cm‑1左右，荧光量子产率在0.45左右；其上含有的苯磺胺结构可以高选择性地结合细胞内的碳酸酐酶，通过在染料4‑位引入不同长度的脂肪烃链调控染料的聚集程度，使染料发生聚集而导致荧光淬灭，在与碳酸酐酶结合后染料被分散使荧光恢复；染料在水环境中表现为短荧光寿命，在结合碳酸酐酶后处于弱极性环境中表现为长荧光寿命，荧光寿命有近10倍的增加。该类碳酸酐酶染料均有很高的亮度，能够快速标记碳酸酐酶并利用与碳酸酐酶检测、荧光成像及荧光寿命成像等领域。

Description

一类高亮度碳酸酐酶荧光寿命成像探针及其合成和应用
技术领域
本发明属于荧光成像技术领域，具体涉及一类高亮度碳酸酐酶荧光寿命成像探针及其合成和应用。
背景技术
碳酸酐酶是一种含Zn2+的金属酶，研究表明其在生物体内承担着多种生理学功能，并参与多种癌症的发生和发展。荧光成像技术因其高灵敏度、高选择性的特点，已经被广泛应用于生命科学中众多基本生理过程的监测。利用荧光染料标记碳酸酐酶进而进行荧光成像，可以了解碳酸酐酶的数量、在细胞中的分布等信息，对疾病诊断、治疗有着重要的意义。
现有的对于碳酸酐酶的荧光分析与成像技术大多依赖于荧光强度的测量，然而荧光强度的测定容易受激发光强度、染料分布浓度、光漂白等因素的影响，降低了结果的准确性。相比于测定荧光强度，分子的荧光寿命一般而言是绝对的。荧光寿命是是荧光分子固有的特征参数，与绝对发光强度无关，因而测定时不受激发光强度、荧光团浓度等因素的影响。由于荧光寿命与分子由激发态回落到基态的过程密切相关，因而除了与染料自身结构有关外，分子所处环境的极性、粘度、刚性等的变化均会造成染料分子荧光寿命的变化。因而荧光寿命的测定还能够十分灵敏地监测染料分子周围环境变化。染料在结合碳酸酐酶前后，其所处环境的极性、粘度、刚性等均会发生明显变化，从而引起染料的荧光寿命的变化。然而有机小分子荧光染料的寿命通常较短(约为10-9秒)，在结合目标分子前后的寿命变化较小，如何通过简单的结构修饰，设计能够在结合碳酸酐酶前后荧光寿命有明显差异的荧光染料以避免成像时外界干扰是目前染料设计的一大挑战。
发明内容
本发明提供了一类高亮度碳酸酐酶荧光寿命成像探针及其合成和应用。该碳酸酐酶荧光寿命成像探针为4-取代萘酰亚胺类染料，其上含有的苯磺胺结构可以高选择性地结合碳酸酐酶。通过在染料4-位引入不同长度的脂肪烃链调控染料的聚集程度，使染料发生聚集而导致荧光淬灭，在与碳酸酐酶结合后染料被分散荧光恢复，且染料从细胞培养基到与碳酸酐酶结合前后微环境产生变化，荧光寿命有明显增加，从而实现对细胞内碳酸酐酶的分布进行荧光显微成像及荧光寿命显微成像。
本发明一类高亮度碳酸酐酶荧光寿命成像探针，是以4-取代萘酰亚胺染料为结构单元，其结构式如下所示：
Figure BDA0001910570310000021
其中，
Figure BDA0001910570310000022
n为1-11间整数。
本发明还提供了一类高亮度碳酸酐酶荧光寿命成像探针的合成方法，合成步骤如下：
Figure BDA0001910570310000023
n为1-11间整数。
一类高亮度碳酸酐酶荧光寿命成像探针，优选4-烷氨基取代的高亮度碳酸酐酶荧光寿命成像探针，其结构如下：
Figure BDA0001910570310000031
其中，n为1-11间整数。
其合成的具体方法如下：
步骤一：中间体N-(4-氨甲基)苯磺胺-4-溴-1,8-萘酰亚胺的合成：
将4-溴-5-硝基-1,8-萘酐与4-(氨甲基)苯磺酰胺盐酸盐及三乙胺溶解于无水乙醇中，升温至60-80℃反应10-20h，后减压除蒸溶剂，通过硅胶柱色谱分离提纯，得到中间体N-(4-氨甲基)苯磺胺-4-溴-1,8-萘酰亚胺；
步骤二：4-位烷氨基取代的N-(4-氨甲基)苯磺胺-1,8-萘酰亚胺衍生物的合成：
将中间体N-(4-氨甲基)苯磺胺-4-溴-1,8-萘酰亚胺与烷基伯胺溶于乙二醇单甲醚中，升温至120-140℃反应10-20h，减压除蒸溶剂后经过硅胶柱色谱分离提纯，得到4-位不同烷基链取代的N-(4-氨甲基)苯磺胺-1,8-萘酰亚胺衍生物。
步骤一中，4-溴-5-硝基-1,8-萘酐、4-(氨甲基)苯磺酰胺盐酸盐与三乙胺的质量比为1:1-4:1-6，4-溴-5-硝基-1,8-萘酐的质量与无水乙醇的体积比为1:5-25g /mL。
步骤二中，N-(4-氨甲基)苯磺胺-4-溴-1,8-萘酰亚胺与烷基伯胺的质量比为 1:0.5-2，N-(4-氨甲基)苯磺胺-4-溴-1,8-萘酰亚胺的质量与乙二醇单甲醚的体积比为1:5-20g/mL。
一类高亮度碳酸酐酶荧光寿命成像探针，优选4-烷氨基取代的高亮度碳酸酐酶荧光寿命成像探针，其结构如下：
Figure BDA0001910570310000041
合成的具体方法如下：
步骤一：中间体N-(4-氨甲基)苯磺胺-4-溴-1,8-萘酰亚胺的合成：
将4-溴-5-硝基-1,8-萘酐与4-(氨甲基)苯磺酰胺盐酸盐及三乙胺溶解于无水乙醇中，升温至60-80℃反应10-20h，后减压除蒸溶剂，通过硅胶柱色谱分离提纯，得到中间体N-(4-氨甲基)苯磺胺-4-溴-1,8-萘酰亚胺；
步骤二：中间体N-(4-氨甲基)苯磺胺-4-叠氮基-1,8-萘酰亚胺的合成：
将中间体N-(4-氨甲基)苯磺胺-4-溴-1,8-萘酰亚胺与叠氮钠溶于N,N-二甲基甲酰胺中，80-100℃下反应20-30h，减压除蒸溶剂后得到中间体N-(4-氨甲基)苯磺胺-4-叠氮基-1,8-萘酰亚胺；
步骤三：探针N-(4-氨甲基)苯磺胺-4-氨基-1,8-萘酰亚胺的合成：
将中间体N-(4-氨甲基)苯磺胺-4-叠氮基-1,8-萘酰亚胺与硫化钠溶于乙腈中，45-60℃下反应10-20h，减压除蒸溶剂后经硅胶柱色谱分离提纯得到探针 N-(4-氨甲基)苯磺胺-4-氨基-1,8-萘酰亚胺。
步骤一中，4-溴-5-硝基-1,8-萘酐、4-(氨甲基)苯磺酰胺盐酸盐与三乙胺的质量比为1:1-4:1-6，4-溴-5-硝基-1,8-萘酐的质量与无水乙醇的体积比为1:5-25g /mL。
步骤二中，N-(4-氨甲基)苯磺胺-4-溴-1,8-萘酰亚胺与叠氮钠的质量比为 1:0.3-2，N-(4-氨甲基)苯磺胺-4-溴-1,8-萘酰亚胺的质量与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为1:5-20g/mL。
步骤三中，N-(4-氨甲基)苯磺胺-4-叠氮基-1,8-萘酰亚胺与硫化钠的质量比为1:0.1-1，N-(4-氨甲基)苯磺胺-4-叠氮基-1,8-萘酰亚胺的质量与乙腈的体积比为1:10-40g/mL。
一类高亮度碳酸酐酶荧光寿命成像探针在荧光成像、分子探针及荧光传感领域的应用。
本发明具有以下特点：
该类探针拥有合成原料低价、方法简单且易于衍生等优点。
该类染料有很高的亮度，在乙醇中的摩尔消光系数为15000M-1cm-1左右，荧光量子产率在0.45左右。
在PBS缓冲液(20mM，pH＝7.4)中，SML-2C在与碳酸酐酶结合前后染料的荧光强度增加了近5倍，寿命由3.53ns增加至11.6ns；SML-8C的荧光寿命由1.97ns增加至11.6ns。探针在结合碳酸酐酶前后的荧光强度和荧光寿命均有明显的变化，可以应用于细胞内碳酸酐酶的荧光成像与荧光寿命成像中。
该类染料在活细胞中能够实时对碳酸酐酶进行精准标记；同时能够监测细胞中的碳酸酐酶的变化，可应用于碳酸酐酶分布及其分子机制等研究中。
附图说明
图1为实施例1中制备的中间体SML-Br的核磁氢谱。
图2为实施例1中制备的碳酸酐酶探针SML-NH2的核磁碳谱。
图3为实施例2中制备的碳酸酐酶探针SML-2C的核磁氢谱。
图4为实施例2中制备的碳酸酐酶探针SML-2C的核磁碳谱。
图5为实施例4中制备的碳酸酐酶探针SML-12C核磁氢谱。
图6为实施例4中制备的碳酸酐酶探针SML-12C核磁碳谱。
图7为实施例2中制备的碳酸酐酶探针SML-2C在乙醇中归一化紫外吸收和荧光发射谱图，横坐标为波长，纵坐标为归一化紫外吸收和荧光发射强度，荧光探针的浓度为10μM。
图8为实施例2中制备的碳酸酐酶探针SML-2C在加入碳酸酐酶前后及碳酸酐酶抑制剂依索唑胺前后荧光强度变化图，横坐标为波长，纵坐标为荧光发射强度，荧光探针的浓度为1μM，碳酸酐酶浓度为1μM，依索唑胺浓度为10μM。
图9为实施例2中制备的碳酸酐酶探针SML-2C在加入碳酸酐酶前后及碳酸酐酶抑制剂依索唑胺前后荧光寿命变化图，横坐标为通道，纵坐标为光子数，荧光探针的浓度为1μM，碳酸酐酶浓度为1μM，依索唑胺浓度为10μM。
图10为实施例3中制备的碳酸酐酶探针SML-8C在加入碳酸酐酶前后及碳酸酐酶抑制剂依索唑胺前后荧光强度变化图，横坐标为波长，纵坐标为荧光发射强度，荧光探针的浓度为1μM，碳酸酐酶浓度为1μM，依索唑胺浓度为10μM。
图11为实施例3中制备的碳酸酐酶探针SML-8C在加入碳酸酐酶前后及碳酸酐酶抑制剂依索唑胺前后荧光寿命变化图，横坐标为通道，纵坐标为光子数，荧光探针的浓度为1μM，碳酸酐酶浓度为1μM，依索唑胺浓度为10μM。
具体实施方式
实施例1
碳酸酐酶探针SML-NH2的合成。
中间体SML-Br合成路线和产物结构如下：
Figure BDA0001910570310000061
向50mL乙醇中分别加入4-溴-1,8-萘酐(2.0g,7.2mmol)、4-(氨甲基)苯磺酰胺盐酸盐(3.2g,14.4mmol)与三乙胺(6.8g,36mmol)，并将反应液加热至80℃搅拌8h后，将反应液冷却至室温并将浑浊液抽滤得灰白色固体2.94g，产率92％。
其核磁谱图氢谱谱图如下图1所示，具体数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.50(tdd,J＝13.0,7.9,5.1Hz,2H),8.32– 8.24(m,1H),8.20–8.10(m,1H),7.96(dd,J＝8.4,7.4Hz,1H),7.77(d,J＝8.1Hz, 2H),7.56(d,J＝8.3Hz,2H),7.33(s,2H),5.29(s,2H).
其核磁谱图碳谱数据如下：
13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ163.45,163.41,143.35,141.54,133.33, 132.31,131.85,131.67,130.27,129.92,129.28,128.87,128.31,126.26,123.04, 122.26,43.32.
其高分辨质谱数据如下：
HRMS(ESI)：m/z：[M+H]+：计算值：444.9858，实验值：444.9806。经检测，其结构如上式SML-Br所示。
碳酸酐酶探针SML-NH2合成路线和产物结构如下：
Figure BDA0001910570310000071
将SML-Br(2.0g,4.5mmol)溶于5mL N,N-二甲基甲酰胺中，叠氮钠(0.6 g,9mmol)溶于1mL水中逐滴加入反应液中，升温至100℃反应8h后减压除蒸溶剂得到中间产物N-乙胺基苯磺胺-4-叠氮基-1,8-萘酰亚胺。将N-乙胺基苯磺胺-4-叠氮基-1,8-萘酰亚胺(0.2g,0.49mmol)溶于10mL乙腈中，缓慢加入硫氢化钠(0.06g,0.98mmol)，室温反应24h后减压除蒸溶剂，粗产物通过硅胶柱色谱(二氯甲烷/甲醇＝30/1，V/V)分离提纯得到黄色粉末0.11g，两步总产量为56％。
其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.72(d,J＝8.4Hz,1H),8.43(d,J＝7.2Hz, 1H),8.27(d,J＝8.6Hz,1H),7.76(d,J＝7.1Hz,3H),7.40(s,2H),7.67(t,J＝7.6 Hz,1H),7.55(d,J＝7.9Hz,2H),7.40(d,J＝8.2Hz,2H),5.30(s,2H).
其核磁谱图碳谱谱图如下图2所示，具体数据如下：
13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ164.30,163.32,151.30,143.11,142.45, 135.09,131.40,130.07,129.36,128.15,126.24,124.72,122.01,120.55,107.49, 104.30,43.12.
其高分辨质谱数据如下：
HRMS(ESI)：m/z：[M+H]+：计算值：382.0862，实验值：382.0880。
经检测，其结构如上式SML-NH2所示，其亮度高，且在标记活细胞碳酸酐酶前后其荧光寿命有显著变化，可以运用于荧光寿命成像中。
实施例2
当n＝1时，碳酸酐酶探针SML-2C的合成：
Figure BDA0001910570310000081
将SML-Br(0.2g,0.45mmol)溶于5mL乙二醇单甲醚中，加入50％乙胺水溶液(0.23g,2.25mmol)，升温至120℃反应10h，冷却至室温后减压蒸除溶剂，粗产物通过硅胶柱色谱(二氯甲烷/甲醇＝50/1，V/V)分离提纯得到黄色粉末0.14g，产率为76％。
其核磁谱图氢谱谱图如下图3所示，具体数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.67(d,J＝8.4Hz,1H),8.40(d,J＝7.2Hz, 1H),8.24(d,J＝8.5Hz,1H),7.76(d,J＝7.9Hz,3H),7.64(t,J＝7.8Hz,1H),7.49 (d,J＝8.1Hz,2H),7.31(s,2H),6.73(d,J＝8.6Hz,1H),5.26(s,2H),3.40(s,2H), 1.31(t,J＝7.1Hz,3H).
其核磁谱图碳谱谱图如下图4所示，具体数据如下：
13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ164.28,163.32,151.26,143.11,142.46, 135.08,131.38,130.02,129.34,128.16,126.24,124.66,121.98,120.53,107.55, 104.28,42.75,38.04,14.11.
其高分辨质谱数据如下：
HRMS(ESI)：m/z：[M+H]+：计算值：410.1175，实验值：410.1128。
经检测，其结构如上式SML-2C所示，其亮度高，在标记活细胞碳酸酐酶前后其荧光寿命有显著变化，可以运用于荧光寿命成像中。
将待测染料分别溶解于DMSO溶液中，配制成不同染料的2mM母液，根据需要制配成不同浓度测试溶液，检测其荧光光谱变化及进行细胞内碳酸酐酶荧光成像。
SML-2C在乙醇中的光谱测试。取20μLSML-2C母液，加入4mL乙醇中，配制成10μM的荧光探针测试液，并进行紫外和荧光光谱的测试。
SML-2C在乙醇中的吸收光谱和荧光光谱如下图7所示，其中荧光探针浓度为10μM，SML-2C在乙醇中的摩尔消光系数达16252M-1cm-1，量子产率达到0.42，该探针具有很高的亮度。
实施例3
当n＝7时，碳酸酐酶探针SML-8C的合成：
Figure BDA0001910570310000091
将SML-Br(0.2g,0.45mmol)溶于5mL乙二醇单甲醚中，加入辛胺(0.29 g,2.25mmol)，升温至120℃反应10h，冷却至室温后减压蒸除溶剂，粗产物通过硅胶柱色谱(二氯甲烷/甲醇＝50/1，V/V)分离提纯得到黄色粉末0.2g，产率为90％。
其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.76(d,J＝8.4Hz,1H),8.47(d,J＝7.2Hz, 1H),8.30(d,J＝8.6Hz,1H),7.87(t,J＝4.9Hz,1H),7.80(d,J＝8.3Hz,2H),7.71 (t,J＝7.9Hz,1H),7.52(d,J＝8.2Hz,2H),7.35(s,2H),6.80(d,J＝8.7Hz,1H), 5.31(s,2H),3.43–3.30(m,2H),1.73(dd,J＝14.1,7.1Hz,2H),1.49–1.12(m, 10H),0.87(d,J＝6.9Hz,3H).
其核磁谱图碳谱数据如下：
13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ164.30,163.33,151.44,143.12,142.45, 135.10,131.43,130.10,129.37,128.14,126.23,124.70,122.03,120.60,107.48, 104.34,43.33,42.74,31.71,29.27,29.15,28.27,27.10,22.55,14.40.
其高分辨质谱数据如下：
HRMS(ESI)：m/z：[M+H]+：计算值：494.2114，实验值：494.2047。
经检测，其结构如上式SML-8C所示，其亮度高，在标记活细胞碳酸酐酶前后其荧光寿命有显著变化，可以运用于荧光寿命成像中。
实施例4
当n＝11时，碳酸酐酶探针SML-12C的合成：
Figure BDA0001910570310000101
将SML-Br(0.2g,0.45mmol)溶于5mL乙二醇单甲醚中，加入十二胺(0.42 g,2.25mmol)，升温至120℃反应10h，冷却至室温后减压蒸除溶剂，粗产物通过硅胶柱色谱(二氯甲烷/甲醇＝50/1，V/V)分离提纯得到黄色粉末0.22g，产率为90％。
其核磁谱图氢谱谱图如下图5所示，具体数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.73(d,J＝8.4Hz,1H),8.44(d,J＝7.2Hz, 1H),8.27(d,J＝8.5Hz,1H),7.85(s,1H),7.74(d,J＝8.2Hz,2H),7.68(t,J＝7.9 Hz,1H),7.47(d,J＝8.2Hz,2H),7.29(s,2H),6.79(d,J＝8.7Hz,1H),5.27(s,2H), 1.76–1.58(m,2H),1.26(d,J＝43.8Hz,20H),0.83(t,J＝6.6Hz,3H).
其核磁谱图氢谱谱图如下图6所示，具体数据如下：
13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ164.29,163.31,151.42,143.14,142.44, 135.07,131.39,130.10,129.37,128.15,126.23,124.67,122.03,120.60,107.48, 104.29,43.32,42.74,31.75,29.47,29.28,29.17,28.24,27.07,22.56,14.40.
其高分辨质谱数据如下：
HRMS(ESI)：m/z：[M+H]+：计算值：550.2740，实验值：550.2670。
经检测，其结构如上式SML-12C所示，其亮度高，在标记活细胞碳酸酐酶前后其荧光寿命有显著变化，可以运用于荧光寿命成像中。
将待测染料分别溶解于DMSO溶液中，配制成不同染料的2mM母液，根据需要制配成不同浓度测试溶液，检测其荧光光谱变化及进行细胞内碳酸酐酶荧光成像。
实施例5
SML-2C在加入人碳酸酐酶I及人碳酸酐酶I抑制剂依索唑胺前后荧光发射谱图及荧光寿命测试。取2μLSML-2C母液，加入4mL PBS缓冲液(20mM， pH＝7.4)中，配制成1μM的荧光探针测试液进行荧光光谱及荧光寿命测试；后加人碳酸酐酶I，使酶的终浓度为1μM，混匀5分钟后进行荧光光谱及荧光寿命测试；最后加入抑制剂依索唑胺，使依索唑胺的终浓度为10μM，混匀20 分钟后进行荧光光谱及荧光寿命测试。
SML-2C在加入人碳酸酐酶I及人碳酸酐酶I抑制剂依索唑胺前后荧光发射谱图如图8所示，其中荧光探针浓度为1μM，人碳酸酐酶I的浓度为1μM，依索唑胺的浓度为10μM。在加入碳酸酐酶后，SML-2C的荧光发射波长发生蓝移且荧光强度增强了近五倍；在加入抑制剂依索唑胺后荧光又下降至与初始状态相似的强度，证明SML-2C能够与碳酸酐酶结合且发生荧光增强，可用于碳酸酐酶的检测和荧光成像中。
SML-2C在加入人碳酸酐酶I及人碳酸酐酶I抑制剂依索唑胺前后荧光寿命谱图如图9所示，其中荧光探针浓度为1μM，人碳酸酐酶I的浓度为1μM，依索唑胺的浓度为10μM。在加入碳酸酐酶前后，SML-2C的荧光寿命由3.53ns 增加至11.6ns，在加入抑制剂依索唑胺后荧光寿命又下降为4.5ns。证明SML-2C 能够结合碳酸酐酶，且结合前后有明显的荧光寿命的变化，可以运用与碳酸酐酶的荧光寿命成像中。
实施例6
SML-8C在加入人碳酸酐酶I及人碳酸酐酶I抑制剂依索唑胺前后荧光发射光谱及荧光寿命测试。取2μLSML-8C母液，加入4mL PBS缓冲液(20mM， pH＝7.4)中，配制成1μM的荧光探针测试液进行荧光光谱及荧光寿命测试；后加人碳酸酐酶I，使酶的终浓度为1μM，混匀5分钟后进行荧光光谱及荧光寿命测试；最后加入抑制剂依索唑胺，使依索唑胺的终浓度为10μM，混匀20 分钟后进行荧光光谱及荧光寿命测试。
SML-8C在加入人碳酸酐酶I及人碳酸酐酶I抑制剂依索唑胺前后荧光发射谱图如图10所示，其中荧光探针浓度为1μM，人碳酸酐酶I的浓度为1μM，依索唑胺的浓度为10μM。在加入碳酸酐酶后，SML-8C的荧光发射波长发生蓝移且荧光强度增强了近六倍；在加入抑制剂依索唑胺后荧光又下降至与初始状态相似的强度，证明SML-8C能够与碳酸酐酶结合且发生荧光增强，可用于碳酸酐酶的检测和荧光成像中。
SML-8C在加入人碳酸酐酶I及人碳酸酐酶I抑制剂依索唑胺前后荧光寿命谱图如图11所示，其中荧光探针浓度为1μM，人碳酸酐酶I的浓度为1μM，依索唑胺的浓度为10μM。在加入碳酸酐酶前后，SML-8C的荧光寿命由1.97ns 增加至11.6ns，在加入抑制剂依索唑胺后荧光寿命又下降为2.85ns。证明 SML-8C能够结合碳酸酐酶，且结合前后有明显的荧光寿命的变化，可以运用与碳酸酐酶的荧光寿命成像中。

Claims (5)

1.一类高亮度碳酸酐酶荧光寿命成像探针，其特征在于该探针结构式如下所示，
Figure FDA0003549403870000011
其中，
Figure FDA0003549403870000012
n为1-11之间的整数。
2.如权利要求1所述的一类高亮度碳酸酐酶荧光寿命成像探针的合成方法，其特征在于：该合成的具体方法如下：
步骤一：中间体
Figure FDA0003549403870000013
的合成：
将4-溴-1,8-萘酐与4-(氨甲基)苯磺酰胺盐酸盐及三乙胺溶解于无水乙醇中，升温至60-80℃反应10-20h，后减压除蒸溶剂，通过硅胶柱色谱分离提纯，得到中间体
Figure FDA0003549403870000014
步骤二：
Figure FDA0003549403870000015
的合成：
将中间体
Figure FDA0003549403870000021
与烷基伯胺溶于乙二醇单甲醚中，升温至120-140℃反应10-20h，减压除蒸溶剂后经过硅胶柱色谱分离提纯，得到
Figure FDA0003549403870000022
其中，n为1-11之间的整数。
3.如权利要求2中所述的一类高亮度碳酸酐酶荧光寿命成像探针的合成方法，其特征在于：步骤一中4-溴-1,8-萘酐、4-(氨甲基)苯磺酰胺盐酸盐与三乙胺的质量比为1:1-4:1-6，
4-溴-1,8-萘酐的质量与无水乙醇的体积比为1:5-25g/mL。
4.如权利要求2中所述的一类高亮度碳酸酐酶荧光寿命成像探针的合成方法，特征在于：步骤二中
Figure FDA0003549403870000023
与烷基伯胺的质量比为1:0.5-2，
Figure FDA0003549403870000024
的质量与乙二醇单甲醚的体积比为1:5-20g/mL。
5.如权利要求1所述的一类高亮度碳酸酐酶荧光寿命成像探针在荧光成像、分子探针及荧光传感领域的应用。
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