CN108516979B - 一种基于萘酰亚胺-罗丹明的化合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于萘酰亚胺‑罗丹明的化合物，如通式(I)所示：
Figure DDA0001665165480000011
各取代基定义见说明书。本发明还公开了一种基于萘酰亚胺‑罗丹明的化合物的检测组合物、检测试剂盒，上述检测组合物或检测试剂盒用作溶酶体靶向检测汞离子的荧光探针及荧光探针在水环境和生物细胞体系中检测汞离子的用途。本发明实现了荧光探针对汞离子的快速检测，选择性好，是一种具有生色传感功能的荧光探针。

Description

一种基于萘酰亚胺-罗丹明的化合物及其应用
技术领域
本发明涉及荧光传感器技术领域，具体地说，涉及一种基于萘酰亚胺-罗丹明的化合物及其应用。
背景技术
近些年来，检测重金属离子和过渡金属离子的荧光探针发展受到了相当多的关注，因为这些离子在化学、生物和环境分析中具有非常重要的意义。在这些金属离子中，汞离子以其特别高的毒性而闻名，即使在极低的浓度下，汞离子也会对人体健康造成严重损害。因此，寻找具有选择性和高效的分析方法来检测水溶液中的Hg2+具有相当重要的意义，已成为当前化学研究的重要课题。
随着比率型荧光探针的发展和应用，开发有效的比率型探针引起了人们的兴趣。在众多比率型荧光探针的检测机理中，荧光共振能量转移(FRET)感应机制无论在生物相容性还是检测灵敏度方面都具有很大的优势，已被广泛用于比率型荧光探针。通过将具有优良光物理性能的萘酰亚胺荧光团连接到罗丹明分子上，利用萘酰亚胺的发射光谱与罗丹明吸收光谱的重叠，合成基于FRET的比率型荧光探针的报道逐渐发展起来。据我们所知，用于在溶酶体中检测Hg2+的双发射荧光增强型探针很少被开发出来。因此，设计和合成具有双通道荧光增强响应并适用于环境和生物系统中检测汞离子的新型比率传感器仍然是一个挑战。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于萘酰亚胺-罗丹明的化合物。
本发明的另一个目的是提供一种所述基于萘酰亚胺-罗丹明的化合物用作溶酶体靶向检测汞离子的荧光探针。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明的一个方面提供了一种基于萘酰亚胺-罗丹明的化合物，如通式(I)所示：
Figure BDA0001665165460000021
其中：
通式(I)中：
R选自H、烷基、烷氧基、烯基、芳基、亚芳基、环烷基；
n和m独立地选自1至20的整数；
k选自0至20的整数。
本发明优选的化合物为，通式(I)中：
R选自H、C1～C20烷基、C1～C20烷氧基、芳基、环烷基；
n选自1、3、5、7、9、11；
m选自1、3、5、7、9、11；
k选自0、2、4、6、8、10、12。
本发明更优选的化合物为，通式(I)中：
R为H、甲基、异丁基、正丁基、乙基、苯基、正辛基、正丙基、异丙基、庚基、环己基中的一种；
n选自1、3、5、7、9、11；
m选自1、3、5、7、9、11；
k选自0、2、4、6、8、10、12。
本发明最优选的化合物如下所示(式I中，R＝乙基；n＝1；m＝1；k＝0)：
Figure BDA0001665165460000031
上面给出的通式(I)化合物的定义中，汇集所用术语一般定义如下：
烷基是指直链或支链形式，例如：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基等。
烷氧基是指烷基末端连有氧原子的基团，例如：甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基等。
烯基是指直链或支链形式，有1到2个碳碳双键的基团，例如：乙烯基、烯丙基、异烯丙基、戊烯基、己烯基、丙烯基。
芳基是指单、二或三环烃化合物，其中至少一个环为芳香环，每个环含最多7个碳原子，例如：苯基、联苯基、三联苯基、萘基、苊基、蒽醌基、菲基、蒽基、芘基、苝基和芴基。
亚芳基是指二价的芳族碳环基团，具体而言，是指亚苯基(-C6H4-)和二亚苯基(-C6H4-C6H4-)，或含有一个或更多个“杂原子”(即除了碳之外的原子，例如氮、氧、硫、硅、硒、磷)的具有5或6个原子的芳环。
环烷基是指取代或未取代的环状烷基，例如：环丙基、环戊基或环己基。
本发明的通式(I)化合物可由如下方法制备：
(1)以化合物Ⅱ：
Figure BDA0001665165460000032
和化合物Ⅲ：
Figure BDA0001665165460000033
为起始物，在乙醇中反应，纯化后得到化合物Ⅳ：
Figure BDA0001665165460000041
(2)以化合物Ⅳ和化合物Ⅴ：
Figure BDA0001665165460000042
为起始物，在四氢呋喃和水中反应，纯化后得到化合物Ⅵ：
Figure BDA0001665165460000043
(3)以化合物Ⅵ和化合物Ⅶ：
Figure BDA0001665165460000044
在甲醇中反应，纯化后得到通式(I)化合物：
Figure BDA0001665165460000045
步骤(1)具体包括：将化合物Ⅱ和化合物Ⅲ按摩尔比为1:(1.5～2.5)加入乙醇中，待两者都溶解后，于80℃氮气保护下反应8-48h；待反应结束后，过滤，收集滤饼，随后以二氯甲烷为洗脱剂，过硅胶柱分离得到化合物Ⅳ；
步骤(2)具体包括：将化合物Ⅳ和化合物Ⅴ按摩尔比为1:(1.5～2.5)加入到四氢呋喃和水3:1的混合溶液中，加入3-6当量的K2CO3、四(三苯基膦)钯，四(三苯基膦)钯与化合物Ⅳ的摩尔比为(0.02～0.04):1，于80℃氮气保护下反应6-48h；反应结束后，旋干四氢呋喃，用二氯甲烷萃取粗产品，随后以二氯甲烷-乙酸乙酯为洗脱剂，过硅胶柱分离得到化合物Ⅵ；
步骤(3)具体包括：将化合物Ⅵ和化合物Ⅶ按摩尔比为1:(1.5～2.5)加入甲醇中，加入对甲苯磺酸，对甲苯磺酸与化合物Ⅵ的摩尔比为1:(1.1～2.5)，于65℃氮气保护下反应8-10h；反应结束后，旋干甲醇，随后以二氯甲烷-甲醇为洗脱剂，过硅胶柱分离得到通式(I)化合物。
步骤(3)中的化合物Ⅶ是由罗丹明和不同的胺合成的，罗丹明的结构如下：
Figure BDA0001665165460000051
其中：R为H、甲基、异丁基、正丁基、乙基、苯基、正辛基、正丙基、异丙基、庚基、环己基中的一种。
向罗丹明的无水乙醇溶液中滴加过量的胺，罗丹明与胺的摩尔比为1:(2～5)，并在氮气保护下回流过夜。将该溶液冷却至室温，真空浓缩并除去大部分溶剂。向混合物中加入大量的水，过滤沉淀并用水洗涤，得到化合物Ⅶ。
所述胺为水合肼、乙二胺、1,4-丁二胺等。
本发明的另一个方面提供了一种检测组合物，含有所述的基于萘酰亚胺-罗丹明的化合物和溶剂。
所述溶剂为乙醇和去离子水的混合溶液。
所述检测组合物含有浓度为15～25μM(优选为20μM)的所述的基于萘酰亚胺-罗丹明的化合物，乙醇和去离子水体积比为5:1。
本发明的再一个方面提供了一种检测试剂盒，所述试剂盒含有所述的基于萘酰亚胺-罗丹明的化合物，或所述的检测组合物。
本发明的再一个方面提供了一种所述的基于萘酰亚胺-罗丹明的化合物或所述的检测组合物用作溶酶体靶向检测汞离子的荧光探针或荧光传感器。
本发明的再一个方面提供了一种所述的用作溶酶体靶向检测汞离子的荧光探针或荧光传感器在水环境和生物细胞体系中检测汞离子的用途。
所述荧光探针或荧光传感器用于水环境和生物细胞体系中检测汞离子的用途，对汞离子的含量传感检测包含荧光检测、目视定性检测、细胞成像检测，对汞离子的检测机理如图1所示，图1是本发明的基于萘酰亚胺-罗丹明的化合物用作溶酶体靶向检测汞离子的荧光探针在水环境和生物细胞体系中检测汞离子的机理示意图，从图中可以看出，罗丹明螺内酰胺上的N原子具有孤对电子，当分子受到激发时，孤对电子会通过光致电子转移(PET)过程从N原子转移到萘酰亚胺荧光团上，从而在一定程度上猝灭萘酰亚胺的荧光。加入汞离子后，汞离子在与萘酰亚胺噻吩上的S原子络合过程中会与螺内酰胺上的N原子结合，从而阻止了PET过程，并显著增强了萘酰亚胺部分的荧光。此外，酰胺N和汞离子之间的键合作用促使罗丹明螺内酰胺环开环，改变了萘酰亚胺和罗丹明两个荧光团间的推拉电子强度，使得萘酰亚胺部分荧光光谱红移，并观察到罗丹明部分的特征荧光发射峰。由于罗丹明的开环形式是有效的能量受体，因而荧光共振能量转移(FRET)过程发生在两个荧光团之间，由萘二甲酰亚胺供体相应地转移至罗丹明受体。由此表明，所述探针对汞离子的感应机制是荧光共振能量转移和光致电子转移过程的协同作用。
所述荧光探针用于在生物体系中细胞的溶酶体内检测汞离子，与商业化的溶酶体特异性染料LysoTracker DND-26进行共定位实验，成像重合率高，因而，此探针可以作为细胞内溶酶体内检测汞离子的探针。
由于采用上述技术方案，本发明具有以下优点和有益效果：
本发明的基于萘酰亚胺-罗丹明的化合物原料易得，合成步骤简单，且后处理过程比较容易。
本发明的基于萘酰亚胺-罗丹明的化合物用作溶酶体靶向检测汞离子的荧光探针，实现了探针对汞离子的快速检测，选择性好，用肉眼就可以观察到溶液颜色的变化，在紫外灯下可以观察到荧光颜色变化，是一种具有生色传感功能的荧光探针。
本发明的基于萘酰亚胺-罗丹明的化合物用作溶酶体靶向检测汞离子的荧光探针，可以应用于细胞溶酶体中检测汞离子，通过与商业化溶酶体染料进行比较，发现该探针对汞离子生物成像与商业化溶酶体染料成像的重合率高，说明此探针可以作为细胞中溶酶体内汞离子检测探针。基于此探针的特异性和显著的颜色变化，可进行实时定性及定量的目视比色法检测。故而，本发明是一种简单、快速、灵敏的汞离子特异性检测试剂，在生物分子检测领域具有广阔的应用前景。
本发明的基于萘酰亚胺-罗丹明的化合物用作溶酶体靶向检测汞离子的荧光探针在水环境和生物细胞体系中检测汞离子的用途，实验操作简单、易于工业化、成本低，可以作为荧光探针在水环境和生物体系中检测汞离子。
附图说明
图1是本发明的基于萘酰亚胺-罗丹明的化合物用作溶酶体靶向检测汞离子的荧光探针在水环境和生物细胞体系中检测汞离子的机理示意图。
图2是实施例1制备的化合物I-1的1HNMR图谱。
图3是实施例1制备的化合物I-1中加入不同量的汞离子的荧光光谱图。
图4是实施例1制备的化合物I-1对不同离子的选择性荧光光谱图。
图5是实施例1制备的化合物I-1的溶液在汞离子加入前后溶液颜色的变化图(a)及紫外灯照射下的荧光变化图(b)。
图6是实施例1制备的化合物I-1检测外源性汞离子荧光成像图，其中I-1(20μM)在Hg2+(400μM)存在下的A549细胞荧光图像，(a)是明亮的可视化图像；(b)是激发波长在405nm处的图像；(c)是激发波长为514nm的图像；(d)是b和c的合并图像。
图7是实施例1制备的化合物I-1与商业化的溶酶体特异性染料LysoTracker DND-26共定位的荧光成像图，(a)明场的可视化图像；(b)来自Lyso-Tracker的图像(绿色)；(c)来自I-1的图像(红色)；(d)b和c的合并图像；Lyso-Tracker Green DND-26和I-1的激发波长分别为488nm和514nm。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
实施例1
目标化合物I-1的制备
Figure BDA0001665165460000081
(1)化合物Ⅳ-1的合成
将4-(2-氨基乙基)吗啉(2.5g，18mmol)和4-溴-1,8-萘二甲酸酐(2.5g，9mmol)溶于50mL乙醇中，混合物回流过夜，然后冷却至室温，过滤收集灰色粗产物，然后通过柱色谱法(洗脱液：二氯甲烷)纯化，得到3.07g灰白色固体，产率为87％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):8.66(d,J＝7.2,1H),8.58(d,J＝8.4,1H),8.41(d,J＝8.0,1H),8.05(d,J＝8.0,1H),7.86(t,J＝7.6,1H),4.35(t,J＝6.8,2H),3.69(t,J＝4.4,4H),2.72(t,J＝6.8,2H),2.61(br,4H).
合成路线如下：
Figure BDA0001665165460000082
(2)化合物Ⅵ-1的合成
向化合物Ⅳ-1(0.97g，2.5mmol)和5-甲酰基-2-噻吩硼酸(0.78g，5mmol)的THF(30mL)混合溶液中加入2M K2CO3水溶液(10mL)，加入四(三苯基膦)钯(Pd(PPh3)4)(100mg，0.08mmol)，并将该混合物在氮气保护下回流。搅拌12小时后，将溶液冷却并真空浓缩。残余物用二氯甲烷萃取并用MgSO4干燥，然后真空浓缩。通过柱层析(二氯甲烷：乙酸乙酯＝30:1，V/V)纯化黄色粗产物，得到0.55g浅棕色固体，产率为52％。熔点为121-124℃。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):10.02(s,1H),8.67(d,J＝7.2,1H),8.64(d,J＝7.6,1H),8.53(d,J＝8.8,1H),7.91(d,J＝3.6,1H),7.87(d,J＝7.6,1H),7.81(t,J＝7.6,1H),7.44(d,J＝4.0,1H),4.39(t,J＝6.8,2H),3.71(br,4H),2.77(br,2H),2.64(br,4H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ(ppm):182.842,163.974,163.698,149.214,145.076,137.466,136.447,131.687,131.611,130.516,129.758,129.707,128.933,128.752,127.816,123.195,123.063,66.950,56.092,53.786,37.259.
合成路线如下：
Figure BDA0001665165460000091
(3)化合物Ⅶ-1的合成
向罗丹明B(1.0g，2.09mmol)的无水乙醇(50mL)溶液中滴加过量的水合肼(10mL)，并在氮气保护下回流过夜。将该溶液冷却至室温，真空浓缩并除去大部分溶剂。向混合物中加入大量的水，过滤沉淀并用水洗涤，得到0.65g浅粉色固体，产率为68％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm):7.76(d,J＝5.6,1H),7.47(t,J＝3.2,2H),6.98(d,J＝7.2,1H),6.37(s,2H),6.33(s,4H),4.26(s,2H),3.31(m,8H),1.08(t,J＝6.8,12H).
Figure BDA0001665165460000092
(4)目标化合物I-1的合成
在化合物Ⅵ-1(100mg，0.24mmol)和化合物Ⅶ-1(217mg，0.48mmol)的甲醇(20mL)混合溶液中加入对甲苯磺酸(50mg，0.29mmol)，并在氮气保护下回流过夜。冷却至室温后，将溶液真空浓缩。通过柱色谱(二氯甲烷：乙酸乙酯：甲醇＝100:10:1，V/V)纯化红色粗产物，得到132mg红色固体，产率为64％，熔点为136-138℃。图2是实施例1制备的化合物I-1的1HNMR图谱。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm):9.11(s,1H),8.56(s,1H),8.54(s,1H),8.47(d,J＝7.6,1H),7.89(m,3H),7.60(m,2H),7.46(d,J＝4.0,1H),7.41(d,J＝3.6,1H),7.10(d,J＝7.2,1H),6.44(m,4H),6.36(d,J＝2.4,1H),6.34(d,J＝2.4,1H),4.20(t,J＝6.8,2H),3.53(t,J＝3.6,4H),3.30(q,J＝7.2,8H),2.58(t,J＝6.8,2H),2.47(br,4H),1.07(t,J＝6.8,12H).HRMS-ESI(m/z):[M+H]+Calcd.For(C51H51N6O5S),859.3642,found:859.3641.
合成路线如下：
Figure BDA0001665165460000101
实施例2
化合物I-1随汞离子加入量的增加荧光谱图的变化：
取实施例1制备的化合物I-1溶于乙醇和去离子水的溶液中，乙醇和去离子水的体积比为5:1，制成20μM测试储备溶液，加入不同当量(0-30eq)的汞离子标准溶液，以400nm为激发光，测量其荧光性质，荧光光谱如图3所示，图3是实施例1制备的化合物I-1中加入不同量的汞离子的荧光光谱图，由图3可知，随着汞离子加入，萘酰亚胺部分的荧光强度逐渐增加，并缓慢红移到480nm。同时，585nm处出现罗丹明开环对应的特征发射峰，并随着汞离子的加入逐渐增强。这种萘酰亚胺在480nm处的荧光和罗丹明在585nm处的荧光强度随汞离子浓度增加而一起增强的现象在萘酰亚胺-罗丹明二元体系探针分子中是不多见的。
实施例3
化合物I-1对不同分子或离子的选择性
分别从实施例2中20μM测试储备溶液中取出3mL加入比色皿中，加入30倍当量的竞争分子标准溶液，其中一个加入等摩尔量的汞离子标准溶液，以400nm为激发光，检测溶液的荧光发射光谱变化，结果如图4所示，图4是实施例1制备的化合物I-1对不同离子的选择性荧光光谱图。由图4可以看出，其它金属离子对化合物I-1的荧光几乎没有影响，而汞离子溶液的加入使化合物I-1在480nm和585nm处的荧光显著增强。
实施例4
化合物I-1对汞离子的可视化检测
分别从实施例2中20μM测试储备溶液中取出3mL加入样品瓶中，加入30倍当量的汞离子标准溶液，汞离子可以使化合物I-1荧光探针的溶液发生明显的颜色变化，如图5所示，图5是实施例1制备的化合物I-1的溶液在汞离子加入前后溶液颜色的变化图(a)及紫外灯照射下的荧光变化图(b)，溶液颜色由黄色变为红色(图5a)，伴随着紫外灯下肉眼可视化的汞离子诱导的荧光探针由浅蓝色荧光转变为红色荧光(图5b)，说明是一种具有生色传感功能的荧光探针。
实施例5
化合物I-1对细胞外源性汞离子荧光成像
将本发明的化合物I-1应用于A549细胞中对外源性的汞离子进行荧光成像。具体操作步骤为将A549细胞在含有10％FBS的DMEM中培养。选取两组对数生长的细胞将其接种在共焦盘上过夜。将其中一组用400μM Hg(ClO4)2在DMEM中预处理30分钟并用PBS洗涤三次后，将细胞与20μM化合物I-1在DMEM中孵育1.5小时，再加入溶酶体特异性染料LysoTrackerDND-26与化合物I-1共同染色细胞，孵育45分钟。而另一组细胞直接与20μM化合物I-1在DMEM中孵育1.5小时。在用荧光共聚焦激光扫描显微镜检测荧光并拍照之前，两组细胞均用PBS洗涤三次。蓝色、绿色和红色荧光分别在405nm、488nm和514nm处激发。
成像结果如图6所示，图6是实施例1制备的化合物I-1检测外源性汞离子荧光成像图，其中I-1(20μM)在Hg2+(400μM)存在下的A549细胞荧光图像，(a)是明亮的可视化图像；(b)是激发波长在405nm处的图像；(c)是激发波长为514nm的图像；(d)是b和c的合并图像；首先进行明场成像，可以看到细胞大致的轮廓，然后用405nm进行激发观察在未加入汞离子前的荧光成像情况，此时观察到微弱的蓝色荧光发射。用汞离子预处理后的细胞用514nm光激发后观察到有红色荧光发出，说明此荧光探针可以对外源性的汞离子进行荧光成像。
如图7所示，图7是实施例1制备的化合物I-1与商业化的溶酶体特异性染料LysoTracker DND-26共定位的荧光成像图，(a)明场的可视化图像；(b)来自Lyso-Tracker的图像(绿色)；(c)来自I-1的图像(红色)；(d)b和c的合并图像；Lyso-Tracker Green DND-26和I-1的激发波长分别为488nm和514nm；用488nm激发溶酶体特异性染料LysoTrackerDND-26，可以观察到有绿光发出，用软件进行处理可以得到两组高度重合的细胞图。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

Claims (7)

1.一种基于萘酰亚胺-罗丹明的化合物，其为式I-1所示化合物：
Figure FDA0002489451110000011
2.一种检测组合物，其特征在于：所述检测组合物含有如权利要求1所述的化合物和溶剂。
3.根据权利要求2所述的检测组合物，其特征在于：其中所述溶剂为乙醇和去离子水的混合物。
4.根据权利要求2或3所述的检测组合物，其特征在于：所述检测组合物含有浓度为15μM～25μM的权利要求1所述的化合物，乙醇和去离子水体积比为5:1。
5.一种检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒含有权利要求1所述的化合物，或权利要求2或3所述的检测组合物。
6.如权利要求1所述的化合物在制备溶酶体靶向、在水环境和生物细胞体系中检测汞离子的荧光探针或荧光传感器中的应用。
7.如权利要求2或3所述的检测组合物在制备溶酶体靶向、在水环境和生物细胞体系中检测汞离子的荧光探针或荧光传感器中的应用。
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