CN113201132B

CN113201132B - 一种基于单分散四臂聚乙二醇的罗丹明b衍生物荧光探针分子及其制备方法

Info

Publication number: CN113201132B
Application number: CN202110445658.3A
Authority: CN
Inventors: 彭媛媛; 张安林; 赵思纯
Original assignee: Changsha Innovation Pharmaceutical Industrial Technology Research Institute Co ltd
Current assignee: Changsha Innovation Pharmaceutical Industrial Technology Research Institute Co ltd
Priority date: 2021-04-23
Filing date: 2021-04-23
Publication date: 2023-12-01
Anticipated expiration: 2041-04-23
Also published as: CN113201132A

Abstract

本发明旨在提供一种基于单分散四臂聚乙二醇的罗丹明B衍生物荧光探针分子及其制备方法，本发明提供的荧光探针分子对水溶液中Hg²⁺的检测具有很高的选择性，在水溶液中对Hg²⁺表现出特异性荧光反应，并且具有较低的浓度检测限。

Description

一种基于单分散四臂聚乙二醇的罗丹明B衍生物荧光探针分子及其制备方法

技术领域

本发明属于检测领域，具体的设计一种荧光探针及其制备方法，尤其涉及一种基于单分散四臂聚乙二醇的罗丹明B衍生物荧光探针分子及其制备方法

背景技术

重金属及其衍生物是全球范围内广泛存在的污染物，已引起一系列健康和环境问题，因此，重金属的检测近年来得到了越来越多的关注。由于汞在生物学中的高毒性和在工业中的广泛应用，汞离子带来的重金属污染一直以来都备受关注，所以对于汞离子的高灵敏检测是分析化学领域中亟待解决的问题之一。目前发现的重金属检测荧光探针很多，主要是通过金属络合改变传感器的分子结构或电子性质，从而导致荧光性质的改变，可以通过监测荧光变化来达到检测金属离子的目的。然而与其它普通过渡金属阳离子相比，汞离子荧光探针的发展总体较为缓慢，许多荧光(FL)有机染料的小分子汞化学传感器已被开发出来，但其中大多数需要混合一定比例的有机溶剂来检测和/或离子选择性不尽人意。此外，一些基于汞离子荧光探针的合成路线复杂，总收率较低，所有这些缺点都影响了它们在实际样本监测中的实用性。因此，开发基于多机制的高灵敏度的荧光探针用于水溶液中汞离子的检测是非常有必要的。

发明内容

本发明旨在提供一种操作简便、灵敏度高、检测效率高的检测水溶液中汞离子含量的荧光探针及其制备方法。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一方面，本发明提供了一种基于单分散四臂聚乙二醇的罗丹明B衍生物荧光探针分子，其特征在于，具有以下结构，

可以理解，该荧光探针分子X是由罗丹明B、四臂PEG链和三氮唑部分组成。罗丹明衍生物之所以被选择作为构建该荧光探针的基础，是因为它理想的光物理性质和独特的非荧光螺环形式转变为荧光开环形式的特性。而四臂PEG链和三氮唑部分的选择首先是基于较长的PEG链能明显改善荧光探针分子的水溶性，而且4-Arm-PEG96-N3(VIII)是目前实验室常规方法能获得的最长链段的单分散多臂型聚乙二醇，这种多臂结构能同时固载多个荧光基团；其次是基于Hg²⁺与PEG的配位性能和亲氮性质。Hg²⁺与四臂PEG和三氮唑基团的相互作用可以使罗丹明染料更灵敏地从无荧光螺旋体环型转变为荧光开环型。同时利用PEG的高度亲水性和类冠醚结构，设计合成出了新的可在纯水介质中检测Hg²⁺的荧光探针。

另一方面，本发明提供了一种基于单分散四臂聚乙二醇的罗丹明B衍生物荧光探针分子中间体式VIII，其特征在于，具有以下结构，

又一方面，本发明提供了一种基于单分散四臂聚乙二醇的罗丹明B衍生物荧光探针分子中间体式VIII化合物的制备方法，其特征在于，具有以下步骤：

步骤一：在无水四氢呋喃中，在氢化钠的作用下式(I)化合物HO-PEG12-OH与式(II)化合物N3-PEG4-Tos发生反应得到式(III)化合物HO-PEG16-N3；

步骤二：在无水四氢呋喃中，在氢化钠作用下，式(IV)化合物四甘醇单磺酸酯HO-PEG4-Tos与式(III)化合物HO-PEG16-N3反应得到式(V)化合物HO-PEG20-N3；

步骤三：在无水四氢呋喃中，在氢化钠作用下，式(V)化合物HO-PEG20-N3与式(II)化合物N3-PEG4-Tos反应获得式(VI)化合物HO-PEG24-N3；

步骤四：在一定温度下，过量的式(VI)化合物HO-PEG24-N3与式(VII)化合物季戊四醇对甲苯磺酸酯反应，从而获得式(VIII)化合物4-Arm-PEG96-N3。

在一些实施方式中，荧光探针分子中间体式VIII化合物的制备方法具有以下步骤：

步骤一：在氩气保护下，将式(I)化合物和无水四氢呋喃混合，冰浴条件下冷却至0-5℃，再将氢化钠分三批慢慢加入到反应体系，将反应混合物升至常温，接着添加式(II)化合物的无水四氢呋喃溶液，反应在氩气气氛下进一步搅拌反应48h得到式(III)化合物；

步骤二：在氩气保护下，将式(III)化合物和无水四氢呋喃混合，冰浴条件下冷却至0-5℃，再将氢化钠分三批慢慢加入到反应体系，将反应混合物加热到40℃，接着将式(IV)化合物的无水四氢呋喃溶液缓慢加入到反应体系，反应在氩气气氛下进一步搅拌反应24h得到式(V)化合物；

步骤三：在氩气保护下，将式(V)化合物和无水四氢呋喃混合，冰浴条件下冷却至0-5℃，再将氢化钠分三批慢慢加入到反应体系，将反应混合物加热到40℃，接着将式(IV)化合物的无水四氢呋喃溶液缓慢加入到反应体系，反应在氩气气氛下进一步搅拌反应24h得到式(VI)化合物；

步骤四：在氩气保护下，将式(VI)化合物和甲苯混合，冰浴条件下冷却至0-5℃，再将氢化钠分多次慢慢加入到反应体系，将反应混合物加热到80℃，搅拌2h后，加入式(VII)化合物，将混合物在90℃下搅拌24小时得到式(VIII)化合物。

在一些实施方式中，荧光探针分子中间体式VIII化合物的制备方法步骤三中获得的式(VI)化合物需要通过甲基叔丁基醚多次低温重结晶来进一步纯化。

在一些实施方式中，荧光探针分子中间体式VIII化合物的制备方法步骤四中获得的式(VIII)化合物需通过去离子水透析净化24小时来进一步纯化。

在一些实施方式中，步骤一中所述式(I)化合物与式(II)化合物的摩尔比为0.5-2.5:1。

在一些实施方式中，步骤一中述式(I)化合物与式(II)化合物的摩尔比为0.5-1.5:1。

在一些实施方式中，步骤一中述式(I)化合物与式(II)化合物的摩尔比为0.625:1。

在一些实施方式中，步骤二中式(III)化合物与式(IV)化合物的摩尔比为1:2-6。

在一些实施方式中，步骤二中式(III)化合物与式(IV)化合物的摩尔比为1:3-4。

在一些实施方式中，步骤二中式(III)化合物与式(IV)化合物的摩尔比为1:3。

在一些实施方式中，步骤三中式(V)化合物与式(IV)化合物的摩尔比为1:2-4。

在一些实施方式中，步骤三中式(V)化合物与式(IV)化合物的摩尔比为1：2.4-3.6。

在一些实施方式中，步骤三中式(V)化合物与式(IV)化合物的摩尔比为1:2.8。

在一些实施方式中，步骤四中式(VI)化合物与式(VII)化合物的摩尔比为2-8:1。

在一些实施方式中，步骤四中式((VI)化合物与式(VII)化合物的摩尔比为4-6:1

在一些实施方式中，步骤四中式(VI)化合物与式(VII)化合物的摩尔比为5.29:1。

再一方面，本发明提供了一种基于单分散四臂聚乙二醇的罗丹明B衍生物荧光探针分子的制备方法，其特征在于，具有以下步骤：

步骤一：通过罗丹明B与炔丙胺反应得到式(IX)化合物；

步骤二：在无水四氢呋喃中，式(IX)化合物和式(VIII)化合物4-Arm-PEG96-N3在铜试剂催化下生成式(X)的目标化合物三氮唑衍生物4-Arm-PEG96-RB。

在一些实施方式中，荧光探针分子的制备方法步骤二中是先将式(IX)化合物与式(VIII)化合物溶于无水四氢呋喃中，并在氩气保护下室温搅拌；再将铜试剂和N，N-二异丙基乙胺添加到反应混合物中，持续搅拌，反应得到式(X)化合物。

在一些实施方式中，荧光探针分子的制备方法步骤二获得的式(X)化合物需通过去离子水透析净化24小时来进一步纯化。

在一些实施方式中，步骤二中式(IX)化合物与式(VIII)化合物的摩尔比为4-10:1。

在一些实施方式中，步骤二中式(IX)化合物与式(VIII)化合物的摩尔比为5-8:1。

在一些实施方式中，步骤二中式(IX)化合物与式(VIII)化合物的摩尔比为5:1。

本发明提供的一种基于单分散四臂聚乙二醇的罗丹明B衍生物荧光探针分子对水溶液中Hg²⁺的检测具有很高的选择性，在水溶液中对Hg²⁺表现出特异性荧光反应，并且具有较低的浓度检测限。

附图说明

图1为50μM探针X在含有200μM金属离子和空白的水溶液中的紫外-可见光谱

图2为200μM不同金属阳离子分别与50μM探针X水溶液混合后的荧光发射光谱(λex＝472nm；λem＝572nm)

图3为50μM探针X在水溶液中(λex＝472nm)与不同浓度的Hg²⁺(0-6当量)混合后的荧光发射光谱；插图：572nm处荧光发射强度的变化

图4为50μM探针X水溶液中分别加入200μM各种金属离子后在572nm处荧光强度为(λex＝472nm)

图5为是在pH＝7.5的PBS缓冲溶液中，不同Hg²⁺浓度(0-60μM)下探针X体系在572nm处的荧光强度

图6为为是在pH＝7.5的PBS缓冲溶液中，不同Hg²⁺浓度(0-10μM)下探针X体系在572nm处的荧光强度

具体实施方式

为了便于理解，下面将对本申请进行更全面的描述，并给出了本申请的较佳实施例。但是，本申请可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和

/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

主要仪器与试剂

所有涉及对空气敏感试剂的反应都是在惰性气体(氩气)保护下进行的；无水四氢呋喃和二氯甲烷通过分子筛干燥备用；薄层色谱(TLC)监测反应过程采用的是0.25mm硅胶板(60F-254，SIGMA)；各中间体化合物通过硅胶(E.Merck 230-400目)柱层析纯化；1H NMR和13C NMR以CDCl3作为溶剂，以TMS作为内标(Bruker公司的AV-400核磁共振仪)：基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)采用德国Bruker公司的Ultrafle Xtreme质谱仪进行测试，以CCA(α-氰基-4-羟基肉桂酸)为基质；重要起始物料三甘醇和四甘醇购自陶氏化学(中国)有限公司，其余常用试剂规格均为市售分析纯，使用前均需要经过精制。

起始物料式(I)化合物HO-PEG12-OH按照文献[38-39]报道的方法制备。

实施例1式III化合物的制备

在氩气保护下，将十二甘醇(HO-PEG₁₂-OH)I(140.5g，0.25mol)和四氢呋喃(200ml)加入到500ml圆底烧瓶中，冰浴条件下冷却至0℃左右。将氢化钠(60％分散于矿物油，2.4g)分三批慢慢加入到反应体系。将反应混合物升至常温，接着通过注射器添加N₃-PEG₄-Tos(14.92g)的四氢呋喃(10ml)溶液。反应在氩气气氛下进一步搅拌反应48h。TLC监测反应结束后，往反应中缓慢加入200ml盐水淬灭过量的氢化钠。通过减压蒸馏除去有机溶剂。用二氯甲烷(400ml×3)将粗品洗涤三次，收集有机相。依次用50wt％的碳酸氢钠(250ml)水溶液和水(200ml)洗涤有机相。将有机相用无水硫酸钠干燥。有机相收集浓缩后得到粗品经柱层析(硅胶，二氯甲烷/甲醇＝90：10)纯化，得到HO-PEG₁₆-N₃ III(15.13g，20.25mmol，50.6％)为淡黄色粘稠油状液体。

¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)，δ：3.64-3.46(m,62H,CH₂CH₂O)，3.29-3.22(t,2H,J＝4.1Hz,CH₂N₃)，2.94(s,1H,OH)。¹³C-NMR(100MHz，CDCl₃)，δ：72.33，70.50，70.19，69.68，60.96，50.30。MALDI-TOF-MS：calculated M_w＝747.44g/mol，found m/z[M+Na⁺]＝770.55，[M+H⁺]＝748.38。

实施例2式V化合物的制备

在氩气保护下，将HO-PEG₁₆-N₃(III)(10g，13.4mmol)和四氢呋喃(200ml)加入到500ml圆底烧瓶中，冰浴条件下反应液冷却至0℃左右。将氢化钠(60％质量分数分散于矿物油中，1.2g，30mmol)分三批慢慢加入到反应体系，时间持续为30分钟。将反应混合物加热到40℃，然后用注射器将HO-PEG₄-Tos(IV)(13.92g，40mmol)的干燥的四氢呋喃(20ml)溶液缓慢加入到反应体系，滴加过程持续2小时。将反应混合物在氩气气氛下进一步搅拌24h。反应结束后，加入200ml盐水淬灭过量的氢化钠，减压蒸除有机溶剂。用二氯甲烷(200ml×3)将浆状粗品提取三次，收集并合并有机提取物，用50wt％的碳酸氢钠(250ml)水溶液和水(200ml)洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥。有机相收集浓缩后得到粗品经柱层析(硅胶，二氯甲烷/甲醇＝95：5v/v)，得到N₃-PEG₂₀-OH(V)(8.48g，9.19mmol，68.6％)为淡黄色粘稠油状液体。

¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)，δ：3.75-3.58(m,78H,CH₂CH₂O)；3.31(t,2H,J＝4.2Hz,CH₂N₃)；3.06(s,1H,OH)。¹³C-NMR(100MHz，CDCl₃)，δ：72.34，70.52，69.93，69.66，61.23，50.32。MALDI-TOF-MS：calculated M_w＝923.54g/mol，found m/z[M+Na⁺]＝946.51，m/z[M+H⁺]＝924.66。

实施例3式VI化合物的制备

在氩气保护下，将HO-PEG₂₀-N₃(V)(8g，8.67mmol)和四氢呋喃(100ml)加入到250ml圆底烧瓶中，冰浴条件下冷却至0℃左右。将氢化钠(60％质量分数分散于矿物油中，0.8g，20mmol)分三批慢慢加入到反应体系，时间持续为30分钟。将反应混合物加热到40℃，然后用注射器将HO-PEG₄-Tos(IV)(8.35g,24mmol)的干燥的四氢呋喃(20ml)溶液缓慢加入到反应体系，滴加过程持续2小时。将反应混合物在氩气气氛下进一步搅拌24h。反应结束后，加入200ml盐水淬灭过量的氢化钠，减压蒸除有机溶剂。用二氯甲烷(200ml×3)将浆状粗品提取三次，收集并合并有机提取物，用50wt％的碳酸氢钠(250ml)水溶液和水(200ml)洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥。有机相收集浓缩后得到粗品粗品经闪蒸柱层析(硅胶，二氯甲烷/甲醇95：5v/v)再结晶得到HO-PEG₂₄-N₃(VI)(6.9g，6.09mmol，70.24％)为灰白色粉末。

¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)，δ：3.70-3.62(m,94H,CH₂CH₂O)；3.38(t,2H,J＝4.4Hz,CH₂N₃)；2.71(s,1H,OH)。¹³C-NMR(100MHz，CDCl₃)，δ：72.42，70.52，70.16，69.86，61.46，50.50。MALDI-TOF-MS：calculated M_w＝1099.65g/mol，found m/z[M+Na⁺]＝1122.72，m/z[M+H⁺]＝1100.54。

实施例4式VIII化合物的制备

将HO-PEG₂₄-N₃(VI)(6g，5.29mmol)和甲苯(100ml)充分混合于250ml圆底烧瓶中，混合物在氩气保护下于冰浴中冷却至0℃。将氢化钠(60％分散于矿物油中，0.6g，15mmol)分多次加入到反应溶液中，持续加料时间为30分钟，将反应混合物加热到80℃。搅拌2h后，加入0.367g(1mmol)季戊四醇对甲苯磺酸酯(VII)，将混合物在90℃下搅拌24小时。待反应结束后，反应体系冷却至常温，用30ml盐水淬灭。将甲苯在减压条件下去除，残余物料用100ml二氯甲烷提取。提取液过滤并浓缩后通过柱层析(硅胶，二氯甲烷/甲醇＝12：1，v/v)和透析(截留分子量：2KD)纯化，得到3.35g白色固体状4-Arm-PEG₉₆-N₃(VIII)，收率75％。

¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)，δ：3.80-3.62(m,392H,CH₂CH₂O,CH₂O)；3.39(t,8H,J＝4.4Hz,CH₂N₃)；2.51(s,4H,OH)。¹³C-NMR(100MHz,CDCl₃)，δ：71.6，70.9，70.6，61.30，50.40，45.20。MALDI-TOF-MS：calculated M_w＝4462.62g/mol，found m/z[M+Na⁺]＝4485.72，[M+H⁺]＝4463.80。C₁₉₇H₃₉₂N₁₂O₉₆(4462.62)：calcd.C 52.99，H 8.85，N 3.76，O 34.40；found C53.57，H 9.11，N 3.46，O 35.80。

实施例5式X化合物的制备

将IX(1.61g，3.35mmol)和4-Arm-PEG₉₆-N₃(VIII)(3g，0.67mmol)溶于无水四氢呋喃(20ml)中，氩气保护下室温搅拌。碘化亚铜(0.084g，0.444mmol)和N，N-二异丙基乙胺(0.42ml)添加到反应混合物中，反应混合物搅拌持续24小时。往反应混合物中加入100ml二氯甲烷，用饱和NH₄Cl(3×50ml)连续三次洗涤有机相。分离合并的有机相用Na₂SO₄干燥后真空减压浓缩。粗产物经柱层析(硅胶，二氯甲烷/甲醇＝12：1，v/v)和透析(截留分子量：2KD)纯化，得到3.85g的4-Arm-PEG₉₆-RB(X)，白色固体，收率90％。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)，δ：7.93(dd,J＝5.6,2.9Hz,4H)；7.50(dd,J＝5.5,3.0Hz,8H)；7.10(dd,J＝5.4,2.8Hz,4H)；6.63(s,8H)；6.53(d,J＝8.8Hz,8H)；6.45(d,J＝7.6Hz,8H)；5.72(dd,J＝7.2,2.1Hz,4H)；4.26-4.05(m,8H)；3.81-3.49(m,392H)；3.41(q,J＝6.9Hz,16H)；2.96(s,8H)；1.20(t,J＝7.1Hz,24H)。¹³C NMR(CDCl₃，100MHz)，δ：12.49，44.20，48.51，53.34，70.41，71.78，76.91，77.23，97.72，104.83，108.15，122.61，124.56，128.31，130.09，130.40，133.84，148.78，153.13，153.60，169.34，170.71。MALDI-TOF-MScalcd for C₃₂₁H₅₂₄N₂₄O₁₀₄：6379.65，found m/z[M+H]⁺＝6380.82，[M+Na]⁺＝6403.12。

实施例6样品准备

用去离子水配制X探针的原液(1.0×10^-4M)。在去离子水中制备Li⁺、Na⁺、K⁺、Ag⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Cd²⁺、Ba²⁺、Hg²⁺、Pb²⁺、Cr²⁺、Al³⁺、Fe³⁺等硝酸盐的金属离子储备溶液(1.0×10^-3M)。

准备样品进行荧光和紫外可见光谱分析程序如下：将5ml的X探针原液(1.0×10^- ⁴M)添加到容量瓶(10ml)中，然后将待分析的金属离子溶液适量加入容量瓶混合，将混合物用相应的去离子水稀释至10ml。光谱数据在加入相应金属离子溶液10min后记录。

实施例7探针X对不同金属阳离子的紫外吸收情况

分别精确配制50μM的探针X水溶液，并往各溶液中加入不同的金属阳离子溶液，使各金属阳离子的浓度保持在200μM，经过测试发现仅有Hg²⁺离子能够引起探针分子X在相应波长处的显著吸收。同时，测试溶液的表观颜色也从无色变成了粉红色，这表明只有汞离子能够与探针分子之间发生较强的相互作用。

如图1所示，在探针X水溶液中加入Hg²⁺离子后，体系在548nm处的吸光度和探针X分子自身吸光度相比，增加了120倍，摩尔吸光系数达到ε＝4.2×10⁴L/mol^-1cm^-1。尽管Al³⁺和Cu²⁺也能够引起X产生一定吸收，但与Hg²⁺离子所引起的变化相比，其吸光度非常微弱。同样，Na⁺、K⁺、Ag+、Ca²⁺、Mg²⁺、Ba²⁺、Zn²⁺、Ni²⁺、Cd²⁺、Co²⁺、Pb²⁺、Mn²⁺、Cr²⁺、Fe³⁺所引起的X的吸收也极其微弱。因此，探针X是一种直观的化学传感器，对中性水溶液中的Hg²⁺离子表现出选择性。

实施例8探针X对不同金属阳离子的识别作用

为了进一步证实探针X对Hg²⁺的选择性识别作用，我们记录了探针X在水溶液中与各种金属离子共存时的荧光发射光谱。探针X水溶液在572nm处表现出极其微弱的荧光发射且在472nm激发态荧光量子产率较低(φ＝1.62％)。如图2所示，当添加1摩尔当量不同的金属离子(Na⁺、K⁺、Ag+、Ca²⁺、Mg²⁺、Ba²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺、Ni²⁺、Cd²⁺、Co²⁺、Pb²⁺、Mn²⁺、Cr²⁺、Al³⁺、Fe³⁺、Hg² ⁺)分别至探针X的水溶液中，只有Hg²⁺能导致在572nm处荧光强度明显的改善且具有较高荧光量子产率(φ＝28.6％)；而探针X中单独加入其它金属离子后，都没有引起探针X在572nm处荧光的显著变化。这一结果充分表明了X对Hg²⁺具有很好的选择性。

实施例9Hg²⁺浓度变化对探针X水溶液的荧光性质的影响

利用荧光发射光谱研究了Hg²⁺浓度变化对探针X水溶液的荧光性质的影响。如图3所示，可以发现，随着Hg²⁺浓度的逐步加入，572nm处探针X的发射峰强度逐渐增强。进一步将Hg²⁺浓度增加到4当量以上，探针X的荧光强度保持稳定，这也表明探针X与Hg²⁺的化学计量结合比为1:4。

实施例10探针X水溶液中Hg²⁺与其它金属阳离子分别共存时的荧光强度

上述关于探针X对金属离子的选择性实验是在理想的状况下测定的，即仅考虑单一金属子存在的情况，而在实际应用实践中，大多是多种金属离子共同存在的，因此，探索其它金属离子对探针X特异性识别Hg²⁺的影响是非常有必要的。为了评估探针X抵抗其它金属离子干扰Hg²⁺选择性识别的能力，我们记录了探针X水溶液中Hg²⁺与其它金属阳离子(Na⁺、K⁺、Ag⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Ba²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺、Ni²⁺、Cd²⁺、Co²⁺、Pb²⁺、Mn²⁺、Cr²⁺、Fe³⁺和Al³⁺)分别共存时的荧光强度。从图4中可以看出，在同一条件下其它离子的存在并没有对探针X+Hg²⁺体系的荧光产生显著的影响，即使在其它金属离子存在时，探针X对Hg²⁺的选择性仍然高于其它竞争金属离子，即探针X仍能很好地识别出Hg²⁺，可能是由于与其它竞争性金属阳离子相比，探针X与Hg²⁺形成了稳定的络合物。

实施例11探针X的检测限研究

准确量取500μl的探针X原液，再加入pH＝7.5的PBS缓冲溶液(保持待测试体系溶液总体体积为5mL)，最后加入逐渐增大浓度的Hg²⁺离子(0-60μM)，当Hg²⁺离子加入约10min之后，以512nm作为激发波长，分别测试其荧光光谱并记录572nm处的最强发射峰。如图5所示，随着Hg²⁺浓度由0μM到60μM的逐渐增加，探针X在572nm处荧光强度逐渐增强，如图6所示，在0到10μM汞离子浓度区间呈现出良好的线性关系。

我们用以下方法计算探针的检测限：首先，如图5所示，选择0-10μM的Hg²⁺浓度荧光滴定范围进行了荧光强度和浓度梯度的线性拟合，并在该浓度范围产生了非常好的线性相关(R²＝0.994)，线性方程为y＝5.0647x+18.4425，该曲线方程的斜率记为m,m＝5.0647。通过3倍标准偏差方法计算：σ＝0.65，检测限C＝3σ/m，探针X对Hg²⁺的检测限为0.385μM。通过与一些已经报道的罗丹明衍生的Hg²⁺探针对比发现，探针X对于Hg²⁺的检测限具有一定优势，而且大多数罗丹明衍生的Hg²⁺探针往往需要添加有机溶剂来实现探测的目的。而本发明所提供的探针X的PEG化结构决定其水溶性很好，能直接用于纯水体系，这对于破除罗丹明系列荧光探针可能由于溶解性而产生应用局限性具有重要意义。

以上所述实施例仅表达了本申请的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本申请专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种基于单分散四臂聚乙二醇的罗丹明B衍生物荧光探针分子，其特征在于，具有以下结构，

2.一种基于单分散四臂聚乙二醇的罗丹明B衍生物荧光探针分子中间体式VIII化合物，其特征在于，具有以下结构，

3.一种基于单分散四臂聚乙二醇的罗丹明B衍生物荧光探针分子中间体式VIII化合物的制备方法，其特征在于，具有以下步骤：

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，具有以下步骤：

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，具有以下步骤：

6.根据权利要求3-5任一所述的制备方法，其特征在于，步骤三中获得的式(VI)化合物需要通过甲基叔丁基醚多次低温重结晶来进一步纯化。

7.根据权利要求3-5任一所述制备方法，其特征在于，步骤四中获得的式(VIII)化合物需通过去离子水透析净化24小时来进一步纯化。

8.一种基于单分散四臂聚乙二醇的罗丹明B衍生物荧光探针分子的制备方法，其特征在于，具有以下步骤：

步骤一：通过罗丹明B与炔丙胺反应得到式(IX)化合物；

9.据权利要求8所述制备方法，其特征在于，步骤二中是先将式(IX)化合物与式(VIII)化合物溶于无水四氢呋喃中，并在氩气保护下室温搅拌；再将铜试剂和N，N-二异丙基乙胺添加到反应混合物中，持续搅拌，反应得到式(X)化合物。

10.根据权利要求8-9任一所述制备方法，其特征在于，步骤二获得的式(X)化合物需通过去离子水透析净化24小时来进一步纯化。