CN106867514A

CN106867514A - 一种用于比率识别人碳酸酐酶的小分子荧光探针及其合成方法和应用

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Publication number: CN106867514A
Application number: CN201510922761.7A
Authority: CN
Inventors: 徐兆超; 乔庆龙
Original assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Current assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority date: 2015-12-11
Filing date: 2015-12-11
Publication date: 2017-06-20
Anticipated expiration: 2035-12-11
Also published as: CN106867514B

Abstract

本发明涉及一种用于比率识别人碳酸酐酶的小分子荧光探针的及其合成和应用。该探针通过4-氨基-1,8-萘酐与氯乙酰氯、二乙胺、4-氨甲基苯磺酰胺等反应得到，其合成方法操作简单、原料低廉。该探针在水溶液中呈现出～470nm的蓝色荧光，而在甲醇，二甲基亚砜，N,N-二甲基甲酰胺、乙醇等极性溶剂中呈现出525-560nm的绿色到黄色荧光。在20mM的磷酸缓冲液中，当逐渐加入0-0.7当量人碳酸酐酶1后，～470nm的荧光峰逐渐降低而～530nm处荧光峰逐渐增强。因而，该探针能够比率识别人碳酸酐酶，从而排除设备、样品等外界因素影响。

Description

一种用于比率识别人碳酸酐酶的小分子荧光探针及其合成方法和应用

技术领域

本发明涉及一种用于比率识别人碳酸酐酶的小分子荧光探针的合成及应用。

背景技术

随着生命科学研究的迅速发展，荧光分析技术在分子生物学、细胞免疫学、肿瘤学、医学等方面的应用越发广泛。而有机小分子荧光探针以其体积小、易于合成、多样性等优势逐渐成为荧光分析技术的一种重要手段。在荧光方法测定中，荧光探针在与反应物结合后，出现激发光或发射光谱波长移动的探针，可使用在两个不同波长测定的荧光强度比率进行测定，这类荧光探针被称为比率型探针。其相对单纯荧光增强型探针相比，能够消除外界环境影响得到更准确数据。然而应用于蛋白的识别的比率型探针极少有报道，且需求更为迫切。

碳酸酐酶普遍存在于哺乳动物中的几乎所有的组织中，它是一类含锌金属酶,能可逆性地催化CO₂的水合反应,产生参与人体多种生理功能的HCO₃ ^-及H⁺。现在发现至少有16种碳酸酐酶亚型。根据碳酸酐酶氨基酸序列的不同,碳酸酐酶可分为α、β、γ、δ、ε五种不同类型的酶。其中α-CAs存在于脊椎动物、细菌、藻类及绿色植物的胞浆中；β-CAs存在于高等植物及藻类叶绿体中,对植物光合作用过程中CO₂的获取及CO₂浓度的维持有着必不可少的作用；γ-CAs则主要存在于太古细菌及一些细菌中；δ-CAs主要存在于海洋硅藻中。而人碳酸酸酐酶I是其中一员，其在人生命过程中(如：骨的形成等)起着重要作用。

磺酰胺类衍生物在70多年前已经被发现对碳酸酐酶有较强的抑制效果。磺酰胺(-SO₂NH₂)基团中的N与酶活性中心的Zn²⁺相连接,取代与Zn²⁺相连的水分子与Thr-199的OH^-形成氢键。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种用于比率识别人碳酸酐酶的小分子荧光探针，该探针能够与人碳酸酐酶1特异性结合并进行比率的识别。

本发明的另一目的是提供一类用于比率识别人碳酸酐酶的小分子荧光探针的合成方法，该方法具有原料低廉、操作简便等优点。

本发明提供一种用于比率识别人碳酸酐酶的小分子荧光探针，以1,8-萘酰亚胺为荧光报告基团，2-(N,N-二乙基氨基)乙酰基)氨基为荧光响应位点，苯磺酰胺为靶向位点，该荧光探针具有如下结构：

该荧光探针能够特异性与人碳酸酐酶1结合使其波长在～470nm的荧光峰逐渐降低而波长在～530nm处荧光峰逐渐增强，从而达到比率识别碳酸酐酶的目的。

一类用于比率识别人碳酸酐酶的小分子荧光探针的合成路线，如下：

具体合成步骤如下：

(1)中间体4-(2-氯乙酰基)氨基-1,8-萘酐的合成：将4-氨基-1,8-萘酐置于四氢呋喃中，并在冰浴下缓慢加入氯乙酰氯。室温下搅拌过夜(10-16h)，减压除去溶剂，硅胶柱分离得米白色固体4-(2-氯乙酰基)氨基-1,8-萘酐。

(2)中间体4-(2-(N,N-二乙基氨基)乙酰基)氨基-1,8-萘酐的合成：将4-(2-氯乙酰基)氨基-1,8-萘酐置于乙腈中，搅拌下加入二乙胺。加热至50-70℃，1-2h，减压除去溶剂，硅胶柱分离得淡黄色固体4-(2-(N,N-二乙基氨基)乙酰基)氨基-1,8-萘酐。

(3)探针的合成：将4-(2-(N,N-二乙基氨基)乙酰基)氨基-1,8-萘酐溶于乙醇中，搅拌下加入4-氨甲基苯磺酰胺盐酸盐，并缓慢滴加三乙胺。加热至80-90℃，2-3h后硅胶柱分离得淡黄色固体。

上述步骤(1)中所述4-氨基-1,8-萘酐、四氢呋喃、氯乙酰氯，其质量比为5:80:1-5:160:2。硅胶柱分离，以二氯甲烷为洗脱剂，分离后需经减压除去溶剂得白色固体。

上述步骤(2)中所述4-(2-氯乙酰基)氨基-1,8-萘酐、乙腈、二乙胺，其质量比为2:80:1-2:160:1.5。硅胶柱分离，以二氯甲烷：甲醇＝50:1至10:1为洗脱剂，分离后需经减压除去溶剂得淡黄色固体。。

上述步骤(3)中所述4-(2-(N,N-二乙基氨基)乙酰基)氨基-1,8-萘酐、乙醇、4-氨甲基苯磺酰胺盐酸盐、三乙胺，其质量比为1:320:1.2:1-1:640:2:2。硅胶柱分离，以二氯甲烷：甲醇＝50:1至20:1为洗脱剂，分离后需经减压除去溶淡黄色固体。

本发明提供的用于比率识别人碳酸酐酶的小分子荧光探针可以在比率识别人碳酸酐酶及在蛋白检测和生物荧光成像中应用。

本发明具有以下特征：

该类探针拥有合成原料低价、方法简单易操作、易纯化等优点。

该类探针在该探针在水溶液中呈现出～470nm的蓝色荧光，而在甲醇，二甲基亚砜，N,N-二甲基甲酰胺、乙醇等极性溶剂中呈现出525-560nm的绿色到黄色荧光。

该荧光探针能够特异性与人碳酸酐酶I结合使其～470nm的荧光峰逐渐降低而～530nm处荧光峰逐渐增强，从而达到比率识别碳酸酐酶。其可用于蛋白检测、生物荧光成像领域等。

附图说明

图1本发明荧光探针的结构式；

图2本发明荧光探针合成路线图；

图3实施例1制备的荧光探针核磁谱图氢谱。

图4实施例1制备的荧光探针核磁谱图碳谱。

图5中实施例2的荧光光谱图。

图6中实施例3的荧光谱图。

图7中实施例4的荧光谱图。

图8中实施例5的荧光谱图。

具体实施方式

实施例1：用于比率识别人碳酸酐酶的小分子荧光探针的合成方法。

(1)中间体4-(2-氯乙酰基)氨基-1,8-萘酐的合成：

将4-氨基-1,8-萘酐(1.0g，4.7mmol)置于60mL四氢呋喃中，并在冰浴下加入0.5mL氯乙酰氯。室温搅拌过夜(14h)，减压除去溶剂，硅胶柱分离，以二氯甲烷为洗脱剂，减压除去溶剂得米白色固体1.0g，产率76％。¹HNMR(400MHz,DMSO)δ10.86(s,1H),8.80(d,J＝8.8Hz,1H),8.59-8.63(m,2H),8.37(d,J＝8.0Hz,1H),8.02(t,J＝7.8Hz,1H),4.62(s,2H)。

(2)中间体4-(2-(N,N-二乙基氨基)乙酰基)氨基-1,8-萘酐的合成：

将4-(2-氯乙酰基)氨基-1,8-萘酐(500mg,1.7mmol)置于50mL乙腈中，搅拌下加入356μL二乙胺。将反应液加热至50℃，持续2h，减压除去溶剂，硅胶柱分离，以二氯甲烷：甲醇＝20:1为洗脱剂，减压除去溶剂淡黄色固体293mg，产率52％。¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ10.91(s,1H),8.84(d,J＝8.3Hz,1H),8.67(dd,J＝7.3,0.9Hz,1H),8.64(d,J＝8.3Hz,1H),8.26(d,J＝8.4Hz,1H),7.87(dd,J＝8.5,7.4Hz,1H),3.36(s,2H),2.81(q,J＝7.1Hz,4H),1.20(t,J＝7.1Hz,6H)。

(3)探针的合成：

将4-(2-(N,N-二乙基氨基)乙酰基)氨基-1,8-萘酐(50mg，0.15mmol)溶于20mL乙醇中，搅拌下加入4-氨甲基苯磺酰胺盐酸盐(67mg,0.30mmol)，100μL三乙胺。将反应液加热至回流，85℃，持续3h，减压除去溶剂，硅胶柱分离，以二氯甲烷：甲醇＝30:1为洗脱剂，减压除去溶剂得黄色固体67mg，产率90％。¹HNMR(400MHz,DMSO)δ10.69(s,1H),8.56(d,J＝7.3Hz,1H),8.52(d,J＝8.2Hz,1H),8.46(d,J＝8.2Hz,1H),8.40(d,J＝8.5Hz,1H),7.97(t,J＝7.9Hz,1H),7.76(d,J＝8.2Hz,2H),7.54(d,J＝8.2Hz,2H),7.32(s,2H),5.31(s,2H),3.39(s,2H),2.74(q,J＝7.1Hz,4H),1.11(t,J＝7.1Hz,6H)。¹³CNMR(101MHz,DMSO)δ171.32,164.00,163.44,143.27,141.85,140.07,132.69,131.68,128.94,128.33,128.22,127.54,126.28,123.92,122.84,118.32,117.73,58.11,48.46,43.14,12.65。

将该探针溶于DMSO溶液中，配制成2mM母液；人碳酸酐酶I溶于20mM pH＝7.4PBS缓冲液中配置成1/30mM的母液。根据不同比例配制成所需浓度，测试其荧光光谱变化。

实施例2：实施例1制备的荧光探针对不同溶剂响应情况。

图5中实施例1制备的荧光探针浓度为10μM激发光为370nm，在20mM pH＝7.4PBS缓冲液中探针呈现出波长为～470nm的蓝色荧光，在甲醇，二甲基亚砜，N,N-二甲基甲酰胺、乙腈、乙醇中荧光主峰红移至525-560nm；说明该荧光探针在疏水环境中能够表现出长波的性质。

实施例3：实施例1制备的荧光探针对1当量碳酸酐酶在持续时间内响应。

图6中20mM pH＝7.4PBS缓冲液中实施例1制备的荧光探针浓度为1μm，激发光为405nm，加入荧光探针1当量的碳酸酐1后，波长为～470nm的荧光强度明显降低，而波长为～530nm的荧光强度急剧增加，且在48h内无明显变化；说明该荧光探针进入到碳酸酐酶1的疏水空腔中，荧光表现出长波的性质。。

实施例4：实施例1制备的荧光探针对不同浓度碳酸酐酶的响应。

图7中水中实施例1制备的荧光探针浓度为1μm，激发光为370nm，当分别加入对荧光探针0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7当量碳酸酐酶1后波长为～470nm的荧光强度逐渐降低，且在0.5当量时不再降低；说明荧光探针已完全进入碳酸酐酶1的疏水空腔中。

实施例5：实施例1制备的荧光探针对不同浓度碳酸酐酶的响应。

图8中水中荧实施例1制备的光探针浓度为1μm，激发光为405nm，当逐渐加入碳酸酐酶1后波长为～470nm的荧光强度逐渐降低，而波长为～530nm处的荧光逐渐增加；说明该荧光探针能够进入到碳酸酐酶1的疏水空腔中，并荧光表现出长波的性质。

Claims

1.一种用于比率识别人碳酸酐酶的小分子荧光探针，其特征在于：以1,8-萘酰亚胺为荧光基团，2-(N,N-二乙基氨基)乙酰基)氨基为荧光响应位点，苯磺酰胺为靶向位点；其结构如下：

2.一种权利要求1所述的用于比率识别人碳酸酐酶的小分子荧光探针的合成方法，其特征在于：合成步骤如下：

(1)中间体4-(2-氯乙酰基)氨基-1,8-萘酐的合成：

将4-氨基-1,8-萘酐置于四氢呋喃中，并在冰浴下缓慢加入氯乙酰氯，室温下搅拌过夜(10-16h)，减压除去溶剂，硅胶柱分离得4-(2-氯乙酰基)氨基-1,8-萘酐；

(2)中间体4-(2-(N,N-二乙基氨基)乙酰基)氨基-1,8-萘酐的合成：

将4-(2-氯乙酰基)氨基-1,8-萘酐置于乙腈中，搅拌下加入二乙胺，加热至50-70℃，1-2h，减压除去溶剂，硅胶柱分离得4-(2-(N,N-二乙基氨基)乙酰基)氨基-1,8-萘酐；

(3)探针的合成：

将4-(2-(N,N-二乙基氨基)乙酰基)氨基-1,8-萘酐溶于L乙醇中，搅拌下加入4-氨甲基苯磺酰胺盐酸盐，并缓慢滴加三乙胺，加热至80-90℃，2-3h后减压除去溶剂,硅胶柱分离。

3.如权利要求2所述的合成方法，其特征在于：步骤(1)中所述4-氨基-1,8-萘酐、四氢呋喃、氯乙酰氯，其质量比为5:80:1-5:160:2，硅胶柱分离，以二氯甲烷为洗脱剂，分离后需经减压除去溶剂。

4.如权利要求2所述的合成方法，其特征在于：步骤(2)中所述4-(2-氯乙酰基)氨基-1,8-萘酐、乙腈、二乙胺，其质量比为2:80:1-2:160:1.5，硅胶柱分离，以二氯甲烷：甲醇＝50:1至10:1为洗脱剂，分离后需经减压除去溶剂。

5.如权利要求2所述的合成方法，其特征在于：步骤(3)中所述4-(2-(N,N-二乙基氨基)乙酰基)氨基-1,8-萘酐、乙醇、4-氨甲基苯磺酰胺盐酸盐、三乙胺，其质量比为1:320:1.2:1-1:640:2:2，硅胶柱分离，以二氯甲烷：甲醇＝50:1至20:1为洗脱剂，分离后需经减压除去溶剂。

6.一种权利1所述的用于比率识别人碳酸酐酶的小分子荧光探针在比率识别人碳酸酐酶、在蛋白检测或在生物荧光成像中的应用。