CN103687854A - 碳酸酐酶靶向剂及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种靶向碳酸酐酶的药剂，该靶向碳酸酐酶的药剂可用作成像剂或治疗剂。所述药剂可用于在对象体内对肿瘤缺氧以及其他生理过程进行成像。

Description

碳酸酐酶靶向剂及其使用方法
与相关申请的交叉引用
本申请要求2011年5月9日提交的美国临时专利申请编号61/483,979的利益和优先权，所述临时申请的内容通过引用并入本文。技术领域
本发明提供了靶向碳酸酐酶的药剂，其可以用作成像剂或治疗剂。所述药剂可用于在对象体内的肿瘤缺氧以及其他生理过程进行成像。
技术背景
用于在某些疾病中评估分子终点的当前方法通常需要组织和血液取样、外科手术，并且在实验动物的情况下，需要在不同时间点处死。尽管在非侵入性成像领域中取得进展，但仍迫切需要更灵敏和特异的成像剂和方法。能够可视化特定分子靶和/或整个通路的成像技术，将显著提高我们诊断和评估治疗性干预对许多不同疾病状态的疗效的能力。大多数当前的成像技术主要报告解剖学或生理学信息（例如磁共振成像（MRI）、计算机断层扫描（CT）和超声）。更新的模式例如光学成像和新的分子成像探针，具有彻底改变检测、治疗和监测疾病的方式的潜力。
特别是，光学成像提供了几种优点，使其在研究和临床两种应用上成为强有力的分子成像方法。具体来说，光学成像可以是快速、安全、经济有效和高度灵敏的。扫描时间在数秒至数分钟的量级上，不需要电离辐射，并且成像系统可以使用相对简单。此外，光学探针可以设计成动态分子成像剂，其可以在体内改变它们的报告剖析，以实时提供分子和功能信息。为了在体内获得最大穿透和灵敏度，对于生物系统中的大多数光学成像来说，选择红和近红外（NIR）光谱区（600-900nm）之内，尽管也可以使用可见光区域中的其他波长。在NIR波长范围中，生理上丰富的吸收剂例如血红蛋白或水的吸收以及组织的自发荧光被降至最低。
组织缺氧或组织缺氧现象是身体整体（普遍化组织缺氧）或身体区域（组织缺氧）被剥夺充足氧气供应的病理状况。动脉氧浓度的变化可以是正常生理的一部分，例如在剧烈体育锻炼期间。氧气供应与细胞水平上对氧气的需求之间的失谐，可能引起组织缺氧状况。
肿瘤缺氧是肿瘤细胞被剥夺氧气的情况。当肿瘤生长时，肿瘤生长速度快速地超过其血液供应，给肿瘤部分留下氧浓度比健康组织中明显更低的区域。肿瘤缺氧也可以是肿瘤组织中经历的高度细胞增殖的结果，引起更高的细胞密度并由此加重局部氧气供应的负担。
碳酸酐酶（或碳酸脱水酶）形成催化二氧化碳和水向碳酸氢盐和质子（或与之相反）的快速相互转化的一个酶家族，所述可逆反应在不存在催化剂的情况下进行得相当慢。所述酶在动物中的功能之一是将二氧化碳和碳酸氢盐相互转变，以维持血液和其他组织中的酸碱平衡，并帮助将二氧化碳运输出组织。
碳酸酐酶（CA）是一个锌金属酶大家族，其参与各种不同生物过程，包括呼吸、钙化、酸碱平衡、骨吸收以及水状液、脑脊液、唾液和胃酸的形成。它们在组织分布及其亚细胞定位方面显示出广泛多样性。CA IX是一种跨膜蛋白，其已被显示在缺氧条件下显著上调，并在与细胞外酸化相关的组织缺氧中连同细胞内碳酸酐酶II一起起到关键作用。它在所有肾透明细胞癌中表达，但是在正常肾脏或大多数其他正常组织中未检测到。它可能参与细胞增殖和转化。重要的是，肿瘤缺氧和随后CA IX的表达与大量癌症类型中的不良预后和治疗结果联系在一起。更准确并有效地检测和定量碳酸酐酶相关的组织缺氧的能力，将帮助理解生物现象例如细胞增殖和癌症，以及确定最适合的治疗方案。
发明内容
本发明提供了结合于碳酸酐酶、特别是碳酸酐酶IX（CA IX）的荧光成像剂，并且其可用于各种体外和体内应用中，包括但不限于缺氧细胞例如在缺氧肿瘤中发现的缺氧细胞的识别。本发明还提供在远红或近红外区域中发荧光的CA IX药剂/配体，其对于在动物活体中碳酸酐酶的体内成像特别实用。此外，本发明进一步提供了独立地含有远红或近红外荧光团的药剂，所述荧光团已被可用于优化所述药剂的体外和体内性质的多种化学修饰基团修饰。
一方面，所述碳酸酐酶靶向剂包含：碳酸酐酶结合部分，该碳酸酐酶结合部分包含可任选地被脂族、芳香族或杂芳族组成部分取代的磺酰胺组成部分；以及荧光报告物，其可任选地通过连接物（L）组成部分化学连接到所述碳酸酐酶组成部分，其中所述荧光组成部分可任选地还包含多个化学修饰基团。
另一方面，本发明包含：（a）碳酸酐酶结合（CAB）部分，其包含磺酰胺基团组成部分和芳香族或杂芳族组成部分；（b）远红或近红外荧光团（F），其可任选地通过连接物（L）化学连接到所述CAB组成部分；以及（c）多个化学修饰剂（M），每个化学修饰剂（M）独立地并可任选地通过连接物（L）连接到所述荧光团。
所述化学修饰组成部分（M）可以包括例如2至8个个体修饰基团，每个个体修饰基团化学连接到所述荧光团。药剂可以包含CAB、荧光团和多个修饰基团。
在某些实施例中，所述碳酸酐酶靶向剂由式（I）或其盐表示：
其中：
CAB是碳酸酐酶结合部分，该CAB包含磺酰胺组成部分和脂族、芳香族或杂芳族组成部分；
Q是取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、C1-C18烷基、烯基、炔基、烷氧基或硫烷基；或者Q不存在；
L1、L2和L3在每次出现时各自独立地表示连接键或连接物组成部分；
W表示苯并稠合、萘并稠合或吡啶并稠合的环；
X在每次出现时独立地是C(CH2Y1)(CH2Y2)、O、S或Se；
Y1和Y2独立地是氢或C1-C20脂族基团，每个Y1和Y2可任选地被L3—M取代；
M在每次出现时独立地是氢或化学修饰组成部分。
在某些实施例中，所述碳酸酐酶靶向剂由式（I）或其盐表示：
Figure BDA0000412045750000042
其中：
CAB是碳酸酐酶结合部分，该CAB包含磺酰胺组成部分和脂族、芳香族或杂芳族组成部分；
Q是取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、C1-C18烷基、烯基、炔基、烷氧基或硫烷基；或者Q不存在；
L1、L2和L3在每次出现时各自独立地表示连接键或连接物组成部分；
R在每次出现时独立地是氢、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、C1-C18烷基、烯基、炔基、烷氧基或硫烷基，每个R可任选地被L3—M取代；
n是1、2或3；
W表示苯并稠合、萘并稠合或吡啶并稠合的环；
X在每次出现时独立地是C(CH2Y1)(CH2Y2)、O、S或Se；
Y1和Y2独立地是氢或C1-C20脂族基团，每个Y1和Y2可任选地被L3—M取代；并且
M在每次出现时独立地是氢或化学修饰组成部分。
在某些实施例中，所述碳酸酐酶靶向剂包含式（III）或其盐的化合物：
F-1-CAB，（III）
其中
F是近红外荧光染料；
L是任选的连接物；并且
CAB是碳酸酐酶结合部分，该CAB包含磺酰胺组成部分和脂族、芳香族或杂芳族组成部分。
在某些实施例中，所述化学修饰组成部分M选自由氢、醇、磺酸、磺酸盐、磺酰胺、亚砜、砜、羧酸盐、酮、膦酸盐、磷酸盐；亚氨基二乙酸盐、乙二胺四乙酸、二亚乙基三胺五乙酸、四氮杂环十二烷四乙酸、氨基酸、聚氨基酸、低聚或聚乙二醇、胺、季铵离子、葡萄糖胺、半乳糖胺、甘露糖胺所组成的组。在其他实施例中，所述化学修饰组成部分M是羧酸盐、膦酸盐、磷酸盐或亚氨基二乙酸盐。在其他实施例中，所述化学修饰组成部分M是磺酸盐。
在某些实施例中，本发明的所述化合物的某些M修饰产生的荧光CA成像剂与所述CAB结合基团未结合于所述化学修饰的荧光团的情况相比，对CA IX（相对于CA IX之外的CA（例如CA II））具有更高的选择性。
在某些实施例中，本发明的所述化合物的某些M修饰产生的荧光CA成像剂不会非特异性地穿过细胞膜，从而与细胞质CA例如CA II相比能够对细胞表面CA具有甚至更高的选择性。
在某些实施例中，本发明的所述化合物的某些M修饰产生的荧光CA成像剂在CA IX阴性的动物组织中具有低的非特异性积累，从而相对于CA IX阳性的相邻组织能够具有高对比度。
在某些实施例中，化学修饰组成部分M修饰所述碳酸酐酶靶向剂，使其在中性pH下具有-3至-12范围内的净负电荷。
在某些实施例中，化学修饰组成部分M降低所述碳酸酐酶靶向剂的非特异性细胞膜通透性。此外，在其他实施例中，所述化学修饰组成部分M降低所述碳酸酐酶靶向剂在给药于动物活体时的非特异性组织积累。
在某些实施例中，所述连接键或连接物组成部分L包含选自由下列的组成部分所组成的组：甘氨酸，丙氨酸，β-丙氨酸，-NH-(CH2)n-C(=O)-其中n=1-8，4-氨基甲基苯甲酸，磺基丙氨酸，谷氨酸，氨基-聚乙二醇-羧酸，氨基-聚乙二醇胺，乙二胺，丙二胺，亚精胺，精胺，己二胺，以及二胺-氨基酸例如高赖氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、二氨基丁酸和二氨基丙酸，琥珀酸，戊二酸，辛二酸或己二酸。
在某些实施例中，式I、II或III中的所述碳酸酐酶靶向组成部分（CAB）是下列之一：
Figure BDA0000412045750000071
Figure BDA0000412045750000072
或
Figure BDA0000412045750000073
在某些实施例中，所述碳酸酐酶成像剂选自由
3-乙基-2-((1E,3Z,5E)-5-(3-乙基-1,1-二甲基-6,8-二磺基-1H-苯并[e]吲哚-2(3H)-亚基)-3-(5-((4-氨磺酰基苯甲基)氨甲酰基)吡啶-2-基)戊-1,3-二烯-1-基)-1,1-二甲基-6,8-二磺基-1H-苯并[e]吲哚-3-鎓；
3-(2-((1E,3Z,5E)-5-(1,1-二甲基-6,8-二磺基-3-(3-磺基丙基)-1H-苯并[e]吲哚-2(3H)-亚基)-3-(5-((4-氨磺酰基苯甲基)氨甲酰基)吡啶-2-基)戊-1,3-二烯-1-基)-1,1-二甲基-6,8-二磺基-1H-苯并[e]吲哚-3-鎓-3-基)丙烷-1-磺酸盐；
3-(2-((1E,3E,5E)-5-(1,1-二甲基-6,8-二磺基-3-(3-磺基丙基)-1H-苯并[e]吲哚-2(3H)-亚基)戊-1,3-二烯-1-基)-1,1-二甲基-6-(N-甲基-N-(4-氧基-4-((4-氨磺酰基苯甲基)氨基)丁基)氨磺酰基)-1H-苯并[e]吲哚-3-鎓-3-基)丙烷-1-磺酸盐；
3-(2-((1E,3Z,5E)-5-(1,1-二甲基-6,8-二磺基-3-(3-磺基丙基)-1H-苯并[e]吲哚-2(3H)-亚基)-3-(5-((6-氧基-6-((4-氨磺酰基苯甲基)氨基)己基)氨甲酰基)吡啶-2-基)戊-1-二烯-1-基)-1,1-二甲基-6,8-二磺基-1H-苯并[e]吲哚-3-鎓-3-基)丙烷-1-磺酸盐；
3-(2-((1E,3Z,5E)-5-(1,1-二甲基-6,8-二磺基-3-(3-磺基丙基)-1H-苯并[e]吲哚-2(3H)-亚基)-3-(5-((3-氧基-1-(4-氨磺酰基苯基)-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75-二十四氧杂-2-氮杂七十七烷-77-基)氨甲酰基)吡啶-2-基)戊-1,3-二烯-1-基)-1,1-二甲基-6,8-二磺基-1H-苯并[e]吲哚-3-鎓-3-基)丙烷-1-磺酸盐；
3-(2-((1E,3E,5E)-5-(1,1-二甲基-6,8-二磺基-3-(3-磺基丙基)-1H-苯并[e]吲哚-2(3H)-亚基)戊-1,3-二烯-1-基)-1,1-二甲基-6-(N-甲基-N-(4-氧基-4-((4-((5-氨磺酰基-1,3,4-噻二唑-2-基)氨甲酰基)苯甲基)氨基)丁基)氨磺酰基)-1H-苯并[e]吲哚-3-鎓-3-基)丙烷-1-磺酸盐；
3-(2-((1E,3Z,5E)-5-(1,1-二甲基-6,8-二磺基-3-(3-磺基丙基)-1H-苯并[e]吲哚-2(3H)-亚基)-3-(5-((6-氧基-6-((4-((5-氨磺酰基-1,3,4-噻二唑-2-基)氨甲酰基)苯甲基)氨基)己基)氨甲酰基)吡啶-2-基)戊-1,3-二烯-1-基)-1,1-二甲基-6,8-二磺基-1H-苯并[e]吲哚-3-鎓-3-基)丙烷-1-磺酸盐；
3-乙基-2-((1E,3Z,5E)-5-(3-乙基-1,1-二甲基-6,8-二磺基-1H-苯并[e]吲哚-2(3H)-亚基)-3-(5-((4-((5-氨磺酰基-1,3,4-噻二唑-2-基)氨甲酰基)苯甲基)氨甲酰基)吡啶-2-基)戊-1,3-二烯-1-基)-1,1-二甲基-8-磺基-1H-苯并[e]吲哚-3-鎓-6-磺酸盐；
3-(2-((1E,3Z,5E)-5-(1,1-二甲基-6,8-二磺基-3-(3-磺基丙基)-1H-苯并[e]吲哚-2(3H)-亚基)-3-(5-((4-((5-氨磺酰基-1,3,4-噻二唑-2-基)氨甲酰基)苯甲基)氨甲酰基)吡啶-2-基)戊-1,3-二烯-1-基)-1,1-二甲基-6,8-二磺基-1H-苯并[e]吲哚-3-鎓-3-基)丙烷-1-磺酸盐；
3-(2-((1E,3Z,5E)-5-(1,1-二甲基-6,8-二磺基-3-(3-磺基丙基)-1H-苯并[e]吲哚-2(3H)-亚基)-3-(5-((3-氧基-1-(4-((5-氨磺酰基-1,3,4-噻二唑-2-基)氨甲酰基)苯基)-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75-二十四氧杂-2-氮杂七十七烷-77-基)氨甲酰基)吡啶-2-基)戊-1,3-二烯-1-基)-1,1-二甲基-6,8-二磺基-1H-苯并[e]吲哚-3-鎓-3-基)丙烷-1-磺酸盐；
3-(2-((1E,3Z,5E)-5-(1,1-二甲基-6,8-二磺基-3-(3-磺基丙基)-1H-苯并[e]吲哚-2(3H)-亚基)-3-(5-((3-氧基-3-((5-氨磺酰基-1,3,4-噻二唑-2-基)氨基)丙基)氨甲酰基)吡啶-2-基)戊-1,3-二烯-1-基)-1,1-二甲基-6,8-二磺基-1H-苯并[e]吲哚-3-鎓-3-基)丙烷-1-磺酸盐；以及
3-(2-((1E,3Z,5E)-5-(3,3-二甲基-5-磺基-1-(3-磺基丙基)二氢吲哚-2-亚基)-3-(5-((3-氧基-3-((5-氨磺酰基-1,3,4-噻二唑-2-基)氨基)丙基)氨甲酰基)吡啶-2-基)戊-1,3-二烯-1-基)-3,3-二甲基-5-磺基-3H-吲哚-1-鎓-1-基)丙烷-1-磺酸盐；及其可药用盐所组成的组。
本发明的另一方面提供了适合于向对象给药的药物组合物，所述药物组合物包含碳酸酐酶靶向剂和可药用赋形剂。
在某些实施例中，本发明提供了一种体内成像方法，所述方法包括：（a）将碳酸酐酶靶向剂给药于对象；（b）使所述药剂在所述对象中分布；以及（c）检测由所述碳酸酐酶成像剂发射的信号。在某些实施例中，步骤（a）-（c）以预定时间间隔重复，从而允许在所述对象体内随时间评估所述碳酸酐酶药剂的发射信号。
在某些实施例中，本发明提供了一种体内光学成像的方法，所述方法包括：（a）将碳酸酐酶靶向剂给药于对象，其中所述药剂包含荧光团或荧光染料；（b）使所述药剂在所述对象中分布；（c）将所述对象暴露于可以由所述荧光染料吸收的波长的光；以及（d）检测由所述药剂发射的信号。此外，在其他实施例中，（a）-（d）以预定时间间隔重复，从而允许在所述对象体内随时间评估所述碳酸酐酶药剂的发射信号。
在某些实施例中，所述对象是动物或人类。
在某些实施例中，由所述试剂发射的所述信号用于构建图像，例如断层扫描图像。
在某些实施例中，在步骤（a）期间，将信号特性可以彼此区分开的两种或更多种成像探针给药于对象，其中至少一种所述成像探针是碳酸酐酶结合剂。在其他实施例中，在步骤（a）中，将所述碳酸酐酶靶向剂标记的细胞给药于所述对象。在其他实施例中，由所述碳酸酐酶靶向剂发射的信号用于监测所述细胞的运输和定位。
在其他实施例中，所述照射和检测步骤使用内窥镜、导管、断层扫描系统、手持光学成像系统或术中显微镜来进行。
在某些实施例中，发射信号的存在、不存在或水平指示了疾病状态。在其他实施例中，所述方法用于检测和/或监测疾病。在其他实施例中，所述疾病选自由骨病、癌症、心血管疾病、动脉粥样硬化、再狭窄、心肌缺血、心肌再灌注损伤、环境疾病、皮肤病、免疫疾病、遗传病、传染病、炎性疾病、代谢病、神经退行性疾病、眼科疾病和呼吸道疾病所组成的组。
在某些实施例中，本发明是一种对在对象体内的组织缺氧进行成像的方法，所述方法包括下列步骤：（a）将碳酸酐酶靶向剂给药于对象；以及（b）检测所述药剂的存在，由此产生表示所述对象组织体内的缺氧的图像。在某些实施例中，肿瘤中的碳酸酐酶药剂信号表示缺氧肿瘤。
在某些实施例中，本发明是一种在对象体内治疗疾病的方法，所述方法包括将碳酸酐酶靶向剂系统或局部地给药于对象，其中所述药剂包含定位于所述疾病区域中并传递有效剂量的辐射的放射性标记物。
在某些实施例中，本发明是一种体外成像方法，所述方法包括：（a）将样品与碳酸酐酶靶向剂相接触；（b）使所述药剂结合于生物靶；（c）可任选地除去未结合的药剂；以及（d）检测从所述药剂发射的信号，由此确定所述药剂是否被所述生物靶激活或结合于生物靶。在其他实施例中，所述样品是生物样品。
在某些实施例中，所述碳酸酐酶靶向剂在所述远红或近红外中具有荧光。
本发明的化合物不但对抑制CA、特别是CA IX有效，而且对CA的体外和体内荧光成像有效，并且因此可用于治疗性和诊断性应用两者。
此外，本发明提供了使用所述荧光CA成像剂进行体外和体内成像的方法。对于光学体内成像来说，所述方法包括：（a）将本发明的CA药剂给药于对象；（b）使所述CA药剂在所述对象中分布；（c）将所述对象暴露于可以由所述CA药剂的荧光团吸收的波长的光；以及（d）检测由所述CA药剂发射的光信号。由所述试剂发射的所述信号用于构建图像。在某些实施例中，某些所述图像是断层扫描图像。此外，应该理解，上述步骤可以以预定时间间隔重复，从而允许随时间对所述对象进行评估。
所述碳酸酐酶靶向剂可以配制在适合于向对象例如动物和/或人类对象给药的药物组合物中。所述药物组合物可以在可药用载体中包括一种或多种所述碳酸酐酶药剂和一种或多种稳定剂。
所述对象可以是脊椎动物，例如哺乳动物，例如人类。所述对象也可以是用于实验室研究的非脊椎动物（例如秀丽隐杆线虫、果蝇或其他研究用模式生物等）。
所述碳酸酐酶靶向剂可以包括例如1至5个碳酸酐酶结合部分（例如2至5个、3至5个或4至5个碳酸酐酶结合部分），每个碳酸酐酶结合部分化学连接到所述成像报告物。所述药剂可以包含多个碳酸酐酶结合部分，每个碳酸酐酶结合部分化学连接到所述成像报告物。
成像报告物可以例如选自荧光团报告物、荧光染料报告物、光学报告物、磁报告物、放射性标记物、X-射线报告物、超声成像报告物或基于纳米粒子的报告物或组合。所述碳酸酐酶药剂还可以包含化学连接到所述碳酸酐酶结合部分或所述成像报告物的生物修饰剂。
此外，本发明提供了使用所述碳酸酐酶靶向剂进行体外和体内成像的方法。对于光学体内成像来说，一种示例性方法包括：（a）一种或多种本发明的上述碳酸酐酶靶向剂给药于对象，其中所述药剂包含一种或多种荧光染料；（b）使所述药剂在所述对象中分布；（c）将所述对象暴露于可以由所述至少一种荧光染料吸收的波长的光；以及（d）检测由所述碳酸酐酶靶向剂发射的光信号。由所述试剂发射的所述信号可用于构建图像，例如断层扫描图像。此外，应该理解，上述步骤可以以预定时间间隔重复，从而允许随时间对所述对象进行评估。
所述碳酸酐酶靶向剂可用于在对象体内测量肿瘤缺氧（缺氧）或其他生理过程例如细胞增殖。一种示例性方法包括：（a）一种或多种上述碳酸酐酶靶向剂给药于对象；（b）检测所述药剂的存在，由此产生表示在所述对象体内具有减少的氧浓度的肿瘤的图像。
在每种上述方法中，所述对象可以是脊椎动物，例如哺乳动物，例如人类。所述对象也可以是用于实验室研究的非脊椎动物（例如秀丽隐杆线虫、果蝇或其他研究用模式生物等）。
此外，可以将所述碳酸酐酶靶向剂并入到试剂盒中，例如具有任选的在体内或体外成像方法中使用所述碳酸酐酶靶向剂的指示的试剂盒。所述试剂盒可任选地可以包括有助于所述碳酸酐酶靶向剂的使用的组分，例如缓冲液和其他配制剂。或者，所述试剂盒可以包括有助于将所述碳酸酐酶靶向剂向对象给药和/或检测的医学器械。
从下面的图、详细描述和权利要求书中，本发明的其他特点和优点将显而易见。
附图简述
图1示出了在给药非结合性对照化合物D3（每个图像集的首行）和示例性化合物C5（每个图像集的末行）后24h，两侧HeLa肿瘤的平面反射（图1A）和断层扫描（图1B）图像。
图2示出了在使用和未使用乙酰唑胺预培养的情况下，与示例性药剂A5和A3培养的缺氧和含氧量正常的HeLa细胞的显微图像。还示出了作为阴性对照的培养基、荧光、作为阳性对照的商品化CA IX抗体和非结合性对照药剂D3。
图3示出了在使用和未使用乙酰唑胺阻断的情况下，在与非结合性对照化合物D3和示例性药剂A5和A3培养后，在含氧量正常和缺氧条件下HeLa细胞荧光信号的定量。
图4示出了在荷瘤小鼠注射后24小时，非结合性对照药剂D3和示例性药剂C5的生物学分布。
图5示出了使用和未使用i.v.乙酰唑胺预处理的情况下，在HeLa荷瘤小鼠中的断层扫描图像（图5A）和通过FMT定量的肿瘤总荧光（图5B）。
图6示出了来自于用示例性药剂C5处理并置于正常空气或8%氧气下的小鼠的被切除的HeLa肿瘤的荧光图像（图6A）。成像肿瘤的定量分析表明，在来自于缺氧条件下的小鼠的肿瘤中，示例性药剂C5的摄入更高（图6B）。
图7示出了通过荧光显微技术获得的荧光碳酸酐酶结合化合物在肿瘤组织中的分布。在分开的肿瘤切片中，示例性药剂C5与CA IX抗体和组织缺氧标志物哌莫硝唑（pimo）两者共定位。
具体实施方式
本发明部分是基于发现能够生产稳定、生物相容的荧光剂，其靶向碳酸酐酶（CA）表现出低的体外非特异性细胞摄入和低的体内非特异性组织摄入，并且可用于各种体外和体内化验分析方法和成像应用以及各种治疗应用中。所述荧光剂能够结合于通常在组织缺氧期间上调的碳酸酐酶。
某些在远红和近红外区域中具有吸收和发射光谱的荧光团例如花青荧光团，可能具有的分子量远远超过结合基团例如碳酸酐酶结合基团的分子量，并且可能对药剂在连接到结合基团时的物理、化学和生物性质具有显性效应，这可能负面地影响体外和体内成像性能。荧光团组成部分的化学修饰，通过使在不直接修饰结合基团的情况下调控药剂的物理、化学和生物性质，能够克服这些局限性。此外，化学修饰组成部分能够影响结合亲和性、在多种酶之间的结合选择性以及药剂在原本对结合靶阴性的细胞或组织中的非特异性摄入。具体来说，以这种方式修饰花青染料在生理pH下给予显著的净负电荷，例如-3至-6的净电荷，能够致使CA IX药剂不能透过CA IX阴性细胞，并且有利于在体内从CA IX阴性组织快速清除。在某些实施例中，被修饰成在中性pH下具有-3至-6的净负电荷的药剂，在体外和体内实验两者中，在结合亲和性和靶本底比值方面显示出预想不到的高性能。
一方面，本发明的药剂包含化学连接到荧光团的至少一个碳酸酐酶结合部分（CAB），其中一个或多个化学修饰组成部分（M）化学连接到荧光团。可任选地，可以使用一个或多个连接物（L）组成部分将CAB化学连接到荧光团或将M化学连接到荧光团。在某些实施例中，CAB是含有磺酰胺和芳香族或杂芳族组成部分的分子，并且荧光团是花青染料。
正如本文中所定义，“碳酸酐酶结合部分”或CAB，是特异性结合碳酸酐酶和/或降低或阻止碳酸酐酶对碳酸酐酶的天然底物的催化活性和/或拮抗碳酸酐酶与其天然配体的结合的分子。CAB与碳酸酐酶之间的结合可以是共价或非共价的（例如静电相互作用、疏水相互作用、范德华相互作用、氢键作用、偶极相互作用等）。CAB与碳酸酐酶之间的结合优选地是非共价的。
在某些实施例中，CAB对碳酸酐酶例如CA II、CA IV、CA IX和CA XII具有亲和性。
当在本文中使用时，术语“亲和性”是指碳酸酐酶药剂优先性地结合于碳酸酐酶和/或被碳酸酐酶保持的能力。具有这种特征的碳酸酐酶药剂是“靶向的”。可以例如通过测量在药剂存在下CA酶对底物（例如CO2）的活性的抑制以确定对CA酶的抑制常数Ki，或者在膜结合的CA例如CA IX的情况下，通过例如流式细胞术测量对活的CA表达细胞的解离常数Kd，来测量CAB或碳酸酐酶药剂的亲和性。在某些实施例中，本文描述的碳酸酐酶靶向药剂的亲和性具有对CA低于100nM的Ki或Kd。在某些优选实施例中，本文描述的药剂对CA IX的Ki或Kd低于50nM。
应该理解，本文公开的碳酸酐酶靶向剂还包括其立体异构体形式，或其立体异构体形式的混合物，或其可药用盐形式。
“荧光团”（F）可以是用于在成像中提供荧光信号或对比，并且可以通过成像技术检测的任何适合的化学品或物质。在某些实施例中，F包含例如花青染料、羰花青染料、靛青染料或聚甲炔荧光染料。
在某些实施例中，F包含对称的花青染料。在其他实施例中，F包含不对称的花青染料。在其他实施例中，F也可以用多种化学修饰组成部分修饰，以使优化药剂的体外和体内性质，并最终优化药剂作为荧光成像剂的性能。
当在本文中使用时，术语“化学连接”理解为是指通过原子之间的吸引力连接，所述吸引力强得足以使混合的聚集体作为一个单位起作用。这包括但不限于化学键例如共价键、非共价键例如离子键、金属键和桥键、疏水相互作用、氢键作用和范德华相互作用。
当在本文中使用时，术语“官能团”理解为是指反应性功能基团，其可以被其他分子进一步修饰或衍生。一方面，反应性功能基团是胺、羧酸、羧酸酯、卤素、肼、羟胺、腈、异腈、异氰酸酯、异硫氰酸酯、硫醇、马来酰亚胺、叠氮化物、炔、四唑基、膦酸酯、烯烃、硝基和亚硝基。
当在本文中使用时，术语“化学修饰基团”或“M”理解为是指可用于改变碳酸酐酶靶向剂的物理、化学或生物性质的任何组成部分，所述性质改变例如但不限于与未用M修饰的碳酸酐酶药剂相比，使靶向剂更易溶于水或在用于给药的介质中更易分散，增加结合特异性，增加或降低分子净电荷，降低免疫原性或毒性或改变细胞摄入、药物动力学或生物学分布图。
“成像报告物”或“IR”可以是在成像中用于提供对比或信号、并且可以通过成像技术检测的任何适合的化学品或物质。在某些优选实施例中，成像报告物包含一个或多个荧光团、光致发光纳米粒子、放射性同位素、超顺磁剂、X-射线对比剂和超声剂。应该理解，IR也可以包含治疗性报告物，例如在光动力学疗法中使用的卟啉和/或放射治疗中使用的放射性核素。
术语“烷基”是本领域公知的，并包括饱和的脂族基团，包括直链烷基和支链烷基。此外，术语“烷基”（或“低级烷基”）包括“取代的烷基”，其是指具有代替烃类骨架的一个或多个碳上的氢的取代基的烷基组成部分。这样的取代基可以包括例如羟基、羰基（例如羧基、烷氧基羰基、甲酰基或酰基）、硫羰基（例如硫酯、硫乙酸酯或硫甲酸酯）、烷氧基、磷酰基、膦酸酯、亚膦酸酯、氨基、氨酰基、脒、亚氨基、氰基、硝基、叠氮基、巯基、烷基硫基、硫酸酯、磺酸酯、氨磺酰基、磺酰胺基、磺酰基、杂环基、芳烷基或芳香族或杂芳族组成部分。本领域技术人员应该理解，如果适合的话，在烃链上取代的组成部分本身可以被取代。例如，取代的烷基的取代基，可以包括取代和未取代形式的氨基、叠氮基、亚氨基、氨酰基、磷酰基（包括膦酸酯和亚膦酸酯）、磺酰基（包括硫酸酯、磺酰胺基、氨磺酰基和磺酸酯）和甲硅烷基，以及醚、烷基硫基、羰基（包括酮、醛、羧酸和酯）、-CN等。在某些实施例中，烷基没有被取代，即它是未取代的。在术语“烷基”用于描述连接化合物的两个部分的化学片段的情况下，术语“烷基”理解为是指饱和脂族基团的双自由基，包括直链烷基的双自由基和支链烷基的双自由基。为了加以说明，“Br-烷基-CO2H”中的术语烷基是指连接溴和羧酸基团的烷基双自由基。
术语“芳基”在本领域中是公知的，并且是指五元、六元和七元单环芳香族基团，其可以包括0至4个杂原子，例如苯、吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、噁唑、噻唑、三唑、吡唑、吡啶、吡嗪、哒嗪和嘧啶等。在环结构中具有杂原子的该芳基也可以称为“杂芳基”或“杂芳族”。芳香环可以在一个或多个环位置处被如上所述的那些取代基取代，例如卤素、叠氮化物、烷基、芳烷基、烯基、炔基、环烷基、羟基、烷氧基、氨基、硝基、巯基、亚氨基、氨酰基、膦酸酯、亚膦酸酯、羰基、羧基、甲硅烷基、醚、烷基硫基、磺酰基、磺酰胺基、酮、醛、酯、杂环基、芳香族或杂芳族组成部分、-CF3、-CN等。术语“芳基”还包括具有两个或更多环状环的多环状环系统，其中两个或更多碳为两个相邻环所共有（所述环是“稠合环”），其中所述环中的至少一个是芳香族的，其他的环状环可以是例如环烷基、环烯基、环炔基、芳基和/或杂环基。在某些实施例中，芳基没有被取代，即它是未取代的。在术语“芳基”用于描述连接化合物的两个部分的化学片段的情况下，术语“芳基”理解为是指芳香族基团的双自由基。为了加以说明，“Br-芳基-CO2H”中的术语芳基是指连接溴和羧酸基团的芳基双自由基。
术语“杂环”和“杂环基”在本领域中是公知的，并且是指含有一个或多个杂原子的芳香族或非芳香族环。杂原子可以彼此相同或不同。杂原子的实例包括但不限于氮、氧和硫。芳香族和非芳香族杂环在本领域中是公知的。芳香族杂环的一些非限制性实例包括吡啶、嘧啶、吲哚、嘌呤、喹啉和异喹啉。非芳香族杂环化合物的非限制性实例包括哌啶、哌嗪、吗啉、吡咯烷和吡唑烷。含氧杂环的实例包括但不限于呋喃、环氧乙烷、2H-吡喃、4H-吡喃、2H-色烯和苯并呋喃。含硫杂环的实例包括但不限于噻吩、苯并噻吩和对帕拉噻嗪。含氮环的实例包括但不限于吡咯、吡咯烷、吡唑、吡唑烷、咪唑、咪唑啉、咪唑烷、吡啶、哌啶、吡嗪、哌嗪、嘧啶、吲哚、嘌呤、苯并咪唑、喹啉、异喹啉、三唑和三嗪。含有两个不同杂原子的杂环的实例包括但不限于吩噻嗪、吗啉、帕拉对噻嗪、噁嗪、噁唑、噻嗪和噻唑。杂环的环可任选地在一个或多个环位置处进一步被例如卤素、叠氮化物、烷基、芳烷基、烯基、炔基、环烷基、羟基、烷氧基、氨基、硝基、巯基、亚氨基、氨酰基、羧酸、-C(O)烷基、-CO2烷基、羰基、羧基、烷基硫基、磺酰基、磺胺酰基磺酰胺基、磺酰胺、酮、醛、酯、杂环基、芳基或杂芳基组成部分、-CF3、-CN等取代。在某些实施例中，杂环或杂环基没有被取代，即它是未取代的。在术语“杂环基”用于描述连接化合物的两个部分的化学片段的情况下，术语“杂环基”理解为是指含有一个或多个杂原子的芳香族或非芳香族环的双自由基。为了加以说明，“Br-杂环基-CO2H”中的术语杂环基是指连接溴和羧酸基团的杂环基双自由基。
术语“胺”和“氨基”在本领域内是公知的，并且是指未取代和取代的胺两者，例如可以由下列通式表示的组成部分：
Figure BDA0000412045750000181
其中R50、R51、R52和R53的每一个独立地表示氢、烷基、烯基、-(CH2)m-R61，或者R50和R51与它们附连的N原子合在一起，完成在环结构中具有4至8个原子的杂环；R61表示芳基、环烷基、环烯基、杂环或多环；并且m是0或1至8范围内的整数。在某些实施例中，R50或R51中只有一个可以是羰基，例如R50、R51和氮一起不形成酰亚胺。在其他实施例中，R50和R51（以及可任选地R52）的每一个独立地表示氢、烷基、烯基或-(CH2)m-R61。
术语“氧基”在本领域中是公知的，并且是指“=O”取代基。例如，用氧基取代的环戊烷是环戊酮。
符号“
Figure BDA0000412045750000191
”指示附连点。
本文中描述的化合物可能含有带电荷官能团，例如-SO3 -基团。应该理解，含有这样的带电荷官能团的化合物含有（i）足够数量的带正电荷官能团和带负电荷官能团，以便提供电中性化合物，或（ii）存在一种或多种平衡离子以使化合物是电中性的。如果化学结构显示为具有总体电荷（如图示），应该理解存在足够数量的平衡离子（例如用于平衡正电荷的卤素或乙酸根，或用于平衡负电荷的金属阳离子或铵基），以便提供电中性化合物。此外，本文中示出的化合物的所有互变异构体都在本发明的范围之内。
在整个说明书中，在组合物和试剂盒描述成具有、包括或包含特定组分的地方，在过程和方法描述成具有、包括或包含特定步骤的地方，还考虑了存在基本上由所叙述的组分构成或由其构成的本发明的组合物和试剂盒，并且存在根据基本上由所叙述的过程步骤构成或由其构成的本发明的过程和方法。
各种化合物由化学结构和/或化学名来描述。在化学结构与为所述结构提供的化学名之间存在矛盾的情况下，以化学结构为准。
作为通用准则，除非另有规定，否则指定百分数的组成是以重量计。此外，如果变量不伴有定义，则以所述变量的以前的定义为准。
一方面，本发明提供了一种碳酸酐酶靶向剂，该碳酸酐酶靶向剂包含：碳酸酐酶靶向组成部分，该碳酸酐酶靶向组成部分包含被脂族、芳香族或杂芳族组成部分取代的磺酰胺组成部分；以及荧光报告物，该荧光报告物可任选地通过连接物（L）组成部分化学连接到碳酸酐酶组成部分，其中所述荧光组成部分具有多个化学修饰基团。
另一方面，本发明提供了一种碳酸酐酶靶向剂，该碳酸酐酶靶向剂包含：（a）碳酸酐酶靶向组成部分，该碳酸酐酶靶向组成部分包含可任选地被脂族、芳香族或杂芳族组成部分取代的磺酰胺组成部分；以及（b）成像报告物，该成像报告物可任选地通过连接物（L）组成部分化学连接到碳酸酐酶组成部分。
另一方面，本发明提供了由式（I）或其盐表示的碳酸酐酶靶向剂：
Figure BDA0000412045750000201
其中：
CAB是碳酸酐酶结合部分，该CAB包含磺酰胺组成部分和脂族、芳香族或杂芳族组成部分；
Q是取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、C1-C18烷基、烯基、炔基、烷氧基或硫烷基；或者Q不存在；
L1、L2和L3在每次出现时各自独立地表示连接键或连接物组成部分；
W表示苯并稠合、萘并稠合或吡啶并稠合的环；
X在每次出现时独立地是C(CH2Y1)(CH2Y2)、O、S或Se；
Y1和Y2独立地是氢或C1-C20脂族基团，每个Y1和Y2可任选地被L3—M取代；
M在每次出现时独立地是氢或化学修饰组成部分。
另一方面，本发明提供了由式（II）或其盐表示的碳酸酐酶靶向剂：
Figure BDA0000412045750000211
其中：
CAB是碳酸酐酶结合部分，该CAB包含磺酰胺组成部分和脂族、芳香族或杂芳族组成部分；
Q是取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、C1-C18烷基、烯基、炔基、烷氧基或硫烷基；或者Q不存在；
L1、L2和L3在每次出现时各自独立地表示连接键或连接物组成部分；
R在每次出现时独立地是氢、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、C1-C18烷基、烯基、炔基、烷氧基或硫烷基，每个R可任选地被L3—M取代；
n是1、2或3；
W表示苯并稠合、萘并稠合或吡啶并稠合的环；
X在每次出现时独立地是C(CH2Y1)(CH2Y2)、O、S或Se；
Y1和Y2独立地是氢或C1-C20脂族基团，每个Y1和Y2可任选地被L3—M取代；并且
M在每次出现时独立地是氢或化学修饰组成部分。
另一方面，本发明提供了由式（III）或其盐表示的碳酸酐酶靶向剂：
F-L-CAB   （III）
其中
F是近红外荧光染料；
L是任选的连接物；并且
CAB是碳酸酐酶结合部分，该CAB包含磺酰胺组成部分和脂族、芳香族或杂芳族组成部分。
另一方面，本发明提供了由式（IV）或其盐表示的碳酸酐酶靶向剂：
Figure BDA0000412045750000221
其中：
Q是未取代的杂芳基;
L1是下列之一：
（a）-C(O)N(R1)-烷基-C(O)N(R1)-ψ；
（b）-C(O)N(R1)-烷基-ψ；
（c）-C(O)N(R1)-[C2-3烷基-O]z-C1-3烷基-C(O)N(R1)-ψ；
（d）-C(O)N(R1)-烷基-芳基-C(O)N(R1)-ψ；
（e）-C(O)N(R1)-烷基-C(O)N(R1)-C1-3烷基-芳基-C(O)N(R1)-ψ；或
（f）-C(O)N(R1)-[C2-3烷基-O]z-C1-3烷基-C(O)N(R1)-烷基-芳基-C(O)N(R1)-ψ；
其中z是约3至约35的整数，R1在每次出现时独立地表示氢或烷基，并且ψ是与CAB的连接键；
L2是C1-5烷基；
M在每次出现时独立地表示磺酸盐或-SO3H；并且
CAB是-芳基-SO2NH2、-杂环基-SO2NH2、-芳基-C(O)N(R’)-杂芳基-SO2NH2、-杂芳基-C(O)N(R’)-杂芳基-SO2NH2、-C(O)N(R’)-杂芳基-杂芳基-SO2NH2或-C(O)N(R’)-芳基-杂芳基-SO2NH2，其中R’在每次出现时独立地表示氢或C1-6烷基；每个芳基和杂芳基可任选地被1或2个取代基取代，该取代基独立地选自由烷基和卤素所组成的组；并且每个杂环基可任选地被1、2或3个取代基取代，该取代基独立地选自由烷基、卤素、氨基和氧基所组成的组。
另一方面，本发明提供了由式（V）或其盐表示的碳酸酐酶靶向剂：
Figure BDA0000412045750000231
其中：
Q是C1-6烷基；
L1是下列之一：
（a）-C(O)N(R1)-烷基-C(O)N(R1)-ψ；
（b）-C(O)N(R1)-烷基-ψ；或
（c）-C(O)N(R1)-烷基-芳基-C(O)N(R1)-ψ；
其中R1在每次出现时独立地表示氢或烷基，并且ψ是与CAB的连接键；
L2是C1-5烷基；
M在每次出现时独立地表示磺酸盐或-SO3H；并且
CAB是-芳基-SO2NH2、-杂环基-SO2NH2、-芳基-C(O)N(R’)-杂芳基-SO2NH2、-杂芳基-C(O)N(R’)-杂芳基-SO2NH2、-C(O)N(R’)-杂芳基-杂芳基-SO2NH2或-C(O)N(R’)-芳基-杂芳基-SO2NH2，其中R’在每次出现时独立地表示氢或C1-6烷基；每个芳基和杂芳基可任选地被1或2个取代基取代，该取代基独立地选自由烷基和卤素所组成的组；并且每个杂环基可任选地被1、2或3个取代基取代，该取代基独立地选自由烷基、卤素、氨基和氧基所组成的组。
另一方面，本发明提供了由式（VI）或其盐表示的碳酸酐酶靶向剂：
其中：
CAB是碳酸酐酶结合部分，该CAB包含磺酰胺组成部分和脂族、芳香族或杂芳族组成部分；
Q是取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、C1-C18烷基、烯基、炔基、烷氧基或硫烷基；或者Q不存在；
L1、L2和L3在每次出现时各自独立地表示连接键或连接物组成部分；
R在每次出现时独立地是氢、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、C1-C18烷基、烯基、炔基、烷氧基或硫烷基，每个R可任选地被L3—M取代；
n是1、2或3；
W表示苯并稠合、萘并稠合或吡啶并稠合的环；
X在每次出现时独立地是C(CH2Y1)(CH2Y2)、O、S或Se；
Y1和Y2独立地是氢或C1-C20脂族基团，每个Y1和Y2可任选地被L3—M取代；并且
M在每次出现时独立地是氢或化学修饰组成部分；
并且条件是CAB至少出现一次。
另一方面，本发明提供了式（A）或其盐的化合物：
Figure BDA0000412045750000251
其中CAB是碳酸酐酶结合部分，该CAB包含磺酰胺组成部分和脂族、芳香族或杂芳族组成部分；
L在每次出现时独立地是连接键或连接物组成部分；
Q选自由取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、C1-C18烷基、烯基、炔基、烷氧基和硫烷基所组成的组；
W表示苯并稠合、萘并稠合或吡啶并稠合的环；
X在每次出现时独立地选自C(CH2Y1)(CH2Y2)、O、S和Se；
Y1和Y2独立地选自由H和C1-C20脂族基团所组成的组，每个Y1和Y2可任选地被L3—M取代；并且
M在每次出现时独立地是化学修饰组成部分或者不存在。
另一方面，本发明提供了式（B）或其盐的化合物：
Figure BDA0000412045750000252
其中CAB是碳酸酐酶结合部分，该CAB包含磺酰胺组成部分和脂族、芳香族或杂芳族组成部分；
L在每次出现时独立地是连接键或连接物组成部分；
Q选自由取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、C1-C18烷基、烯基、炔基、烷氧基和硫烷基所组成的组；或者Q不存在；
R在每次出现时独立地是取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、C1-C18烷基、烯基、炔基、烷氧基或硫烷基，每个R可任选地被L3—M取代，或者R不存在；
n是1、2或3；
W表示苯并稠合、萘并稠合或吡啶并稠合的环；
X在每次出现时独立地选自C(CH2Y1)(CH2Y2)、O、S和Se；
Y1和Y2独立地选自由H和C1-C20脂族基团所组成的组，每个Y1和Y2可任选地被L3—M取代；并且
M在每次出现时独立地是化学修饰组成部分或者不存在。
化学修饰剂M
化学修饰剂M可以是选自由磺酸盐、羧酸盐、膦酸盐、磷酸盐或亚氨基二乙酸盐所组成的组的阴离子组成部分。
化学修饰剂M可以是氢、醇、磺酰胺、亚砜、砜、酮、氨基酸或聚氨基酸、低聚或聚乙二醇、胺、季铵离子或糖例如葡萄糖胺、半乳糖胺或甘露糖胺。
化学修饰剂M可以是金属螯合剂，例如乙二胺四乙酸、二亚乙基三胺五乙酸和四氮杂环十二烷四乙酸。在本发明的另一方面，一个或多个金属螯合M基团配位到金属离子。
化学修饰剂M可以是给予药剂以明显的净负电荷的可离子化基团，例如羧酸盐、磺酸盐、膦酸盐、磷酸盐或亚氨基二乙酸盐。在某些实施例中，在用多个可离子化修饰基团化学修饰荧光团后，在中性pH下药剂上的净电荷在-3与-12之间。在某些实施例中，荧光团组成部分上的净电荷为-5。
在某些实施例中，化学修饰剂M包含生物活性分子，例如药物或放射治疗组成部分。在某些实施例中，生物活性分子通过连接物连接到药剂，所述连接物可通过生物或物理机制包括酶、热、酸催化或光化学切割来剪切。
在某些实施例中，M在每次出现时独立地表示磺酸盐或-SO3H。在某些实施例中，M在每次出现时独立地表示氢、磺酸盐或-SO3H。
在某些实施例中，M在每次出现时独立地表示选自由下列的取代基所组成的组：氢，醇，磺酸，磺酸盐，多磺酸盐，磺基丙氨酸，磺酰胺，亚砜，砜，羧酸盐，酮，膦酸盐，磷酸盐；亚氨基二乙酸盐，乙二胺四乙酸，二亚乙基三胺五乙酸，四氮杂环十二烷四乙酸，氨基酸或聚氨基酸，低聚或聚乙二醇，胺，季铵离子，糖，葡萄糖胺，半乳糖胺，甘露糖胺，聚乙二醇（PEG），烷氧基聚乙二醇，支链聚丙二醇，聚丙二醇，聚赖氨酸和甲氧基聚乙二醇的接枝共聚物，肽，脂，脂肪酸，棕榈酸盐，磷脂，磷脂-PEG缀合物，糖类，氧化铁纳米粒子，萘基丙氨酸，苯基丙氨酸，3,3-二苯基丙胺，牛磺酸，膦酸盐，磷酸盐，羧酸盐和聚羧酸盐。
在某些实施例中，M在每次出现时独立地表示氢或-N(C1-4烷基-SO3H)2。
在某些实施例中，化学修饰组成部分M增强碳酸酐酶靶向剂对碳酸酐酶IX相对于其他碳酸酐酶包括但不限于碳酸酐酶II的结合选择性。在某些实施例中，化学修饰组成部分M修饰碳酸酐酶靶向剂，使其在中性pH下具有-3至-12范围内的净负电荷。在某些实施例中，化学修饰组成部分M降低碳酸酐酶靶向剂的非特异性细胞膜通透性。在某些其他实施例中，化学修饰组成部分M降低碳酸酐酶靶向剂在给药于动物活体时的非特异性组织积累。
连接物组成部分
在某些实施例中，连接物组成部分L包含选自由下列的组成部分所组成的组：甘氨酸，丙氨酸，β-丙氨酸，-NH-(CH2)n-C(=O)-其中n=1-8，4-氨基甲基苯甲酸，磺基丙氨酸，谷氨酸，氨基-聚乙二醇-羧酸，氨基-聚乙二醇胺，乙二胺，丙二胺，亚精胺，精胺，己二胺，和二胺-氨基酸例如高赖氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、二氨基丁酸和二氨基丙酸，琥珀酸，戊二酸，辛二酸和己二酸。在某些实施例中，L是连接键。
在某些其他实施例中，每个L1、L2和L3独立地包含-NH-(CH2)n-C(=O)-其中n=1-8，或选自由下列的组成部分所组成的组的双自由基：甘氨酸，丙氨酸，β-丙氨酸，4-氨基甲基苯甲酸，磺基丙氨酸，谷氨酸，氨基-聚乙二醇-羧酸，氨基-聚乙二醇胺，乙二胺，丙二胺，亚精胺，精胺，己二胺，二胺-氨基酸，赖氨酸，鸟氨酸，二氨基丁酸，二氨基丙酸，琥珀酸，戊二酸，辛二酸，己二酸，酰胺，三唑，脲和硫脲。
在某些实施例中，L1是下列之一：（a）-C(O)N(R1)-烷基-C(O)N(R1)-ψ；（b）-C(O)N(R1)-烷基-ψ；（c）-C(O)N(R1)-[C2-3烷基-O]z-C1-3烷基-C(O)N(R1)-ψ；（d）-C(O)N(R1)-烷基-芳基-C(O)N(R1)-ψ；（e）-C(O)N(R1)-烷基-C(O)N(R1)-C1-3烷基-芳基-C(O)N(R1)-ψ；或（f）-C(O)N(R1)-[C2-3烷基-O]z-C1-3烷基-C(O)N(R1)-烷基-芳基-C(O)N(R1)-ψ；其中z是约3至约35的整数，R1在每次出现时独立地表示氢或烷基，并且ψ是与CAB的连接键。
在某些实施例中，L2是C1-5烷基。在某些实施例中，L3是连接键。
在某些实施例中，L2M是-(CH2)0-3CH3。
变量Q
在某些实施例中，Q可以选自由（i）官能化的取代或未取代的芳香族或杂芳族环，（ii）官能化的取代或未取代的含氮杂环，（iii）官能化的取代或未取代的含氮六元杂环，例如吡啶、嘧啶酮、吡嗪和哒嗪，（iv）官能化的取代或未取代的六元芳香族环，例如苯，（v）官能化的取代或未取代的C1-C18烷基、烯基、炔基、烷氧基或硫烷基所组成的组。在其他实施例中，Q不存在。
在某些实施例中，Q是未取代的杂芳基例如吡啶基。在某些其他实施例中，Q是烷基例如C1-4烷基。
示例性的特异性碳酸酐酶靶向剂
碳酸酐酶靶向剂可以选自由：
3-乙基-2-((1E,3Z,5E)-5-(3-乙基-1,1-二甲基-6,8-二磺基-1H-苯并[e]吲哚-2(3H)-亚基)-3-(5-((4-氨磺酰基苯甲基)氨甲酰基)吡啶-2-基)戊-1,3-二烯-1-基)-1,1-二甲基-6,8-二磺基-1H-苯并[e]吲哚-3-鎓；
3-(2-((1E,3Z,5E)-5-(1,1-二甲基-6,8-二磺基-3-(3-磺基丙基)-1H-苯并[e]吲哚-2(3H)-亚基)-3-(5-((4-氨磺酰基苯甲基)氨甲酰基)吡啶-2-基)戊-1,3-二烯-1-基)-1,1-二甲基-6,8-二磺基-1H-苯并[e]吲哚-3-鎓-3-基)丙烷-1-磺酸盐；
3-(2-((1E,3E,5E)-5-(1,1-二甲基-6,8-二磺基-3-(3-磺基丙基)-1H-苯并[e]吲哚-2(3H)-亚基)戊-1,3-二烯-1-基)-1,1-二甲基-6-(N-甲基-N-(4-氧基-4-((4-氨磺酰基苯甲基)氨基)丁基)氨磺酰基)-1H-苯并[e]吲哚-3-鎓-3-基)丙烷-1-磺酸盐；
3-(2-((1E,3Z,5E)-5-(1,1-二甲基-6,8-二磺基-3-(3-磺基丙基)-1H-苯并[e]吲哚-2(3H)-亚基)-3-(5-((6-氧基-6-((4-氨磺酰基苯甲基)氨基)己基)氨甲酰基)吡啶-2-基)戊-1,3-二烯-1-基)-1,1-二甲基-6,8-二磺基-1H-苯并[e]吲哚-3-鎓-3-基)丙烷-1-磺酸盐；
3-(2-((1E,3Z,5E)-5-(1,1-二甲基-6,8-二磺基-3-(3-磺基丙基)-1H-苯并[e]吲哚-2(3H)-亚基)-3-(5-((3-氧基-1-(4-氨磺酰基苯基)-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75-二十四氧杂-2-氮杂七十七烷-77-基)氨甲酰基)吡啶-2-基)戊-1,3-二烯-1-基)-1,1-二甲基-6,8-二磺基-1H-苯并[e]吲哚-3-鎓-3-基)丙烷-1-磺酸盐；
3-(2-((1E,3E,5E)-5-(1,1-二甲基-6,8-二磺基-3-(3-磺基丙基)-1H-苯并[e]吲哚-2(3H)-亚基)戊-1,3-二烯-1-基)-1,1-二甲基-6-(N-甲基-N-(4-氧基-4-((4-((5-氨磺酰基-1,3,4-噻二唑-2-基)氨甲酰基)苯甲基)氨基)丁基)氨磺酰基)-1H-苯并[e]吲哚-3-鎓-3-基)丙烷-1-磺酸盐；
3-(2-((1E,3Z,5E)-5-(1,1-二甲基-6,8-二磺基-3-(3-磺基丙基)-1H-苯并[e]吲哚-2(3H)-亚基)-3-(5-((6-氧基-6-((4-((5-氨磺酰基-1,3,4-噻二唑-2-基)氨甲酰基)苯甲基)氨基)己基)氨甲酰基)吡啶-2-基)戊-1,3-二烯-1-基)-1,1-二甲基-6,8-二磺基-1H-苯并[e]吲哚-3-鎓-3-基)丙烷-1-磺酸盐；
3-乙基-2-((1E,3Z,5E)-5-(3-乙基-1,1-二甲基-6,8-二磺基-1H-苯并[e]吲哚-2(3H)-亚基)-3-(5-((4-((5-氨磺酰基-1,3,4-噻二唑-2-基)氨甲酰基)苯甲基)氨甲酰基)吡啶-2-基)戊-1,3-二烯-1-基)-1,1-二甲基-8-磺基-1H-苯并[e]吲哚-3-鎓-6-磺酸盐；
3-(2-((1E,3Z,5E)-5-(1,1-二甲基-6,8-二磺基-3-(3-磺基丙基)-1H-苯并[e]吲哚-2(3H)-亚基)-3-(5-((4-((5-氨磺酰基-1,3,4-噻二唑-2-基)氨甲酰基)苯甲基)氨甲酰基)吡啶-2-基)戊-1,3-二烯-1-基)-1,1-二甲基-6,8-二磺基-1H-苯并[e]吲哚-3-鎓-3-基)丙烷-1-磺酸盐；
3-(2-((1E,3Z,5E)-5-(1,1-二甲基-6,8-二磺基-3-(3-磺基丙基)-1H-苯并[e]吲哚-2(3H)-亚基)-3-(5-((3-氧基-1-(4-((5-氨磺酰基-1,3,4-噻二唑-2-基)氨甲酰基)苯基)-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75-二十四氧杂-2-氮杂七十七烷-77-基)氨甲酰基)吡啶-2-基)戊-1,3-二烯-1-基)-1,1-二甲基-6,8-二磺基-1H-苯并[e]吲哚-3-鎓-3-基)丙烷-1-磺酸盐；
3-(2-((1E,3Z,5E)-5-(1,1-二甲基-6,8-二磺基-3-(3-磺基丙基)-1H-苯并[e]吲哚-2(3H)-亚基)-3-(5-((3-氧基-3-((5-氨磺酰基-1,3,4-噻二唑-2-基)氨基)丙基)氨甲酰基)吡啶-2-基)戊-1,3-二烯-1-基)-1,1-二甲基-6,8-二磺基-1H-苯并[e]吲哚-3-鎓-3-基)丙烷-1-磺酸盐；以及
3-(2-((1E,3Z,5E)-5-(3,3-二甲基-5-磺基-1-(3-磺基丙基)二氢吲哚-2-亚基)-3-(5-((3-氧基-3-((5-氨磺酰基-1,3,4-噻二唑-2-基)氨基)丙基)氨甲酰基)吡啶-2-基)戊-1,3-二烯-1-基)-3,3-二甲基-5-磺基-3H-吲哚-1-鎓-l-基)丙烷-1-磺酸盐；及其可药用盐所组成的组。
在某些实施例中，碳酸酐酶靶向剂是在实施例中描述的碳酸酐酶靶向剂或其可药用盐中的一个。
碳酸酐酶靶向剂可以在远红或近红外光谱范围内发出荧光。
在某些实施例中，碳酸酐酶靶向剂还包含独立地化学连接到CAB、L和/或F或其任何组合的一个或多个化学修饰剂。碳酸酐酶结合部分、成像报告物、连接物和生物修饰剂的每种特点，在下文中更详细讨论。
碳酸酐酶结合部分
可用于本发明的实践的某些示例性碳酸酐酶结合部分，描述在美国专利号7,833,737；以及国际申请公布号WO2006/137092、WO2008/124703、WO2010/147666和WO2010/065906中，其全部以其全文通过引用并入本文。
在某些实施例中，碳酸酐酶结合（CAB）组成部分是-芳基-SO2NH2、-杂环基-SO2NH2、-芳基-C(O)N(R’)-杂芳基-SO2NH2、-杂芳基-C(O)N(R’)-杂芳基-SO2NH2、-C(O)N(R’)-杂芳基-杂芳基-SO2NH2或-C(O)N(R’)-芳基-杂芳基-SO2NH2，其中R’在每次出现时独立地表示氢或C1-6烷基；每个芳基和杂芳基可任选地被1或2个取代基取代，该取代基独立地选自由烷基和卤素所组成的组；并且每个杂环基可任选地被1、2或3个取代基取代，该取代基独立地选自由烷基、卤素、氨基和氧基所组成的组。
在某些实施例中，CAB是-苯基-SO2NH2；-吡啶基-SO2NH2；1,3,4-噻二唑-SO2NH2；-苯并[d]噻唑-SO2NH2；-苯基-C(O)N(H)-吡啶基-SO2NH2；-苯基-C(O)N(H)-1,3,4-噻二唑-SO2NH2；-吡啶基-C(O)N(H)-1,3,4-噻二唑-SO2NH2；-C(O)N(H)-吡啶基-1,3,4-噻二唑-SO2NH2；或-C(O)N(H)-苯基-1,3,4-噻二唑-SO2NH2；其中每个苯基、吡啶基和噻二唑可任选地被1或2个取代基取代，该取代基独立地选自由烷基和卤素所组成的组。
在某些实施例中，碳酸酐酶结合部分是下列之一：
Figure BDA0000412045750000321
Figure BDA0000412045750000322
或
Figure BDA0000412045750000323
成像报告物
应该理解，各种不同的成像报告物例如荧光和非荧光报告物，可用于生产本发明的碳酸酐酶靶向剂。
（a）荧光报告物
在某些实施例中，成像报告物是荧光团分子。“荧光团”包括但不限于荧光染料、荧光染料淬灭剂分子、任何有机或无机染料、金属螯合物或任何产荧光酶底物，包括可由蛋白酶激活的酶底物。
在某些实施例中，碳酸酐酶靶向剂包含荧光团。在某些实施例中，荧光团是在约600至约1200nm之间，更优选地在约600nm至约900nm之间具有最大吸收和发射的远红和近红外荧光染料（NIRF）。应该理解，在其他光谱中具有激发和发射波长的荧光染料的使用，也可用于本发明的组合物和方法中。示例性的荧光染料包括但不限于羰花青荧光染料和靛青荧光染料。
近红外荧光染料优选地在水介质中具有每个荧光染料分子至少50,000M-1cm-1的消光系数。近红外荧光染料优选地还具有体内和人类应用所要求的（1）高量子产率（即在水介质中量子产率高于5%），（2）窄幅激发/发射光谱，在光谱上分离的吸收和发射光谱（即激发和发射最大值相隔至少15nm），（3）高的化学和光稳定性，（4）无毒性，（5）良好的生物相容性、生物可降解性和可排泄性，以及（6）商业可行性和数量大（即克和千克级的量）的大规模生产。
某些羰花青或聚甲炔荧光染料可用于生产本发明的碳酸酐酶靶向剂，并包括例如在美国专利号6,747,159；美国专利号6,448,008；美国专利号6,136,612；美国专利号4,981,977；5,268,486；美国专利号5,569,587；美国专利号5,569,766；美国专利号5,486,616；美国专利号5,627,027；美国专利号5,808,044；美国专利号5,877,310；美国专利号6,002,003；美国专利号6,004,536；美国专利号6,008,373；美国专利号6,043,025；美国专利号6,127,134；美国专利号6,130,094；美国专利号6,133,445；以及WO97/40104、WO99/51702、WO01/21624和EP1065250A1；以及Tetrahedron Letters41,9185-88(2000)中所描述的。
各种荧光染料是可商购的，并可用于构建本发明的碳酸酐酶靶向剂。示例性的荧光染料包括例如Cy5.5、Cy5和Cy7（GE Healthcare）；AlexaFlour660、AlexaFlour680、AlexaFluor750和AlexaFluor790（Invitrogen）；VivoTag680、VivoTag-S680和VivoTag-S750（VisEnMedical）；Dy677、Dy682、Dy752和Dy780（Dyomics）；DyLight547、DyLight647（Pierce）；HiLyte Fluor647、HiLyte Fluor680和HiLyte Fluor750（AnaSpec）；IRDye800CW、IRDye800RS和IRDye700DX（Li-Cor）；以及ADS780WS、ADS830WS和ADS832WS（American Dye Source）和Kodak X-SIGHT650、Kodak X-SIGHT691、Kodak X-SIGHT751（Carestream Health）。
表1列出了许多可用于本发明的实践的示例性荧光染料及其光谱性质。
表1
Figure BDA0000412045750000341
在某些实施例中，荧光团被多个化学修饰基团取代。在一种实施例中，荧光团由式VI或其盐表示：
Figure BDA0000412045750000342
其中
W表示苯并稠合、萘并稠合或吡啶并稠合的环；
X在每次出现时独立地选自由C(CH2Y1)(CH2Y2)、O、S和Se所组成的组；
Y1和Y2独立地选自H和C1-C20脂族基团，每个Y1和Y2可任选地被L—M取代；
L在每次出现时独立地表示连接键或连接物组成部分；
M在每次出现时独立地表示化学修饰组成部分。
在一种实施例中，荧光染料由式VII或其盐表示：
Figure BDA0000412045750000351
其中：
X独立地选自由C(CH2Y1)(CH2Y2)、O、S和Se所组成的组；
Y1和Y2独立地选自由H、C1-C20脂族基团和被-OR*、N(R*)2或-SR*取代的C1-C20脂族基团所组成的组；
W表示苯并稠合、萘并稠合或吡啶并稠合的环；
R*是烷基；
R1选自由(CH2)xCH3、(CH2)nSO3 -和(CH2)nSO3H所组成的组，其中x是选自0到6的整数，并且n是选自2到6的整数；
R4选自由(CH2)xCH3、(CH2)nSO3 -和(CH2)nSO3H所组成的组，其中x是选自0到6的整数，并且n是选自2到6的整数；
R2和R3独立地选自由H、羧酸盐、羧酸、羧酸酯、胺、酰胺、磺酰胺、羟基、烷氧基、磺酸组成部分和磺酸酯组成部分所组成的组；并且
Q选自由被羧基取代的杂芳基环或被羰基取代的六元杂芳基环所组成的组。
在式VII的某些实施例中，Q选自由（i）羧基官能化的杂环，（ii）羧基官能化的含氮杂环，（iii）羧基官能化的含氮六元杂环例如吡啶、嘧啶酮、吡嗪和哒嗪，（iv）羧基官能化的含氮六元杂环例如吡啶，（v）羰基官能化的含氮六元杂环例如吡啶，以及（vi）异烟酸、烟酸和吡啶甲酸所组成的组，以及选自下列的基团：
Figure BDA0000412045750000352
其中，羧基也以能够与亲核试剂反应的酯、活性酯或羰基卤化物的形式，并且可以是例如-C(O)O-苯并三唑基、-C(O)O-N-琥珀酰亚胺基、-C(O)O-四氟苯基、-C(O)O-五氟苯基、-C(O)O-咪唑或-C(O)O-对硝基苯基。
在另一种实施例中，荧光染料由式VIII或其盐表示：
Figure BDA0000412045750000361
其中：
X1和X2独立地选自由C(CH2K1)(CH2K2)、O、S和Se所组成的组；
K1和K2独立地是H或a C1-C20脂族基团；或者K1与K2一起是取代或未取代的碳环或杂环的一部分；
Y1和Y2各自独立地是苯并稠合的环、萘稠合的环或吡啶并稠合的环；
n1为1、2或3；
R2、R11和R12独立地是H、卤素、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、芳氧基、芳基、磺酸盐、亚胺离子，或者任何两个相邻的R12和R11取代基，当组合在一起时，形成可任选地被C1-C6烷基或卤素取代一次或多次的四元、五元或六元碳环；
R1和R13是(CH2)xCH3，其中x是选自0至6的整数；或者R1和R13独立地是(CH2)nSO3 -或(CH2)nSO3H，其中n是选自2至6的整数；
R3、R4和R5独立地选自由H、羧酸盐、羧酸、羧基酯、胺、酰胺、磺酰胺、羟基、烷氧基、磺酸组成部分和磺酸酯组成部分所组成的组；
R6选自由未取代的C1-C20脂族基团、未取代的芳基或未取代的烷基芳基所组成的组；
R7选自由H、未取代的C1-C20脂族基团、未取代的芳基或未取代的烷基芳基所组成的组，其中R7可任选地被卤素取代；或者
R6和R7合在一起形成可任选地被卤素取代的四元、五元、六元或七元杂环；
W不存在，或者是选自由-SO2NR6-CHR7-、-O-、-COO-和-CONH-所组成的组的基团；
h=0-70；k=0或1；d=0-12；m=0-12；p=0-12。
[00123]可用于本发明的碳酸酐酶靶向剂的合成的示例性化学修饰荧光团，包括例如在表2中列出的。
表2
Figure BDA0000412045750000381
Figure BDA0000412045750000401
Figure BDA0000412045750000411
在某些实施例中，可以将一种或多种荧光染料分子化学连接到碳酸酐酶结合部分以产生荧光碳酸酐酶靶向剂。
在成像报告物是荧光染料分子的情形下，碳酸酐酶靶向剂的消光系数可以使用公式ε=A/cl计算为染料在1cm光程比色皿中，在其最大吸收波长处（例如对于VivoTag680来说在～670nm处）的吸收值与粒子的浓度之比，其中A是吸收值，c是摩尔浓度，并且l是以cm为单位的光程。
应该理解，可以将碳酸酐酶靶向剂连接到纳米粒子（例如含硅纳米粒子）以产生荧光或发光纳米粒子。晶体硅的聚集体（作为硅的多或单晶体）、多孔硅或无定形硅或这些形式的组合，能够形成纳米粒子。优选的荧光硅纳米粒子具有约0.5nm至约25nm之间的直径，更优选地具有约2nm至约10nm之间的直径。纳米粒子的尺寸可以通过激光散射或通过原子力显微术或其他适合的技术来确定。
荧光硅纳米粒子可能具有200至2000nm的激发和发射光谱，然而，优选的荧光硅纳米粒子具有约400nm至约1200nm（并且优选地500nm-900nm，例如500nm-600nm、600nm-700nm、700nm-800nm或800nm-900nm）之间的激发和发射最大值。优选的荧光硅纳米粒子还在水介质中具有至少50,000M-1cm-1的消光系数。尽管在400nm至1200nm之间具有激发和发射最大值的荧光硅纳米粒子是优选的，但应该理解，具有在其他光谱中的激发和发射波长的荧光硅纳米粒子的使用，也可用于本发明的组合物和方法中。例如，在某些实施例中，粒子可能具有将近约300-350nm的激发和近似约400-450nm的发射。
荧光硅纳米粒子可能还具有体内和人类应用所要求的下列性质：（1）高量子产率（即在水介质中量子产率高于5%），（2）窄幅发射光谱（即小于75nm；更优选地小于50nm），（3）在光谱上分离的吸收和发射光谱（即超过20nm；更优选地超过50nm），（3）具有高的化学稳定性和光稳定性（即在暴露于光后保留发光性质），（4）是生物相容的（参见下文）或可以被制造成更生物相容的，（5）在用于成像方案的剂量下对细胞或对象无毒性或毒性极小（通过例如LD50或刺激性试验或本领域已知的其他类似方法来测量），和/或（6）商业可行性和数量大（即克和千克级的量）的大规模生产。
其他示例性荧光团包括发出荧光并可用于各种体外和体内应用的金属氧化物纳米粒子。在一种实施例中，碳酸酐酶结合部分缀合到具有一种或多种下列特征的荧光金属氧化物纳米粒子：（1）适合于附连多个荧光染料，从而获得大的消光系数（超过1,000,000M-1cm-1）的聚合物涂层，（2）适合于每个粒子附连约10至约300个荧光染料的非交联聚合物涂层，（3）适合于以不显著损害荧光染料的量子产率（例如当在相同条件下测试时，纳米粒子保留由相同数量的游离荧光染料产生的至少50%的荧光信号）的方式附连多个荧光染料的聚合物涂层，以及（4）适合于生物分子的高效化学连接并保留它们的生物性质以产生分子成像剂的聚合物涂层。在荧光染料和碳酸酐酶靶向剂的化学连接之前和之后两种情况下，荧光金属氧化物纳米粒子在体外是高度稳定的分子成像剂，但是在体内仍然不稳定和/或可降解。
碳酸酐酶结合部分可以连接到荧光量子点例如胺类T2MPEviTags（Evident Technologies）或Qdot纳米晶体（Invitrogen）。一般来说，荧光量子点是含有几种半导体材料原子的纳米晶体，包括但不限于含有镉和硒、硫化物或碲;硫化锌、铟-锑、硒化铅、砷化镓和二氧化硅或有机改性硅酸盐的纳米晶体，其已用硫化锌包覆以改进这些荧光剂的性质。
此外，碳酸酐酶结合部分可以缀合于能够引发光动力治疗的分子。这些分子包括但不限于Photofrin、Lutrin、Antrin、氨基乙酰丙酸、金丝桃素、苯并卟啉衍生物和选择性卟啉。
在某些实施例中，可以将一个或多个不同荧光团分子共价连接到可剪切（例如可用酶剪切）的寡肽，或者可以将两个基本上相似的荧光团共价连接到寡肽的由切割位点例如蛋白水解切割位点分隔的荧光淬灭容许位置处，以产生本发明的成像剂。
在某些实施例中，使用淬灭剂来淬灭来自于共价连接到寡肽的荧光团的荧光信号。例如，药剂可以设计成使得当药剂处于未激活状态下时，淬灭剂淬灭成像剂的荧光团的荧光，使得在被激活之前成像剂表现出很少或没有信号。应该理解，淬灭剂可以是非荧光剂，其当适合地相对于荧光团定位（即位于荧光淬灭容许位置处）时，能够淬灭来自于荧光团的发射信号。应该理解，某些上述荧光团可以起到淬灭其他空间分隔的荧光团的荧光信号的作用，当所述两个荧光团放置在荧光淬灭相互作用容许位置处时。
许多淬灭剂是可用的并为本领域技术人员所知，包括但不限于4-{[4-(二甲基氨基)-苯基]-氮杂}-苯甲酸（DABCYL）、
Figure BDA0000412045750000431
-7（9-[2-[(4-羧基-1-哌啶基)磺酰基]苯基]-3,6-双(甲基苯基氨基)-氯化占吨鎓）（Molecular Probes,Inc.,OR）、
Figure BDA0000412045750000432
-33（Molecular Probes,Inc.,OR）、ATTO612Q、ATTO580Q（ATTO-TEC,德国）；Black Hole 
Figure BDA0000412045750000433
（Bioresearch Technologies,Novato,CA）、QXLTM680酸（AnaSpec,SanJose CA）和发出荧光的荧光团例如Cy5和Cy5.5（例如，2-[5-[3-[6-[(2,5-二氧代-1-吡咯烷基)氧基]-6-氧代己基]-1,3-二氢-1,1-二甲基-6,8-二磺基-2H-苯并[e]吲哚-2-亚基]-1,3-戊二烯基]-3-乙基-1,1-二甲基-6,8-二磺基-1H-苯并[e]吲哚鎓，内盐）（Schobel,Bioconjugate10:1107,1999）。可以使用其他淬灭策略，例如使用各种溶剂来淬灭药剂的荧光。
可以淬灭其他荧光团的发射的示例性荧光团示出在表3中。
表3
Figure BDA0000412045750000441
在这样的实施例中，两个荧光团或荧光团与淬灭剂在完整成像剂内位于荧光淬灭相互作用容许位置处。换句话说，第一荧光团在完整成像剂中位于距离第二荧光团（或淬灭剂）足够近，以允许它们彼此光化学相互作用，使得第二荧光团（或淬灭剂）淬灭来自于第一荧光团的信号。在成像剂具有两个荧光团的情形中，一个荧光团优选地淬灭另一个荧光团。对于淬灭的原理，参见美国专利号6,592,847。
（b）非荧光报告物
当在本文中使用时，术语“非荧光报告物”是指不发出荧光但是可用于在成像中提供对比或信号，并且可以通过非荧光成像技术检测的化学组成部分。在某些实施例中，其他非荧光报告物可以与成像剂化学连接，或者可以与本发明的成像剂同时或相继给药于对象。这样的报告物可以包括光致发光纳米粒子、放射性同位素、超顺磁性剂、X-射线对比剂和超声剂。报告物还可以包含治疗性报告物例如卟啉类、氨基乙酰丙酸、金丝桃素、在光动力疗法中使用的苯并卟啉衍生物和用于放疗的放射性核素。
（i）放射活性报告物
药剂可以包括一种或多种放射活性标记物。金属例如铜、镓、铟、锝、钇和镥的放射性同位素形式可以化学连接到金属成像剂，并可用于核成像或治疗性应用。示例性的放射活性标记物包括但不限于99mTc、111In、64Cu、67Ga、186Re、188Re、153Sm、177Lu和67Cu。
其他示例性标记物包括例如123I、124I、125I、11C、13N、15O和18F。其他示例性标记物可以是治疗性放射药物，包括例如186Re、188Re、153Sm、166Ho、177Lu、149Pm、90Y、212Bi、103Pd、109Pd、159Gd、140La、198Au、199Au、169Yb、175Yb、165Dy、166Dy、67Cu、105Rh、111Ag和192Ir。
还考虑了用于诊断和治疗性放射药物的螯合剂或键合组成部分，并且它们可以与成像剂化学缔合。可以选择示例性的螯合剂，以与具有可成像的γ射线或正电子发射的放射性同位素例如99mTc、111In、64Cu和67Ga形成稳定复合物。示例性螯合剂包括二胺二硫醇、单胺-单酰胺二硫醇、三酰胺-单硫醇、单胺-二酰胺-单硫醇、二胺二肟和肼。螯合剂一般是四配位的，具有选自氮、氧和硫的配位原子，并且可以包括例如环和非环聚氨基羧酸盐例如二亚乙基三胺五乙酸（DTPA）、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-l,4,7,10-四乙酸（DOTA）、（DO3A）、2-苯甲基-DOTA、α-(2-苯乙基)1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-乙酰-4,7,10-三(甲基乙酰)酸、2-苯甲基-环己基二亚乙基三胺五乙酸、2-苯甲基-6-甲基-DTPA和6,6’’-双[N,N,N’’,N’’-四(羧甲基)氨基甲基)-4’-(3-氨基-4-甲氧基苯基)-2,2’:6’,2’’-三联吡啶。
（ii）磁性报告物
其他示例性报告物可以包括用于磁共振药剂的螯合剂。这样的螯合剂可以包括例如可以化学连接到药剂的多胺-聚羧酸盐螯合剂或亚氨基乙酸螯合剂。
可以选择用于磁共振成像剂的螯合剂，以与顺磁性金属离子例如Gd(III)、Dy(III)、Fe(III)和Mn(II)形成稳定的复合物，所述螯合剂选自环和非环聚氨基羧酸盐例如DTPA、DOTA、DO3A、2-苯甲基-DOTA、α-(2-苯乙基)1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-乙酰-4,7,10-三(甲基乙酰)酸、2-苯甲基-环己基二亚乙基三胺五乙酸、2-苯甲基-6-甲基-DTPA和6,6’’-双[N,N,N’’,N’’-四(羧甲基)氨基甲基)-4’-(3-氨基-4-甲氧基苯基)-2,2’:6’,2’’-三联吡啶。
在一种实施例中，碳酸酐酶靶向剂缀合于超顺磁性金属氧化物纳米粒子，所述纳米粒子是（a)非荧光的或（b）荧光的，并且可用于各种体外和体内应用。还具有磁性质的荧光金属氧化物纳米粒子可用于MRI，因此提供了多模式成像剂。
在某些实施例中，成像剂可以包括荧光和/或非荧光超顺磁性金属氧化物纳米粒子，其具有一个或多个下述特征：（1）适合于附连多个药剂的聚合物涂层，（2）适合于每个粒子附连约10至约300个药剂的非交联聚合物涂层，以及（3）适合于药剂的高效化学连接并保留它们的生物性质以产生分子成像剂的聚合物涂层。药剂修饰的金属氧化物纳米粒子在化学连接药剂之前和之后两种情况下，在体外可以是高度稳定的分子成像剂。但是在体内仍然不稳定和/或可降解。
碳酸酐酶靶向剂缀合的金属氧化物纳米粒子可以配制在适合于给药到对象例如动物和/或人类对象的药物组合物中。
（iii）超声报告物
为了进行超声成像，成像报告物可以包括充气气泡例如Levovist、Albunex或Echovist或粒子或金属螯合剂，其中金属离子具有21-29、42、44或57-83的原子序数。这样的化合物的实例描述在Tyler等，Ultrasonic Imaging,3,pp.323-29(1981)和D.P.Swanson，“用于超声的增强药剂：基础”（Enhancement Agents for Ultrasound:Fundamentals），Pharmaceuticals in Medical Imaging,pp.682-87(1990)中。
（iv）X-射线报告物
示例性报告物可以包含碘代有机分子或原子序数为57至83的重金属离子的螯合剂。这样的化合物的实例描述在M.Sovak主编的《造影剂》（Radiocontrast Agents），Springer-Verlag，pp.23-125(1984)和美国专利4,647,447中。
连接物
连接物或间隔物组成部分（L）可用于将一种或多种化学修饰剂（M）化学连接到荧光团，和/或将CAB组成部分连接到Q，或者如果Q不存在，直接连接到本发明药剂的荧光团。有用的连接物组成部分包括天然和非天然两类氨基酸和核酸、肽，例如甘氨酸、β-丙氨酸、γ-氨基丁酸或氨基己酸，以及合成的连接物分子例如氨基乙基马来酰亚胺或苯甲酸氨基甲基酯，或聚合物例如同双官能或异双官能聚乙二醇（PEG）。当连接物是肽时，所述肽可以可任选地包括蛋白水解切割位点，其可以用各种试剂例如酶切割。
应该理解，对给定连接物没有特别的结构、尺寸或内含物限制。连接物可以包括例如各种官能团例如马来酰亚胺、二硫代吡啶基、硫醇、叠氮化物、烯烃或炔，其允许分子组装具有多样化结构。
连接物可以是同官能连接物或异官能连接物。例如，胺（NH2）官能化组成部分可以与被设计和氨基反应的双官能交联剂反应。可以促进连接物形成或促进例如荧光团与可酶切割的寡肽之间的共价连接的特别有用的偶联试剂，可以包括N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）酯和/或马来酰亚胺。NHS酯可以与例如肽或荧光团的胺基反应。马来酰亚胺可以与其他分子的巯基反应。其他特别有用的连接物组成部分是双官能交联剂例如N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯（SPDP）、长链SPDP、马来酰亚胺基苯甲酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯（MBS）、琥珀酰亚胺基反式-4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯（SMCC）、琥珀酰亚胺基碘乙酸酯（SIA）。
在某些实施例中，连接物如果存在，可以是二胺的衍生物。二胺组成部分或衍生物，可以通过可任选地用羧酸衍生，为化学连接的分子提供不同长度和化学性质的连接臂。二胺的非限制性实例包括乙二胺（EDA）、丙二胺、亚精胺、精胺、己二胺和二胺-氨基酸例如高赖氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、二氨基丁酸和二氨基丙酸。在其他实施例中，成像剂组成部分可以化学连接到二羧酸，例如琥珀酸、戊二酸、辛二酸或己二酸。在一种实施例中，连接物是氨基乙基马来酰亚胺。
在某些实施例中，连接物可以分支，例如谷氨酸或5-(氨基甲基)间苯二酸，或者是树枝状分子，例如赖氨酸或谷氨酸树枝状分子，具有连接到荧光团上的单一位点的多个M基团。
在某些实施例中，L是官能化的取代或未取代的C1-C18烷基、烯基、炔基、烷氧基或硫烷基。在其他实施例中，L是官能化的取代或未取代的芳香族或杂芳族环。在其他实施例中，L不存在。
在某些实施例中，连接物可以从叠氮化物组成部分形成，所述叠氮化物组成部分可以在叠氮化物-乙炔Huisgen[3+2]环加成反应中与取代的炔反应。在某些实施例中，叠氮化物或炔连接物可以将聚乙二醇（PEG）组成部分连接到例如可酶切割的寡肽。其他被考虑的连接物包括炔丙基甘氨酸、戊酰基、戊炔酸、炔丙基酸和/或炔丙胺组成部分。
在某些实施例中，使用与氨基官能化的CAB的胺基反应的IR上的反应性NHS酯基团，将成像报告物直接化学连接到碳酸酐酶结合部分。在某些其他实施例中，IR上的羧酸基团可以通过本领域已知的活化剂在原位活化，所述活化剂例如2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐（HBTU）、l-乙基-3-(3’-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐（EDC）、Ν,Ν’-二环己基碳二亚胺（DCC）、Ν,Ν’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯（DSC）。在其他实施例中，含有巯基或硫醇基的IR，可以通过具有能够与巯基（硫醇）基团反应的第二组成部分的双官能交联剂而化学连接到ITM。这样的交联剂包括例如并且如上所述的SPDP、长链SPDP、SIA、MBS、SMCC和本领域中公知的其他交联剂。
有用的连接物组成部分包括天然和非天然两类氨基酸、寡肽例如直链或环状寡肽以及核酸。连接物可以是肽或肽组成部分。连接物可以可任选地包括蛋白水解或非蛋白水解切割位点，例如由于pH变化在所需位点处可以剪切的酯连接。
当在本文中使用时，术语“可酶切割的寡肽”理解为是指包含两个或多个氨基酸（如本文中所定义）的肽，所述氨基酸利用可酶切割的肽键相连。还包括含有假肽或肽模拟物的组成部分。可切割的肽底物的实例可以在美国专利号7,439,319中找到。
当在本文中使用时，术语“氨基酸”理解为是指含有碱性氨基和酸性羧基两者的有机化合物。在该术语中包括天然氨基酸（例如L-氨基酸），修饰的和不常见氨基酸（例如D-氨基酸），以及已知以游离或联合形式在生物中存在但是通常不出现在蛋白质中的氨基酸。天然氨基酸包括但不限于丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、色氨酸、脯氨酸和缬氨酸。其他氨基酸包括但不限于精酰琥珀酸、瓜氨酸、半胱亚磺酸、3,4-二羟基苯丙氨酸、高半胱氨酸、高丝氨酸、鸟氨酸、肉毒碱、硒代半胱氨酸、硒代甲硫氨酸、3-单碘代酪氨酸、3,5-二碘代酪氨酸、3,5,5’-三碘代甲腺原氨酸和3,3’,5,5’-四碘代甲腺原氨酸。
可用于实践本发明的修饰的或不常见氨基酸包括但不限于D-氨基酸、羟基赖氨酸、脱氢丙氨酸、吡咯赖氨酸、2-氨基异丁酸、γ-氨基丁酸、5-羟基色氨酸、S-腺苷甲硫氨酸、S-腺苷高半胱氨酸、4-羟基脯氨酸、N-Cbz-保护的氨基酸、2,4-二氨基丁酸、高精氨酸、正亮氨酸、N-甲基氨基丁酸、萘基丙氨酸、苯甘氨酸、β-苯基脯氨酸、叔亮氨酸、4-氨基环己基丙氨酸、N-甲基-正亮氨酸、3,4-脱氢脯氨酸、Ν,Ν-二甲基氨基甘氨酸、N-甲基氨基甘氨酸、4-氨基哌啶-4-羧酸、6-氨基己酸、反式4-(氨基甲基)-环己烷甲酸、2-、3-和4-(氨基甲基)-苯甲酸、1-氨基环戊烷甲酸、1-氨基环丙烷甲酸和2-苯甲基-5-氨基戊酸。
当在本文中使用时，“假肽”或“肽模拟物”是例如通过使用酰胺连接键之外的连接基团（假肽键）和/或通过使用非氨基酸替代物和/或修饰的氨基酸残基来模拟氨基酸残基或肽的结构的化合物。“假肽残基”是指假肽或肽模拟物的存在于肽中的部分。术语“假肽键”包括可用于代替正常酰胺连接键或作为其替代物的肽键等排物。这些替代物或酰胺“等同”连接键由通常不存在于肽或蛋白中的模拟酰胺键的空间要求并且使分子对酶降解稳定的原子组合形成。在本文中使用下列常规三字母氨基酸缩写：Ala=丙氨酸；Aca=氨基己酸，Ahx=6-氨基己酸，Arg=精氨酸；Asn=天冬酰胺；Asp=天冬氨酸；Cha=环己基丙氨酸；Cit=瓜氨酸；Cys=半胱氨酸；Dap=二氨基丙酸；Gln=谷氨酸；Glu=谷氨酸；Gly=甘氨酸；His=组氨酸；Ile=异亮氨酸；Leu=亮氨酸；Lys=赖氨酸；Met=甲硫氨酸；Nal=萘基丙氨酸；Nle=正亮氨酸；Orn=鸟氨酸；Phe=苯丙氨酸；Phg=苯甘氨酸；Pro=脯氨酸；Sar=肌氨酸；Ser=丝氨酸；Thi=噻吩基丙氨酸；Thr=苏氨酸；Trp=色氨酸；Tyr=酪氨酸；Val=缬氨酸。前缀D-的使用表示所述氨基酸的D-异构体；例如D-赖氨酸表示为D-Lys。
肽可以使用溶液相化学或固相化学或两者的组合来合成（Albericio，Curr.Opinion.Cell Biol.,8,211-221(2004)，M.Bodansky,《肽化学：实用教材》（Peptide Chemistry:A Practical Textbook），Springer-Verlag；N.L.Benoiton，《肽合成化学》（Chemistry of PeptideSynthesis），2005,CRC Press）。
为了制备本发明的药剂，可能需要选择性或正交的胺保护基团。当在本文中使用时，术语“胺保护基团”是指有机合成领域中已知的用于保护胺基的任何基团。这样的胺保护基团包括在Greene，《有机合成中的保护基团》（Protective Groups in Organic Synthesis），JohnWiley&Sons,New York(1981)和《肽：分析、合成、生物学》（ThePeptides:Analysis,Synthesis,Biology），Vol.3,Academic Press,NewYork(1981)中列出的那些。可以使用本领域中已知的任何胺保护基团。胺保护基团的实例包括但不限于下列：1）酰基类型，例如甲酰基、三氟乙酰基、邻苯二甲酰基和对甲苯磺酰基；2）芳香族氨基甲酸酯类型，例如苯甲氧基羰基（Cbz或Z）和取代的苯甲氧基羰基、1-(对联苯基)-1-甲基乙氧基羰基和9-芴基甲氧基羰基（Fmoc）；3）脂族氨基甲酸酯类型，例如叔丁氧基羰基（Boc）、乙氧基羰基、二异丙基甲氧基羰基和烯丙氧基羰基；4）环烷基氨基甲酸酯类型，例如环戊氧基羰基和金刚烷氧基羰基；5）烷基类型，例如三苯基甲基和苯甲基；6）三烷基硅烷，例如三甲基硅烷；以及7）含硫醇类型，例如苯基硫羰基和二硫琥珀酰基。在术语“胺保护基团”中还包括酰基例如叠氮基苯甲酰基、对苯甲酰基苯甲酰基、邻苯甲基苯甲酰基、对乙酰基苯甲酰基、丹酰基,甘氨酰基-对苯甲酰基苯甲酰基、苯基苯甲酰基、间苯甲酰基苯甲酰基、苯甲酰基苯甲酰基。
在某些实施例中，可酶切割的寡肽可以包括寡聚-L-精氨酸、寡聚-L-赖氨酸、寡聚-L-天冬氨酸或寡聚-L-谷氨酸。
可酶切割的寡肽可以被选自下列的至少一种酶切割：水解酶，弹性蛋白酶，组织蛋白酶，基质金属蛋白酶，肽酶，外肽酶，内肽酶，羧肽酶，糖苷酶，脂肪酶，核酸酶，裂解酶，淀粉酶，磷脂酶，磷酸酶，磷酸二酯酶，硫酸酯酶，丝氨酸蛋白酶，枯草杆菌蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，胰蛋白酶，苏氨酸蛋白酶，半胱氨酸蛋白酶，钙蛋白酶，木瓜蛋白酶，半胱天冬酶，天冬氨酸蛋白酶，胃蛋白酶，凝乳酶，谷氨酸蛋白酶，肾素，还原酶，以及寄生虫、病毒和细菌的酶。
化学修饰剂
取决于目标应用，碳酸酐酶靶向剂可以包含一种或多种化学修饰剂（M），其可以改变碳酸酐酶靶向剂的物理、化学或生物性质。具体来说，可以将多个M化学连接到药剂的荧光团组成部分。M在每次出现时可以是相同的，或者可以是不同的。例如，M可能使碳酸酐酶药剂对于生物成像来说更加有用，也就是说例如与未取代或取代较少的荧光团组成部分相比，更易溶于水或者在用于给药的介质中更易分散，具有增加的结合特异性或更少的免疫原性或更少毒性，或具有减少的非特异性结合、改变的生物学分布和药物动力学。
例如，甲氧基聚乙二醇（mPEG）或多肽或多个阴离子性M的合并，可以起到调整碳酸酐酶药剂在体内的药物动力学和血液清除率的作用。其他M可以被选择成加速碳酸酐酶靶向剂从背景组织例如肌肉或肝脏和/或从血液的清除，从而降低背景干扰并提高图像质量。此外，M可用于促成特定排泄路线，例如通过肾脏而不是通过肝脏。M也可以协助将探针配制在药物组合物中，或者可用于改变或保留碳酸酐酶靶向剂的信号报告性质。具体来说，聚乙二醇（PEG）或其衍生物与碳酸酐酶靶向剂的化学连接可以引起更长的血液停留时间（更长的循环）和降低免疫原性。
示例性的修饰剂包括聚乙二醇（PEG）及其衍生物（例如烷氧基聚乙二醇（例如甲氧基聚乙二醇、乙氧基聚乙二醇等））、支链聚丙二醇、聚丙二醇、聚赖氨酸与甲氧基聚乙二醇的接枝共聚物、氨基酸、肽、脂类、脂肪酸、棕榈酸盐、磷脂、磷脂-PEG缀合物、糖类（例如葡聚糖、氨基葡聚糖、羧甲基葡聚糖）、氧化铁纳米粒子、磺酸盐、多磺酸盐、磺基丙氨酸、萘基丙氨酸、苯基丙氨酸和3,3-二苯基丙胺牛磺酸、膦酸盐、磷酸盐、羧酸盐和聚羧酸盐。
在某些实施例中，化学修饰剂M是选自由羧酸盐、膦酸盐、磷酸盐、亚氨基二乙酸盐、磺基丙氨酸或牛磺酸所组成的组的阴离子性组成部分。
在某些实施例中，化学修饰剂M是磺酸盐或多磺酸盐。
在某些实施例中，化学修饰剂M是氢、醇、磺酰胺、亚砜、砜、酮、氨基酸例如谷氨酸或牛磺酸、聚氨基酸例如聚磺基丙氨酸、低聚或聚乙二醇、胺、季铵离子或糖类例如葡萄糖胺、半乳糖胺或甘露糖胺。
在某些实施例中，化学修饰剂M是金属螯合剂例如乙二胺四乙酸（EDTA）、二亚乙基三胺五乙酸（DTPA）或四氮杂环十二烷四乙酸（DOTA）。在本发明的另一方面，一个或多个金属螯合性M基团配位于金属离子。
在某些实施例中，正如上面讨论的，生物修饰剂可以是分子量为例如约0.1kDa至约50kDa、约5kDa至约35kDa或约10kDa至约30kDa的PEG组成部分。或者，PEG可以是dPEG，以例如约1100道尔顿的离散分子量被官能化。
在某些实施例中，PEG是甲氧基PEG(5000)-琥珀酰亚胺基丙酸酯（mPEG-SPA）、甲氧基PEG(5000)-琥珀酰亚胺基琥珀酸酯（mPEG-SS）。这样的PEGS可以从Nektar Therapeutics或SunBiowest或LaysanBio或NOF商购。
PEG组成部分可以通过羧基官能团缀合到碳酸酐酶靶向剂上的反应性胺。或者，可以使用硫醇反应性交联剂，然后与PEG上的硫醇基团反应，将PEG修饰剂缀合到碳酸酐酶靶向剂。
在一种实施例中，PEG可以是分支的或Y形的，正如可以从JenKem USA或NOF获得的，或者是梳形的，或者通过将两个或更多PEGs偶联到小分子例如谷氨酸来合成。
PEG的ω位可以包括羟基或甲氧基，并且PEG也可以在ω位中包含氨基。这样的氨基可以进而偶联于各种药剂。在本发明的另一种实施例中，生物修饰剂可以是聚乙二醇化的聚-L-赖氨酸或聚乙二醇化的聚-D-赖氨酸。
在其他实施例中，生物修饰剂可以是聚乙烯吡咯烷酮（PVP）类型的聚合物。生物修饰剂可以是官能化的聚乙烯吡咯烷酮，例如在聚合物的一个（或两个）末端上（正如可以从Polymersource获得的）或在聚合物链内被官能化的羧基或胺。
或者，生物修饰剂可以包括聚N-(2-羟基丙基)甲基丙烯酰胺（HPMA）或官能化的HPMA（胺、羧基等）、聚(N-异丙基丙烯酰胺)或官能化的聚(N-异丙基丙烯酰胺)。
生物修饰剂可以包括直链或支链酰基，例如戊酰基；酸性基团，例如琥珀酰基；低级烷基，例如甲基、乙基、丙基等；羧基烷基，例如羧乙基；卤代烷基，例如三氟甲基等。
总的来说，M的化学连接对碳酸酐酶靶向剂的亲和性和/或结合性质没有不利影响。
示例性的碳酸酐酶靶向剂和制剂
有用的碳酸酐酶靶向剂，可以使用上文中描述的一种或多种碳酸酐酶结合部分、成像报告物、生物修饰剂和连接物，使用本领域已知的标准化学手段来产生。取决于具体应用，碳酸酐酶靶向剂应该是可溶于水或可在水中分散的（即在水性或生理介质溶液中充分地可溶或可悬浮）。在一种实施例中，碳酸酐酶靶向剂是可溶于水的或者可以在水介质中分散的，并且是生物相容的，即无毒性，例如具有大于约50mg/kg体重的LD50。碳酸酐酶靶向剂优选地不具有任何不想要的光毒性性质和/或表现出低的血清蛋白结合亲和性。
示例性的碳酸酐酶靶向剂的名单提供在表4中。
表4
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Figure BDA0000412045750000701
符号“N/A”表示化学名称不可用。
本文中公开的成像剂可以配制在适合于给药到对象例如动物和/或人类的药物组合物中。药物组合物可以在生理相关载体中包括一种或多种成像剂和一种或多种赋形剂例如稳定剂。
对于体内应用来说，本发明的组合物可以提供在适合于给药到对象例如动物或人类的制剂中。因此，制剂包括药剂连同适合于所需给药形式和/或剂量的生理相关载体。术语“生理相关载体”理解为是指药剂在其中分散、溶解、悬浮、混合，并且在生理上可耐受，即可以给药于对象的身体、身体中或身体上而没有过度不适或刺激或毒性的载体。优选的载体是流体，优选地是液体，更优选地是水溶液；然而，在本发明的范围之内也考虑用于固体制剂、局部制剂、吸入制剂、眼用制剂和透皮制剂的载体。
考虑到了药剂可以口服或肠胃外给药，对于肠胃外给药来说，药剂可以静脉注射、肌肉注射、皮肤给药、经皮给药、皮下注射、直肠给药、经鼻给药、经阴道给药和眼部给药。因此，组合物可以采取例如固体片剂、胶囊、丸剂、粉剂包括冻干粉、胶体悬液、微球体、脂质体颗粒、悬液、乳液、溶液、凝胶包括水凝胶、糊剂、软膏、霜剂、硬膏剂、灌洗溶液、灌服剂、渗透递送装置、栓剂、灌肠剂、注射剂、植入物、喷剂或气溶胶的形式。药物组合物可以按照常规制药实践来配制（参见例如《Remington：药学科学与实践》（Remington:The Scienceand Practice of Pharmacy）第20版，2000，A.R.Germaro主编，LippincottWilliams&Wilkins,Philadelphia和《制药技术百科全书》（Encyclopediaof Pharmaceutical Technology），J.Swarbrick和J.C.Boylan主编，1988-1999,Marcel Dekker,New York）。
应该理解，药剂的制剂、给药方式的选择、给药于对象的药剂剂量以及药剂给药与成像之间的时间安排，都在本领域技术人员的技术范围之内。
应用
应该理解，碳酸酐酶靶向剂可以用于各种成像和治疗性应用。
（a）成像方法
本发明提供了使用本文公开的成像剂进行体外和体内成像的方法。对于光学成像技术的综述来说，参见例如Alfano等，Ann.NY Acad.Sci.820:248-270(1997)；Weissleder,Nature Biotechnology19,316-317(2001)；Ntziachristos等，Eur.Radiol.13:195-208(2003)；Graves等，Curr.Mol.Med.4:419-430(2004)；Citrin等，Expert Rev.Anticancer Ther.4:857-864(2004)；Ntziachristos,Ann.Rev.Biomed.Eng.8:1-33(2006)；Koo等，Cell Oncol.28:127-139(2006)；以及Rao等，Curr.Opin.Biotechnol.18:17-25(2007)。
光学成像包括来自于不使用任何装置的直接可视化和使用诸如各种窥镜、导管和光学成像设备例如用于断层扫描呈现的基于计算机的硬件的所有方法。成像剂可用于光学成像模式和测量技术，其包括但不限于：内窥镜；荧光内窥镜；发光成像；时间分辨透射成像；透射成像；非线性显微技术；共聚焦成像；声学-光学成像；光声成像；反射光谱技术；光谱技术；相干干涉测量法；干涉测量法；光学相干断层成像技术；扩散光学断层成像技术和荧光介导的分子断层成像技术（连续波、时域频域系统和早期光子），以及光散射、吸收、偏振、发光、荧光寿命、量子产率和淬灭的测量。
可用于本发明的实践的成像系统通常包括三个基本组件：（1）用于诱导成像剂的激发的适合光源，（2）将发射与用于荧光团激发的光分离开或分辨开的系统，以及（3）检测系统。检测系统可以是手持的或并入在其他有用的成像装置例如术中显微镜中。示例性的检测系统包括内窥镜、导管、断层扫描系统、手持式成像系统或术中显微镜。
优选地，光源提供单色的（或基本上单色的）光。光源可以是适当过滤过的白光，即来自于宽谱光源的带通光。例如，可以将来自于150瓦卤素灯的光通过可以从Omega Optical（Brattleboro,VT）商购的适合的带通滤光片。取决于系统，光源可以是激光器。参见例如Boas等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:4887-4891,1994；Ntziachristos等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:2767-2772,2000；和Alexander,J.Clin.Laser Med.Surg.9:416-418,1991。关于用于成像的激光器的信息，可以在例如Imaging Diagnostic Systems,Inc.,Plantation,FL和各种其他来源处找到。高通或带通滤光片可用于将光学发射从激发光分离开。适合的高通或带通滤光片可以从Omega Optical,Burlington,VT商购。
总的来说，光检测系统可以视为包括聚光/图像形成组件和光/信号检测/图像记录组件。尽管光检测系统可以是合并有两种组件的单一集成装置，但聚光/图像形成组件和光检测/图像记录组件被分开讨论。
特别有用的聚光/图像形成组件是内窥镜。已用于大量组织和器官包括腹膜（Gahlen等，J.Photochem.Photobiol.B52:131-135,1999）、卵巢癌（Major等，Gynecol.Oncol.66:122-132,1997）、结肠和直肠（Mycek等，Gastrointest.Endosc.48:390-394,1998；和Stepp等，Endoscopy30:379-386,1998）、胆管（Izuishi等，Hepatogastroenterology46:804-807,1999）、胃（Abe等，Endoscopy32:281-286,2000）、膀胱（Kriegmair等，Urol.Int.63:27-31,1999；和Riedl等，J.Endourol.13:755-759,1999）、肺（Hirsch等，Clin Cancer Res7:5-220,2001）、脑（Ward,J.Laser Appl.10:224-228,1998）、食管和头颈部的体内光学成像的内窥装置和技术，可用于本发明的实践中。
其他类型的聚光组件是基于导管的装置，包括光纤装置。这样的装置特别适合于血管内成像。参见例如Tearney等，Science276:2037-2039,1997；和Circulation94:3013,1996。
还有其他成像技术，包括相控阵技术（Boas等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:4887-4891,1994；Chance,Ann.NY Acad.Sci.838:29-45,1998）、光学断层扫描技术（Cheng等，Optics Express3:118-123,1998；和Siegel等，Optics Express4:287-298,1999）、活体显微镜技术（Dellian等，Br.J.Cancer82:1513-1518,2000；Monsky等，Cancer Res.59:4129-4135,1999；和Fukumura等，Cell94:715-725,1998）、共聚焦成像（Korlach等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA96:8461-8466,1999；Rajadhyaksha等，J.Invest.Dermatol.104:946-952,1995；和Gonzalez等，J.Med.30:337-356,1999）以及荧光分子断层扫描技术（FMT）（Nziachristos等，Nature Medicine8:757-760,2002；美国专利号6,615,063，PCT WO03/102558和PCT WO03/079015）可以与本发明的成像剂一起使用。相似地，成像剂可用于各种不同成像系统，例如（1）成像系统：100系列，200系列（Xenogen,Alameda,CA），（2）SPECTRUM和LUMINA（Xenogen,Alameda,CA），（3）
Figure BDA0000412045750000742
或eXplore OptixTM（GE Healthcare,United Kingdom），（4）MaestroTM和NuanceTM-2系统（CRi,Woburn,MA），（5）来自于Carestream Molecular Imaging,Rochester,NY（以前的Kodak Molecular Imaging Systems）的ImageStation In-Vivo FX，（6）OV100，IV100（Olympus Corporation,Japan），（7）Cellvizio（Mauna Kea Technologies,France），（8）NanoSPECT/CT或HiSPECT（Bioscan,Washington,DC），（9）
Figure BDA0000412045750000743
或LILATM（Imaging Diagnostic Systems,Plantation,FL），（10）DYNOTTM（NIRxMedical Technologies,Glen Head,NY），以及（11）由BertholdTechnologies,Germany制造的NightOWL成像系统。
各种光检测/成像记录组件例如电荷耦合元件（CCD）系统或感光胶片，可以用于这样的系统。光检测/图像记录的选择取决于多种因素，包括所使用的聚光/图像形成组件的类型。然而，应该理解，适合的组件的选择、将它们装配到光学成像系统中以及操作所述系统是在本领域的普通技术范围之内的。
对于具有磁性质的药剂来说，本领域公知的MRI成像也可应用于本发明的实践。对于MRI技术的综述，参见Westbrook，《MRI技术手册》（Handbook of MRI Technique）第二版，1999,Blackwell Science。有可能可以将通过例如光学成像和磁共振成像获得的图像共同配准或彼此融合，以提供关于待成像物体的附加信息。此外，多模式成像系统（即组合的光学和MR成像系统）可用于产生联合的光学MR图像。
另外，本发明的组合物和方法可用于其他成像组合物和方法。例如，本发明的药剂可以通过其他成像模式例如X-射线、计算机断层扫描技术（CT）、MR成像、超声、正电子发射断层扫描技术（PET）和单光子计算机断层扫描技术（SPECT）来成像。
另外，本发明的组合物和方法可以与其他成像组合物和方法联合使用。例如，本发明的药剂可以通过光学成像方案单独地或与其他传统成像模式联合地成像，所述其他成像模式例如X-射线、计算机断层扫描技术（CT）、MR成像、超声、正电子发射断层扫描技术（PET）和单光子计算机断层扫描技术（SPECT）。例如，本发明的组合物和方法可以与CT或MRI联合使用，以例如通过与由另一种成像模式产生的图像共同配准，同时获得解剖学和分子信息两者。本发明的组合物和方法也可以使用X-射线、CT、PET、超声、SPECT以及其他光学和MR对比剂联合使用，或者本发明的药剂也可以包括成像剂例如碘、钆原子和放射活性同位素，其可以使用CT、PET、SPECT和MR成像模式与光学成像的联合来检测。成像剂可以连接于或并入到药剂中。
（i）体内成像方法
对于体内光学成像来说，这样的方法包括（a）将一种或多种本文描述的碳酸酐酶靶向剂给药于对象，（b）提供足够时间以使药剂在对象内分布，以及（c）检测由碳酸酐酶靶向剂发出的信号。由药剂发出的信号可用于构建图像，例如断层扫描图像。上述步骤可以以预定时间间隔重复，从而允许在对象体内随时间评估碳酸酐酶靶向剂的发射信号。
在另一种体内成像方法中，所述方法包括（a）将一种或多种本文描述的含有荧光染料的碳酸酐酶靶向剂给药于对象；（b）提供足够时间以使碳酸酐酶靶向剂在对象内分布；（c）将对象暴露于可以由荧光染料吸收的波长的光；以及（d）检测由碳酸酐酶靶向剂发出的信号。上述步骤可以以预定的时间间隔重复，从而允许在对象体内随时间评估碳酸酐酶靶向剂的发射信号。照射和/或检测步骤（分别步骤（c）和（d））可以使用内窥镜、导管、断层扫描系统、平面系统、手持式成像系统、护目镜或术中显微镜来进行。
在这些步骤之前或期间，检测系统可以位于对象（例如动物或人类）周围或附近，以检测从对象发出的信号。可以处理发射的信号以构建图像，例如断层扫描图像。另外，处理过的信号可以显示为单独的图像或融合（联合）的图像。
另外，能够同时实践一种体内成像方法，该方法选择性地检测并成像一种、两种或更多种包括碳酸酐酶靶向剂的分子成像探针。在这样的方法中，例如，在上面提到的步骤（a）中，将信号性质可以彼此区分开的两种或更多种成像探针同时或相继地给药于对象，其中至少一种分子成像探针是碳酸酐酶药剂。多种探针的使用允许记录多个生物过程、功能或靶。
对象可以是脊椎动物，例如哺乳动物，例如人类。对象也可以是用于实验室研究的非脊椎动物（例如秀丽隐杆线虫、果蝇或其他研究用模式生物等）。
由这样的体内成像方法提供的信息，例如发射信号的存在、不存在或水平，可用于在对象体内检测和/或监测疾病。示例性疾病包括但不限于自体免疫疾病、骨病、癌症、心血管疾病、环境疾病、皮肤病、免疫疾病、遗传病、传染病、代谢病、神经退行性疾病、眼科疾病和呼吸道疾病。另外，体内成像可用于通过使用成像剂来评估化合物或疗法的效果，其中在用化合物或疗法治疗之前和之后为对象进行成像，并比较相应的信号/图像。
碳酸酐酶靶向剂还可用于将用碳酸酐酶靶向剂标记的细胞给药于受试者的体内成像方法。细胞可以用碳酸酐酶靶向剂在体内或离体标记。在离体方法中，细胞可以直接源自于对象或源自于其他来源（例如来自于其他对象、细胞培养物等）。可以将碳酸酐酶靶向剂与细胞混合以有效地标记细胞，并将得到的标记细胞在步骤（a）中给药于对象。然后如上所述进行步骤（b）-（d）。这种方法可用于监测某些细胞类型包括T-细胞、肿瘤细胞、免疫细胞和干细胞以及其他细胞类型的运输和定位。特别是，这种方法可用于监测基于细胞的疗法。
应该理解，碳酸酐酶靶向剂的配制、给药方式的选择、给药于对象的碳酸酐酶靶向剂的剂量以及碳酸酐酶靶向剂给药与成像之间的时间安排是在本领域技术人员的技术水平范围之内的。
上述方法可用于确定多种标记，包括在对象体内随时间追踪碳酸酐酶靶向剂的定位，或者在对象体内随时间评估碳酸酐酶靶向剂的代谢和/或排泄的变化或改变。通过对用于这样的疾病的疗法所调节的分子事件和生物通路进行成像，所述方法还可用于跟踪这样的疗法，包括但不限于确定疗效、最适时间安排、最适剂量水平（包括对于个体患者或试验对象）以及疗法联合的协同效果。
本发明的方法和组合物可用于帮助医生或外科医生识别和表征疾病区域，例如癌症和特别是缺氧肿瘤或其他缺氧组织，以将患病和/或缺氧组织与正常组织区分开，例如检测肿瘤或其他组织内使用常规成像技术难以检测的特定组织缺氧区域，并对所述组织作为特定治疗方式的候选者进行进一步评估，或评估预后例如转移的可能性。
本发明的方法和组合物也可用于疾病的检测、定性和/或位置确定，包括早期疾病、疾病或疾病相关病症的严重性、疾病的阶段和/或监测疾病。发射信号的存在、不存在或水平可以指示疾病状态。
本发明的方法和组合物也可用于监测和/或指导各种治疗性干预例如手术程序，以及监测药物疗法，包括基于细胞的疗法。本文描述的方法也可用于评估各种治疗方式的疗效，所述治疗方式包括但不限于设计用于降低肿瘤酸中毒和转移或各种放射疗法。本发明的方法还可用于疾病或疾病病症的预后。
对于上述每种情况来说，可以检测或监测（在疗法之前、期间或之后）的这样的疾病或疾病病症的实例包括炎症（例如由关节炎例如类风湿关节炎引起的炎症），癌症（例如结肠直肠、卵巢、肺、乳腺、前列腺、宫颈、睾丸、皮肤、脑、胃肠、胰腺、肝、肾、膀胱、胃、白血病、口、食管和骨癌），心血管疾病（例如动脉粥样硬化和血管的炎性病症、局部缺血、中风、血栓症和弥散性血管内凝血）、皮肤病（例如卡波西氏肉瘤、银屑病和过敏性皮炎）、眼科疾病（例如黄斑部变性和糖尿病性视网膜病）、传染病（例如细菌、病毒、真菌和寄生虫感染，包括获得性免疫缺陷综合征、疟疾、锥虫病和血吸虫病）、免疫疾病（例如自体免疫障碍、淋巴瘤、多发性硬化症、类风湿性关节炎、糖尿病、红斑狼疮、重症肌无力和格雷夫斯病）、中枢神经系统疾病（例如神经退行性疾病如帕金森氏病或阿兹海默氏病、亨廷顿舞蹈症、肌萎缩侧索硬化和朊病毒疾病）、遗传病、代谢病、环境疾病（例如铅、汞和放射活性物质中毒，以及皮肤癌）、骨相关疾病（例如骨质疏松症、原发和转移骨肿瘤和骨关节炎）、神经退行性疾病和手术相关并发症（例如移植物排斥、器官排斥、创伤愈合改变、纤维化或与外科植入物相关的其他并发症）。
因此，本文中描述的方法和组合物可用于例如检测和/或定量在对象例如人类、例如肿瘤细胞内碳酸酐酶的存在和/或定位，以及检测和/或定量缺氧组织的存在和/或定位，包括肿瘤内缺氧区域的存在。本文描述的方法和组合物还可用于检测和/或定量与疾病、障碍和病症、包括但不限于肿瘤前/肿瘤疾病相关的碳酸酐酶IX，包括在冠状和外周动脉中处于急性阻塞风险（即易损斑块）的区域、动脉瘤扩大的区域、颈动脉中的不稳定斑块和局部缺血区域。本发明的方法和组合物还可用于细胞死亡、损伤、凋亡、坏死和组织缺氧的鉴定和评估。所述方法和组合物还可用于药物释放和监测药物释放，特别是当药物或类药分子化学连接到荧光探针时。示例性的药物分子包括化学治疗剂和细胞生长抑制剂以及光动力药剂，包括但不限于Photofrin、Lutrin、Antrin、氨基乙酰丙酸、金丝桃素、苯并卟啉衍生物和卟啉类。
另外，本文描述的方法可用于成像对象体内的组织缺氧（缺氧）。所述方法包括给药于对象（例如人类或动物）足以促进组织缺氧成像的量的一种或多种本文描述的碳酸酐酶靶向剂。在经过足够时间以允许药剂在动物体内分布或在待成像区域内分布后，确定药剂的存在和/或量。然后可以使用药剂的存在和/或量来产生表示对象组织内的氧耗竭的图像，例如断层扫描图像。
（ii）体外成像方法
对于体外成像来说，成像剂可用于各种体外测定法中。例如，示例性的体外成像方法包括：（a）将样品例如生物样品与一种或多种本文描述的碳酸酐酶靶向剂相接触；（b）使药剂与样品中的生物靶相互作用；（c）可任选地，移除未结合的药剂；以及（d）检测从药剂发出的信号，从而确定药剂是否已被生物靶激活或结合于生物靶。当碳酸酐酶靶向剂包含荧光染料时，步骤（d）还包括用可以由荧光染料吸收的波长的光照射样品，以产生发射信号。
在药剂已被设计、合成并可任选地配制后，可以由本领域技术人员在体外对其进行测试，以评估它的生物学和性能特征。例如，可以使用在培养基中生长的不同类型的细胞来评估药剂的生物学和性能特征。药剂的细胞摄入、结合或细胞定位，可以使用本领域中已知的技术包括例如荧光显微技术、FACS分析、免疫组织化学、免疫沉淀、原位杂交和Forster共振能量转移（FRET）或荧光共振能量转移进行评估。例如，可以将药剂与样品接触一段时间，然后清洗以除去任何游离的药剂。然后可以使用适合的检测装置，例如装备有与荧光药剂的光学性质匹配的适合的滤光片的荧光显微镜来观察样品。培养中的细胞的荧光显微技术或闪烁计数也是用于确定是否发生摄入和结合的常规手段。组织、组织切片和其他类型的样品例如细胞离心涂片样品也可以以类似方式，用于评估药剂的生物学和性能特征。也可以使用其他检测方法，包括但不限于流式细胞术、免疫测定法、杂交测定法和微阵列分析。
（b）治疗性应用
本文描述的某些碳酸酐酶靶向剂例如含有放射性标记物和药物分子的药剂，可用于改善特定疾病或障碍的症状或治疗特定疾病或障碍。所述方法包括（a）给药足以在对象体内提供疗效的量的一种或多种本文描述的药剂；以及（b）提供足够时间以允许药剂在对象体内分布或以其他方式定位在待治疗的对象区域中，然后（c）取决于治疗剂，可任选地激活药剂以提供疗效。例如，当治疗剂是放射性标记物时，不需随后的激活。然而，当治疗剂是光反应性药剂例如在光动力疗法中使用的染料时，可以通过将药剂暴露于具有激活药剂的波长的光来激活药剂。结果，药剂可用于治疗目标病症，例如癌症、免疫障碍、炎性障碍、血管障碍等。此外，药剂可用于抑制对象体内缺氧肿瘤或其他目标区域中的酸中毒，或者降低缺氧区域的肿瘤细胞增殖。
现在将利用下面的实施例来说明本发明，提供所述实施例的目的仅仅是示例性的，并且没有任何限制本发明范围的意图。
实施例
本发明的化合物可以按照标准方法和程序，从容易获得的起始材料合成。下面的非限制性实例演示了示例性荧光碳酸酐酶药剂的合成。可用于制备本发明的材料的代表性材料和方法在下面进一步描述。除非另有陈述，否则所有化学品和溶剂（试剂级）以其商购时的状态使用，没有进一步纯化。合成的化合物在2695系统上通过HPLC进行表征，使用Phenomenex苯基-己基柱（3μ,100x4.6mm）或C18柱（5μ,250x4.6mm）以0.5至1.0mL/分钟的流速。使用A（25mM甲酸铵+5%甲醇）和B（乙腈）的线性梯度。梯度通常开始于0-20%的B，并随着10至20分钟的时间改变到25-90%的B。使用2998二极管阵列检测器和ZQ2000MS质量检测器监测层析图。制备型HPLC在Varian系统上，使用Phenomenex C18柱（250x21mm）以20mL/分钟进行，使用与分析型运行相似的梯度。
实施例1：示例性化合物3-(2-((1E,3E,5E)-5-(1,1-二甲基-6,8-二磺基-3-(3-磺基丙基)-1H-苯并[e]吲哚-2(3H)-亚基)戊-1,3-二烯-1-基)-1,1-二甲基-6-(N-甲基-N-(4-氧基-4-((4-氨磺酰基苯甲基)氨基)丁基)氨磺酰基)-1H-苯并[e]吲哚-3-鎓-3-基)丙烷-1-磺酸盐[B1]的合成：
在密封小管中，将4-氨基甲基苯磺酰胺（2.7mg，12μmol）和荧光染料F1的琥珀酰亚胺酯（10μmol）和5.5μL N-甲基吗啉（50μmol）合并在130μL无水DMF中，并在25℃下旋转1小时。通过加入1.5mL乙酸乙酯沉淀粗产品，离心，倾析并在真空下干燥。将产物通过HPLC进行纯化并通过LCMS确认质量，对[M+H]+的计算值为1206.2，实测值为1206.2。
实施例2：示例性化合物3-乙基-2-((1E,3Z,5E)-5-(3-乙基-1,1-二甲基-6,8-二磺基-1H-苯并[e]吲哚-2(3H)-亚基)-3-(5-((4-氨磺酰基苯甲基)氨甲酰基)吡啶-2-基)戊-1,3-二烯-1-基)-1,1-二甲基-8-磺基-1H-苯并[e]吲哚-3-鎓-6-磺酸盐[B6]的合成：
在密封小管中，将4-氨基甲基苯磺酰胺（3.2mg，14μmol）、荧光染料F6的琥珀酰亚胺酯（12μmol）、6.5μL N-甲基吗啉（60μmol）、二甲基氨基丙基乙基碳二亚胺（2.0mg，10.5μmol）和羟基苯并三唑（2.0mg，15μmol）合并在150μL无水DMF中，并在25℃下旋转3小时。通过加入1.5mL乙酸乙酯沉淀粗产品，离心，倾析并在真空下干燥。将产物通过HPLC进行纯化并通过LCMS确认质量，对[M+H]+的计算值为1120.3，实测值为1120.3。
实施例3：示例性化合物2-((1E,3Z,5E)-5-(1,1-二甲基-6,8-二磺基-3-(3-磺基丙基)-1H-苯并[e]吲哚-2(3H)-亚基)-3-(5-((4-氨磺酰基苯甲基)氨甲酰基)吡啶-2-基)戊-1,3-二烯-1-基)-1,1-二甲基-8-磺基-3-(3-磺基丙基)-1H-苯并[e]吲哚-3-鎓-6-磺酸盐[B5]的合成：
Figure BDA0000412045750000822
在密封小管中，将4-氨基甲基苯磺酰胺（3.5mg，16μmol）、荧光染料F5的琥珀酰亚胺酯（13μmol）和7.2μL N-甲基吗啉（65μmol）合并在110μL无水DMF中，并在25℃下旋转1小时。通过加入1.5mL乙酸乙酯沉淀粗产品，离心，倾析并在真空下干燥。将产物通过HPLC进行纯化并通过LCMS确认质量，对[M+H]+的计算值为1308.1，实测值为1308.3。
实施例4：示例性化合物3-(2-((1E,3Z,5E)-5-(1,1-二甲基-6,8-二磺基-3-(3-磺基丙基)-1H-苯并[e]吲哚-2(3H)-亚基)-3-(5-((6-氧基-6-((4-氨磺酰基苯甲基)氨基)己基)氨甲酰基)吡啶-2-基)戊-1,3-二烯-1-基)-1,1-二甲基-6,8-二磺基-1H-苯并[e]吲哚-3-鎓-3-基)丙烷-1-磺酸盐[B3]的合成：
Figure BDA0000412045750000831
在密封小管中，将4-氨基甲基苯磺酰胺（3.0mg，13μmol）、荧光染料F3的琥珀酰亚胺酯（13μmol）和6.2μL N-甲基吗啉（55μmol）合并在105μL无水DMF中，并在25℃下旋转1小时。通过加入1.5mL乙酸乙酯沉淀粗产品，离心，倾析并在真空下干燥。将产物通过HPLC进行纯化并通过LCMS确认质量，对[M+2H]2+的计算值为711.1，实测值为711.5。
实施例5：示例性化合物3-(2-((1E,3Z,5E)-5-(1,1-二甲基-6,8-二磺基-3-(3-磺基丙基)-1H-苯并[e]吲哚-2(3H)-亚基)-3-(5-((3-氧基-1-(4-氨磺酰基苯基)-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75-二十四氧杂-2-氮杂七十七烷-77-基)氨甲酰基)吡啶-2-基)戊-1,3-二烯-1-基)-1,1-二甲基-6,8-二磺基-1H-苯并[e]吲哚-3-鎓-3-基)丙烷-1-磺酸盐[B12]的合成：
Figure BDA0000412045750000841
在密封小管中，将4-氨基甲基苯磺酰胺（3.0mg，13μmol）、荧光染料F12（n=24）的琥珀酰亚胺酯（11μmol）和6.2μL N-甲基吗啉（55μmol）合并在105μL无水DMF中，并在25℃下旋转1小时。通过加入1.5mL乙酸乙酯沉淀粗产品，离心，倾析并在真空下干燥。将产物通过HPLC进行纯化并通过LCMS确认质量，对[M+2H+3NH3]2+的计算值为1244.4，实测值为1244.5。
实施例6：示例性化合物2-((1E,3Z,5E)-5-(1,1-二甲基-6,8-二磺基-3-(3-磺基丙基)-1H-苯并[e]吲哚-2(3H)-亚基)-3-(5-((4-氨磺酰基苯甲基)氨甲酰基)吡啶-2-基)戊-1,3-二烯-1-基)-1,1-二甲基-8-磺基-3-(3-磺基丙基)-1H-苯并[e]吲哚-3-鎓-6-磺酸盐[C5]的合成：
Figure BDA0000412045750000842
在密封小管中，将4-氨基甲基苯磺酰胺（3.7mg，16μmol）、荧光染料F5的琥珀酰亚胺酯（13μmol）和7.2μL N-甲基吗啉（65μmol）合并在110μL无水DMF中，并在25℃下旋转1小时。通过加入1.5mL乙酸乙酯沉淀粗产品，离心，倾析并在真空下干燥。将产物通过HPLC进行纯化并通过LCMS确认质量。
实施例7：中间体化合物4-(氨基甲基)-N-(5-氨磺酰基-1,3,4-噻二唑-2-基)苯甲酰胺[A0]的合成：
Figure BDA0000412045750000851
部分A：将乙酰唑胺（1g，4.5μmol）溶解在10mL甲醇和1.5mL浓盐酸中并回流4h。将溶液冷却至0℃，并通过添加0.5mL pH7.0的1M HEPES缓冲液，然后加入1M NaOH直至pH为7进行中和。在真空下除去甲醇，然后冷却至4℃，并使纯的5-氨基-1,3,4-噻二唑-2-磺酰胺从溶液结晶出来。
部分B：在密封反应管中，将5-氨基-1,3,4-噻二唑-2-磺酰胺（100mg，560μmol）、N-BOC-4-氨基甲基苯甲酸（140mg，560μmol）、二甲基氨基丙基乙基碳二亚胺（117mg，610μmol）和羟基苯并三唑（84mg，610μmol）合并在600μL无水DMF中，并在室温下旋转48h。将粗品溶液用1mL水稀释，引起产物沉淀，然后缓慢添加1M NaOH直至pH达到8.5（～1.5mL），产生透明溶液。将溶液通过制备HPLC纯化，并将纯化的产物在600μL95%TFA/水中去保护15分钟，然后在真空下干燥，得到150mg（85%）4-(氨基甲基)-N-(5-氨磺酰基-1,3,4-噻二唑-2-基)苯甲酰胺A0。
实施例8：示例性化合物3-(2-((1E,3E,5E)-5-(1,1-二甲基-6,8-二磺基-3-(3-磺基丙基)-1H-苯并[e]吲哚-2(3H)-亚基)戊-1,3-二烯-1-基)-1,1-二甲基-6-(N-甲基-N-(4-氧基-4-((4-((5-氨磺酰基-1,3,4-噻二唑-2-基)氨甲酰基)苯甲基)氨基)丁基)氨磺酰基)-1H-苯并[e]吲哚-3-鎓-3-基)丙烷-1-磺酸盐[A1]的合成：
Figure BDA0000412045750000861
在密封小管中，将4-(氨基甲基)-N-(5-氨磺酰基-1,3,4-噻二唑-2-基)苯甲酰胺（5mg，16μmol）、荧光染料F1的琥珀酰亚胺酯（16μmol）和N-甲基吗啉（10μL）合并在100μL无水DMF中，并在37℃下旋转1小时。通过加入1.5mL乙酸乙酯沉淀粗产品，离心，倾析并在真空下干燥。将产物通过HPLC进行纯化并通过LCMS确认质量，对[M+H]+的计算值为1333.2，实测值为1333.1。
实施例9：示例性化合物3-(2-((1E,3Z,5E)-5-(1,1-二甲基-6,8-二磺基-3-(3-磺基丙基)-1H-苯并[e]吲哚-2(3H)-亚基)-3-(5-((4-((5-氨磺酰基-1,3,4-噻二唑-2-基)氨甲酰基)苯甲基)氨甲酰基)吡啶-2-基)戊-1,3-二烯-1-基)-1,1-二甲基-6,8-二磺基-1H-苯并[e]吲哚-3-鎓-3-基)丙烷-1-磺酸盐[A5]的合成：
Figure BDA0000412045750000862
在密封小管中，将4-(氨基甲基)-N-(5-氨磺酰基-1,3,4-噻二唑-2-基)苯甲酰胺（5mg，16μmol）、荧光染料F5的琥珀酰亚胺酯（16μmol）和N-甲基吗啉（10μL）合并在100μL无水DMF中，并在37℃下旋转1小时。通过加入1.5mL乙酸乙酯沉淀粗产品，离心，倾析并在真空下干燥。将产物通过HPLC进行纯化并通过LCMS确认质量，对[M+H]+的计算值为1435.1，实测值为1435.1。
实施例10：示例性化合物3-乙基-2-((1E,3Z,5E)-5-(3-乙基-1,1-二甲基-6,8-二磺基-1H-苯并[e]吲哚-2(3H)-亚基)-3-(5-((4-((5-氨磺酰基-1,3,4-噻二唑-2-基)氨甲酰基)苯甲基)氨甲酰基)吡啶-2-基)戊-1,3-二烯-1-基)-1,1-二甲基-8-磺基-1H-苯并[e]吲哚-3-鎓-6-磺酸盐[A6]的合成：
Figure BDA0000412045750000871
在密封小管中，将4-(氨基甲基)-N-(5-氨磺酰基-1,3,4-噻二唑-2-基)苯甲酰胺（5mg，16μmol）、荧光染料F6的琥珀酰亚胺酯（16μmol）和N-甲基吗啉（10μL）合并在100μL无水DMF中，并在37℃下旋转1小时。通过加入1.5mL乙酸乙酯沉淀粗产品，离心，倾析并在真空下干燥。将产物通过HPLC进行纯化并通过LCMS确认质量，对[M+H]+的计算值为1247.2，实测值为1247.3。
实施例11：示例性化合物3-(2-((1E,3Z,5E)-5-(1,1-二甲基-6,8-二磺基-3-(3-磺基丙基)-1H-苯并[e]吲哚-2(3H)-亚基)-3-(5-((6-氧基-6-((4-((5-氨磺酰基-1,3,4-噻二唑-2-基)氨甲酰基)苯甲基)氨基)己基)氨甲酰基)吡啶-2-基)戊-1,3-二烯-1-基)-1,1-二甲基-6,8-二磺基-1H-苯并[e]吲哚-3-鎓-3-基)丙烷-1-磺酸盐[A3]的合成：
Figure BDA0000412045750000872
在密封小管中，将4-(氨基甲基)-N-(5-氨磺酰基-1,3,4-噻二唑-2-基)苯甲酰胺（5mg，16μmol）、荧光染料F3的琥珀酰亚胺酯（16μmol）和N-甲基吗啉（10μL）合并在100μL无水DMF中，并在37℃下旋转1小时。通过加入1.5mL乙酸乙酯沉淀粗产品，离心，倾析并在真空下干燥。将产物通过HPLC进行纯化并通过LCMS确认质量，对[M+2H]2+的计算值为774.6，实测值为775.0。
实施例12：示例性化合物3-(2-((1E,3Z,5E)-5-(1,1-二甲基-6,8-二磺基-3-(3-磺基丙基)-1H-苯并[e]吲哚-2(3H)-亚基)-3-(5-((3-氧基-1-(4-((5-氨磺酰基-1,3,4-噻二唑-2-基)氨甲酰基)苯基)-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75-二十四氧杂-2-氮杂七十七烷-77-基)氨甲酰基)吡啶-2-基)戊-1,3-二烯-1-基)-1,1-二甲基-6,8-二磺基-1H-苯并[e]吲哚-3-鎓-3-基)丙烷-1-磺酸盐[A12]的合成：
在密封小管中，将4-(氨基甲基)-N-(5-氨磺酰基-1,3,4-噻二唑-2-基)苯甲酰胺（5mg，16μmol）、荧光染料F12（n=24）的琥珀酰亚胺酯（16μmol）和N-甲基吗啉（10μL）合并在100μL无水DMF中，并在37℃下旋转1小时。通过加入1.5mL乙酸乙酯沉淀粗产品，离心，倾析并在真空下干燥。将产物通过HPLC进行纯化并通过LCMS确认质量，对[M+3H]3+的计算值为854.9，实测值为855.4。
实施例13：中间体化合物3-氨基-N-(5-氨磺酰基-1,3,4-噻二唑-2-基)丙酰胺[C0]的合成：
Figure BDA0000412045750000891
部分A：将乙酰唑胺（1g，4.5μmol）溶解在10mL甲醇和1.5mL浓盐酸中并回流4h。将溶液冷却至0℃，并通过添加0.5mL pH7.0的1M HEPES缓冲液，然后加入1M NaOH直至pH为7进行中和。在真空下除去甲醇，然后冷却至4℃，并使纯的5-氨基-1,3,4-噻二唑-2-磺酰胺从溶液结晶出来。
部分B：在密封反应管中，将5-氨基-1,3,4-噻二唑-2-磺酰胺（20mg，110μmol）、N-FMOC-β-丙氨酸（31mg，100μmol）、二甲基氨基丙基乙基碳二亚胺（EDC）（21mg，110μmol）和羟基苯并三唑（HOBT）（15mg，110μmol）合并在200μL无水DMF中，并在室温下旋转48h。将粗产品通过制备HPLC纯化，然后通过在125μL含20%二乙胺的DMF中溶解10分钟进行去保护，然后用醚沉淀，给出作为白色固体的3-氨基-N-(5-氨磺酰基-1,3,4-噻二唑-2-基)丙酰胺。
实施例14：示例性化合物3-(2-((1E,3Z,5E)-5-(1,1-二甲基-6,8-二磺基-3-(3-磺基丙基)-1H-苯并[e]吲哚-2(3H)-亚基)-3-(5-((3-氧基-3-((5-氨磺酰基-1,3,4-噻二唑-2-基)氨基)丙基)氨甲酰基)吡啶-2-基)戊-1,3-二烯-1-基)-1,1-二甲基-6,8-二磺基-1H-苯并[e]吲哚-3-鎓-3-基)丙烷-1-磺酸盐[C5]的合成
Figure BDA0000412045750000901
在密封反应管中，将3-氨基-N-(5-氨磺酰基-1,3,4-噻二唑-2-基)丙酰胺（5mg，20μmol）与荧光染料F5的琥珀酰亚胺酯（15μmol）和10μL N-甲基吗啉合并在200μL无水DMF中，并在37℃下旋转2h。通过加入1.5mL乙酸乙酯沉淀粗产品，然后通过制备HPLC进行纯化并通过LCMS确认质量，对[M+H]+的计算值为1373.1，实测值为1373.2。
实施例15：示例性化合物3-(5-(双(2-磺基乙基)氨甲酰基)-2-((1E,3Z,5E)-5-(5-(双(2-磺基乙基)氨甲酰基)-3,3-二甲基-1-(3-磺基丙基)二氢吲哚-2-亚基)-3-(5-((3-氧基-3-((5-氨磺酰基-1,3,4-噻二唑-2-基)氨基)丙基)氨甲酰基)吡啶-2-基)戊-1,3-二烯-1-基)-3,3-二甲基-3H-吲哚-1-鎓-1-基)丙烷-1-磺酸盐[C11]的合成：
Figure BDA0000412045750000902
在密封反应管中，将3-氨基-N-(5-氨磺酰基-1,3,4-噻二唑-2-基)丙酰胺（5mg，20μmol）与荧光染料F11的琥珀酰亚胺酯（15μmol）和10μL N-甲基吗啉合并在200μL无水DMF中，并在37℃下旋转2h。通过加入1.5mL乙酸乙酯沉淀粗产品，然后通过制备HPLC进行纯化并通过LCMS确认质量。
实施例16：非结合性对照化合物3-(2-((1E,3Z,5E)-3-(5-((6-(苯甲基氨基)-6-氧基己基)氨甲酰基)吡啶-2-基)-5-(1,1-二甲基-6,8-二磺基-3-(3-磺基丙基)-1H-苯并[e]吲哚-2(3H)-亚基)戊-1,3-二烯-1-基)-1,1-二甲基-6,8-二磺基-1H-苯并[e]吲哚-3-鎓-3-基)丙烷-1-磺酸盐[D3]的合成：
Figure BDA0000412045750000911
在密封小管中将苯甲胺（1.4mg，13μmol）、荧光染料F3的琥珀酰亚胺酯（11μmol）和6.2μL N-甲基吗啉(55μmol）合并在105μL无水DMF中，并在25℃下旋转1小时。通过加入1.5mL乙酸乙酯沉淀粗产品，离心，倾析并在真空下干燥。将产物通过HPLC进行纯化并通过LCMS确认质量，对[M+H]+的计算值为1342.2，实测值为1342.1。
实施例17：使用CA药剂的体内肿瘤成像
本实施例示出本发明的化合物可用于在体内成像肿瘤。在本实验中，对6-8周龄的NU/NU小鼠（Charles River Laboratory,Wilmington,MA），在每个乳腺脂肪垫中双侧皮下（s.c.）注射约2x106个HeLa细胞。当肿瘤达到3x3mm的近似尺寸时，用在100μL体积中的2nmol碳酸酐酶药剂C5或非结合性对照药剂D3（5只小鼠/探针+作为对照的2只小鼠/无探针）通过尾静脉对小鼠进行静脉内（i.v.）注射。在注射后24hr，使用可商购的荧光分子断层扫描系统（VisEn Medical,Bedford,MA）进行成像。使用的图像的实例示出在图1中，其示出使用药剂C5的肿瘤可以通过平面反射（1A）成像和断层扫描（1B）两者在体内有效地成像，而非结合性对照药剂D3通过任一种成像方式都显示出很少或没有肿瘤信号。
实施例18：在体外CA药剂对碳酸酐酶的亲和性
本实施例示出本发明的化合物在体外对碳酸酐酶具有高亲和性，并且对碳酸酐酶IX的选择性超过CA II、CA XII和CA XIV。还示出对照化合物D3对碳酸酐酶不具有高亲和性。在这个实验中，通过在各种浓度的CA药剂存在下，通过停流法用分光光度法测量CA的CO2水合速率，来确定Ki值。结果概述在表5中。
表5
表5示出了每个实验的Ki值，其证实了CA药剂对碳酸酐酶IX表现出比对CA II、CA XII和CA XIV更强的亲和性，而对于对照化合物D3来说没有检测到特异性结合。
实施例19：CA药剂与HeLa细胞的碳酸酐酶依赖性结合
本实施例示出了本文描述的碳酸酐酶药剂对CA IX的亲和性。使用在正常和缺氧（1%O2）两种条件下培养的HeLa细胞，进行了细胞结合测定。将HeLa细胞（28,000个细胞/cm2）在含氧量正常（空气）或缺氧（1%O2）条件下在6孔培养板中培养24h。作为阳性对照，在一个孔中与荧光抗CA IX Ab（R&D systems）进行培养，然后在37℃下培养1h。向各个孔添加碳酸酐酶药剂A5和A3（1μΜ）或非结合性对照药剂D3，然后培养30分钟。将细胞用PBS漂洗3次，然后用2mLPBS刮下，转移至5mL试管，并且然后以1000rpm离心10分钟以弃去PBS。然后将细胞重悬浮在400μL PBS中，并通过荧光显微技术和流式细胞术分析。对于荧光显微技术来说，将核与DAPI共染色。对于竞争研究来说，在与药剂培养之前，将细胞与乙酰唑胺（Az）（100μΜ）培养2小时。
图2示出化合物A5和A3结合于缺氧细胞但不是含氧量正常的细胞表面上的CA IX受体，并且结合可以用过量CA抑制剂乙酰唑胺阻断。图2还示出商品化荧光CA IX抗体仅结合于缺氧HeLa细胞，证实了CA IX在这些细胞中的上调和表达，并且非结合性对照药剂D3不结合于含氧量正常的或缺氧的细胞。这些结果证实，化合物A5和A3以碳酸酐酶依赖的方式结合于缺氧细胞。图3示出了流式细胞术结果，其证实了CA药剂A5和A3而不是非结合性对照化合物D3与缺氧细胞的结合增加，以及乙酰唑胺对信号的阻断。
实施例20：I.V.给药的化合物C5在小鼠中的生物学分布
本实施例示出了化合物C5在i.v.注射后24h在HeLa荷瘤小鼠中的生物学分布。
对6-8周龄的雌性NU/NU小鼠（Charles River Laboratory,Wilmington,MA），在第一乳腺脂肪垫中使用HeLa细胞（5x106）进行皮下（s.c.）注射。在肿瘤达到所需体积时（使用游标卡尺测量，使用公式：体积mm3=(长度x宽度2)/2），用化合物C5（2nmol）或非结合性对照D3对小鼠进行i.v.注射。24hr后，通过二氧化碳窒息处死小鼠，并取出某些组织，用盐水漂洗，用吸水纸吸干，并在VisEn FMT2500上使用反射模式成像。使用FMT软件在每个器官周围画出目标区域（ROI），确定每个器官的平均荧光（报告为计数/能量），并将肿瘤中的平均荧光取为100%进行归一化。结果概述在图4中，其示出CA成像剂C5荧光在大多数组织中非常低，而在肿瘤中存在高浓度，在肾脏中积累较低浓度，而非结合性对照D3只在肾脏中示出荧光积累。
实施例21：在HeLa荷瘤小鼠中碳酸酐酶抑制剂乙酰唑胺处理对碳酸酐酶信号的影响
本实施例证实了在HeLa荷瘤小鼠中碳酸酐酶抑制剂处理对碳酸酐酶的影响。
在肿瘤达到所需体积之后，将HeLa荷瘤小鼠随机分组，并使用或未使用C5（2nmol）进行i.v.注射。对于竞争研究来说，将小鼠用乙酰唑胺（10mg/kg）注射，在60分钟后用化合物C5（2nmol）注射。在给予药剂后24小时，使用FMT2500进行成像。如图5A中所示，乙酰唑胺处理的小鼠与未处理动物相比，具有较低的示例性药剂C5的信号。
如图5B中所示，CA药剂C5示出在体内显著积累在肿瘤中（通过FMT定量为116pmol），而乙酰唑胺处理过的动物具有减小约66%的信号（通过FMT定量为39pmol），证实了本文描述的CA成像剂的体内肿瘤信号的碳酸酐酶特异性。
实施例22：在HeLa荷瘤小鼠中使用荧光碳酸酐酶结合性化合物检测组织缺氧的体内诱导
从Harlan Laboratory,Indianapolis,IN获得的雌性nu/nu小鼠在4-5周龄时，在乳腺脂肪垫中用HeLa细胞（1.5x106个细胞/位点）皮下（s.c.）注射。在肿瘤达到600-700mm3的所需体积时（使用游标卡尺测量，使用公式：体积mm3=长度x宽度2/2），将小鼠随机分组（n=4-5只小鼠/组），其中一些在监测氧水平的仓室中暴露于受控缺氧环境条件（8%氧气）。具有相匹配的肿瘤体积的对照小鼠维持在正常居住条件下。在实验开始后24小时，将C5（2nmol）静脉内注射到所有小鼠。在注射后将缺氧小鼠放回到缺氧仓室中，并且在注射后24小时将肿瘤切除，并通过荧光反射成像（FRI）进行成像。图6示出了来自于放置在正常空气（左侧）和8%O2（右侧）中的小鼠的切除肿瘤的荧光图像。图像的定量分析示出在图中，表明来自于缺氧气氛下的小鼠的肿瘤中C5的明显更高的摄入。
实施例23：通过荧光显微技术分析荧光碳酸酐酶结合性化合物在肿瘤组织中的分布
图7示出了通过用抗CA IX抗体或哌莫硝唑（一种组织缺氧标志物）共染色的肿瘤组织切片的荧光显微技术确定的C5荧光信号在HeLa荷瘤小鼠中的分布。然后将用C5注射的荷瘤小鼠，在处死前1小时和5分钟，分别用缺氧组织的一种标志物哌莫硝唑（80mg/kg）和染色高度灌注组织的Hoechst33342（25mg/kg）静脉内注射（38）。收集肿瘤、肾脏和肌肉组织，并通过FRI成像。然后将组织包埋，在OCT（最适切片温度化合物）中冷冻，并储存在-80℃下，直至将它们切片用于荧光显微技术和免疫染色。制备厚度为8μm的切片并空气干燥10分钟。将切片对Hoechst（蓝色）和C5（红色）的组合进行成像。在获取图像后，将切片在冰冷的丙酮中固定20分钟，并在SuperBlock（37515,Thermo Scientific）中培养30分钟。然后将组织切片用使用阻断溶液稀释的检测抗体染色1小时；CA IX的表达使用1:10稀释的荧光素偶联的抗人类CA IX单克隆抗体（FAB2188F，R&D System）来检测，并且哌莫硝唑结合通过1:25稀释的FITC偶联的鼠类抗哌莫硝唑单克隆抗体（提供在Hypoxyprobe plus试剂盒中），在相邻切片中检测。将切片再一次在蓝色（Hoechst）和绿色（哌莫硝唑和CA IX）荧光中成像。最后，按照标准流程将切片用H&E染色。通过Carl Zeiss Axiovert荧光显微镜获取图像。所有图像以25x放大倍数（2.5x物镜）使用相同的曝光时间来获取。C5的肿瘤组织分布与CA IX抗体和组织缺氧标志物哌莫硝唑两者共定位，并远离由Hoechst染色剂指示的良好灌注区域。
通过引用合并
本文中引用的所有出版物、专利和专利申请，以其全部内容出于所有目的明确地通过引用并入本文，引入程度与如同将每份单独的出版物、专利或专利申请单独引入的程度相同。碳酸酐酶成像剂还描述在美国专利号7,833,737；和国际申请公布号WO2006/137092、WO2008/124703、WO2010/147666和WO2010/065906中，它们全都以其全部内容通过引用并入本文。
等同性
本发明可以体现为其他特定形式而不背离其精神和本质特征。因此，上述实施例在所有方面视为说明性的，而不是对本文描述的发明的限制。因此，本发明的范围由随附的权利要求书而不是由前面的描述指明，并且意图将进入权利要求书的意义和等同性范围之内的所有变化涵盖在其中。

Claims (44)

1.一种碳酸酐酶靶向剂，该碳酸酐酶靶向剂由式（I）或其盐表示：
Figure FDA0000412045740000011
（I）
其中：
CAB是碳酸酐酶结合部分，该CAB包含磺酰胺组成部分和脂族、芳香族或杂芳族组成部分；
Q是取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、C1-C18烷基、烯基、炔基、烷氧基或硫烷基；或者Q不存在；
L1、L2和L3在每次出现时各自独立地表示连接键或连接物组成部分；
W表示苯并稠合、萘并稠合或吡啶并稠合的环；
X在每次出现时独立地是C(CH2Y1)(CH2Y2)、O、S或Se；
Y1和Y2独立地是氢或C1-C20脂族基团，每个Y1和Y2可任选地被L3—M取代；
M在每次出现时独立地是氢或化学修饰组成部分。
2.一种碳酸酐酶靶向剂，该碳酸酐酶靶向剂由式（II）或其盐表示：
Figure FDA0000412045740000012
（Π）
其中：
CAB是碳酸酐酶结合部分，该CAB包含磺酰胺组成部分和脂族、芳香族或杂芳族组成部分；
Q是取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、C1-C18烷基、烯基、炔基、烷氧基或硫烷基；或者Q不存在；
L1、L2和L3在每次出现时各自独立地表示连接键或连接物组成部分；
R在每次出现时独立地是氢、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、C1-C18烷基、烯基、炔基、烷氧基或硫烷基，每个R可任选地被L3—M取代；
n是1、2或3；
W表示苯并稠合、萘并稠合或吡啶并稠合的环；
X在每次出现时独立地是C(CH2Y1)(CH2Y2)、O、S或Se；
Y1和Y2独立地是氢或C1-C20脂族基团，每个Y1和Y2可任选地被L3—M取代；并且
M在每次出现时独立地是氢或化学修饰组成部分。
3.根据权利要求1或2所述的药剂，其中所述药剂在远红或近红外中具有荧光。
4.根据权利要求1-3任一项所述的药剂，其中Q是未取代的杂芳基。
5.根据权利要求1-3任一项所述的药剂，其中Q是烷基。
6.根据权利要求1-5任一项所述的药剂，其中每个L1、L2和L3独立地包含-NH-(CH2)n-C(=O)-，其中n=1-8，或选自由下列的组成部分所组成的组的双自由基：甘氨酸，丙氨酸，β-丙氨酸，4-氨基甲基苯甲酸，磺基丙氨酸，谷氨酸，氨基-聚乙二醇-羧酸，氨基-聚乙二醇胺，乙二胺，丙二胺，亚精胺，精胺，己二胺，二胺-氨基酸，赖氨酸，鸟氨酸，二氨基丁酸，二氨基丙酸，琥珀酸，戊二酸，辛二酸，己二酸，酰胺，三唑，脲和硫脲。
7.根据权利要求1-5任一项所述的药剂，其中L1是下列之一：
（a）-C(O)N(R1)-烷基-C(O)N(R1)-ψ；
（b）-C(O)N(R1)-烷基-ψ；
（c）-C(O)N(R1)-[C2-3烷基-O]z-C1-3烷基-C(O)N(R1)-ψ；
（d）-C(O)N(R1)-烷基-芳基-C(O)N(R1)-ψ；
（e）-C(O)N(R1)-烷基-C(O)N(R1)-C1-3烷基-芳基-C(O)N(R1)-ψ；或
（f）-C(O)N(R1)-[C2-3烷基-O]z-C1-3烷基-C(O)N(R1)-烷基-芳基-C(O)N(R1)-ψ；
其中z是约3至约35的整数，R1在每次出现时独立地表示氢或烷基，并且ψ是与CAB的连接键。
8.根据权利要求1-7任一项所述的药剂，其中L2是C1-5烷基。
9.根据权利要求1-8任一项所述的药剂，其中L3是连接键。
10.根据权利要求1-9任一项所述的药剂，其中X是C(CH3)2。
11.根据权利要求1-10任一项所述的药剂，其中M在每次出现时独立地表示磺酸盐或-SO3H。
12.根据权利要求1-10任一项所述的药剂，其中M在每次出现时独立地表示选自羧酸盐、膦酸盐、磷酸盐和亚氨基二乙酸盐的取代基。
13.根据权利要求1-10任一项所述的药剂，其中M是磺酸盐。
14.根据权利要求1-10任一项所述的药剂，其中M在每次出现时独立地表示选自由下列的取代基所组成的组：氢，醇，磺酸，磺酸盐，多磺酸盐，磺基丙氨酸，磺酰胺，亚砜，砜，羧酸盐，酮，膦酸盐，磷酸盐；亚氨基二乙酸盐，乙二胺四乙酸，二亚乙基三胺五乙酸，四氮杂环十二烷四乙酸，氨基酸或聚氨基酸，低聚或聚乙二醇，胺，季铵离子，糖，葡萄糖胺，半乳糖胺，甘露糖胺，聚乙二醇（PEG），烷氧基聚乙二醇，支链聚丙二醇，聚丙二醇，聚赖氨酸和甲氧基聚乙二醇的接枝共聚物，肽，脂，脂肪酸，棕榈酸盐，磷脂，磷脂-PEG缀合物，糖类，氧化铁纳米粒子，萘基丙氨酸，苯基丙氨酸，3,3-二苯基丙胺，牛磺酸，膦酸盐，磷酸盐，羧酸盐和聚羧酸盐。
15.根据权利要求1-14任一项所述的药剂，其中所述化学修饰剂M增强所述药剂对CA IX相对于CA IX之外的CA的结合选择性。
16.根据权利要求1-15任一项所述的药剂，其中所述M修饰的药剂在中性pH下具有-3至-12范围内的净负电荷。
17.根据权利要求1-16任一项所述的药剂，其中所述化学修饰剂M降低所述药剂的非特异性细胞膜通透性。
18.根据权利要求1-17任一项所述的药剂，其中所述化学修饰剂M降低所述化合物在给药于动物活体时的非特异性组织积累。
19.一种碳酸酐酶靶向剂，该碳酸酐酶靶向剂由式（III）或其盐表示：
F-L-CAB
（III）
其中
F是近红外荧光染料；
L是任选的连接物；并且
CAB是碳酸酐酶结合部分，该CAB包含磺酰胺组成部分和脂族、芳香族或杂芳族组成部分。
20.根据权利要求1-19任一项所述的药剂，其中CAB是-芳基-SO2NH2、-杂环基-SO2NH2、-芳基-C(O)N(R’)-杂芳基-SO2NH2、-杂芳基-C(O)N(R’)-杂芳基-SO2NH2、-C(O)N(R’)-杂芳基-杂芳基-SO2NH2或-C(O)N(R’)-芳基-杂芳基-SO2NH2，其中R’在每次出现时独立地表示氢或C1-6烷基；每个芳基和杂芳基可任选地被1或2个取代基取代，所述取代基独立地选自由烷基和卤素所组成的组；并且每个杂环基可任选地被1、2或3个取代基取代，所述取代基独立地选自由烷基、卤素、氨基和氧基所组成的组。
21.一种碳酸酐酶靶向剂，该碳酸酐酶靶向剂由式（IV）或其盐表示：
Figure FDA0000412045740000051
其中：
Q是未取代的杂芳基;
L1是下列之一：
（a）-C(O)N(R1)-烷基-C(O)N(R1)-ψ；
（b）-C(O)N(R1)-烷基-ψ；
（c）-C(O)N(R1)-[C2-3烷基-O]z-C1-3烷基-C(O)N(R1)-ψ；
（d）-C(O)N(R1)-烷基-芳基-C(O)N(R1)-ψ；
（e）-C(O)N(R1)-烷基-C(O)N(R1)-C1-3烷基-芳基-C(O)N(R1)-ψ；或
（f）-C(O)N(R1)-[C2-3烷基-O]z-C1-3烷基-C(O)N(R1)-烷基-芳基-C(O)N(R1)-ψ；
其中z是约3至约35的整数，R1在每次出现时独立地表示氢或烷基，并且ψ是与CAB的连接键；
L2是C1-5烷基；
M在每次出现时独立地表示磺酸盐或-SO3H；并且
CAB是-芳基-SO2NH2、-杂环基-SO2NH2、-芳基-C(O)N(R’)-杂芳基-SO2NH2、-杂芳基-C(O)N(R’)-杂芳基-SO2NH2、-C(O)N(R’)-杂芳基-杂芳基-SO2NH2或-C(O)N(R’)-芳基-杂芳基-SO2NH2，其中R’在每次出现时独立地表示氢或C1-6烷基；每个芳基和杂芳基可任选地被1或2个取代基取代，所述取代基独立地选自由烷基和卤素所组成的组；并且每个杂环基可任选地被1、2或3个取代基取代，所述取代基独立地选自由烷基、卤素、氨基和氧基所组成的组。
22.一种碳酸酐酶靶向剂，该碳酸酐酶靶向剂由式（V）或其盐表示：
Figure FDA0000412045740000061
其中：
Q是C1-6烷基；
L1是下列之一：
（a）-C(O)N(R1)-烷基-C(O)N(R1)-ψ；
（b）-C(O)N(R1)-烷基-ψ；或
（c）-C(O)N(R1)-烷基-芳基-C(O)N(R1)-ψ；
其中R1在每次出现时独立地表示氢或烷基，并且ψ是与CAB的连接键；
L2是C1-5烷基；
M在每次出现时独立地表示磺酸盐或-SO3H；并且
CAB是-芳基-SO2NH2、-杂环基-SO2NH2、-芳基-C(O)N(R’)-杂芳基-SO2NH2、-杂芳基-C(O)N(R’)-杂芳基-SO2NH2、-C(O)N(R’)-杂芳基-杂芳基-SO2NH2或-C(O)N(R’)-芳基-杂芳基-SO2NH2，其中R’在每次出现时独立地表示氢或C1-6烷基；每个芳基和杂芳基可任选地被1或2个取代基取代，所述取代基独立地选自由烷基和卤素所组成的组；并且每个杂环基可任选地被1、2或3个取代基取代，所述取代基独立地选自由烷基、卤素、氨基和氧基所组成的组。
23.根据权利要求1-22任一项所述的药剂，其中CAB是-苯基-SO2NH2、-吡啶基-SO2NH2、1,3,4-噻二唑-SO2NH2、-苯并[d]噻唑-SO2NH2、-苯基-C(O)N(H)-吡啶基-SO2NH2、-苯基-C(O)N(H)-1,3,4-噻二唑-SO2NH2、-吡啶基-C(O)N(H)-1,3,4-噻二唑-SO2NH2、-C(O)N(H)-吡啶基-1,3,4-噻二唑-SO2NH2、或-C(O)N(H)-苯基-1,3,4-噻二唑-SO2NH2；其中每个苯基、吡啶基和噻二唑可任选地被1或2个取代基取代，所述取代基独立地选自由烷基和卤素所组成的组。
24.根据权利要求1-22任一项所述的药剂，其中CAB由下式表示：
Figure FDA0000412045740000071
25.一种碳酸酐酶靶向剂，该碳酸酐酶靶向剂选自由
3-乙基-2-((1E,3Z,5E)-5-(3-乙基-1,1-二甲基-6,8-二磺基-1H-苯并[e]吲哚-2(3H)-亚基)-3-(5-((4-氨磺酰基苯甲基)氨甲酰基)吡啶-2-基)戊-1,3-二烯-1-基)-1,1-二甲基-6,8-二磺基-1H-苯并[e]吲哚-3-鎓；
3-(2-((1E,3Z,5E)-5-(1,1-二甲基-6,8-二磺基-3-(3-磺基丙基)-1H-苯并[e]吲哚-2(3H)-亚基)-3-(5-((4-氨磺酰基苯甲基)氨甲酰基)吡啶-2-基)戊-1,3-二烯-1-基)-1,1-二甲基-6,8-二磺基-1H-苯并[e]吲哚-3-鎓-3-基)丙烷-1-磺酸盐；
3-(2-((1E,3E,5E)-5-(1,1-二甲基-6,8-二磺基-3-(3-磺基丙基)-1H-苯并[e]吲哚-2(3H)-亚基)戊-1,3-二烯-1-基)-1,1-二甲基-6-(N-甲基-N-(4-氧基-4-((4-氨磺酰基苯甲基)氨基)丁基)氨磺酰基)-1H-苯并[e]吲哚-3-鎓-3-基)丙烷-1-磺酸盐；
3-(2-((1E,3Z,5E)-5-(1,1-二甲基-6,8-二磺基-3-(3-磺基丙基)-1H-苯并[e]吲哚-2(3H)-亚基)-3-(5-((6-氧基-6-((4-氨磺酰基苯甲基)氨基)己基)氨甲酰基)吡啶-2-基)戊-1-二烯-1-基)-1,1-二甲基-6,8-二磺基-1H-苯并[e]吲哚-3-鎓-3-基)丙烷-1-磺酸盐；
3-(2-((1E,3Z,5E)-5-(1,1-二甲基-6,8-二磺基-3-(3-磺基丙基)-1H-苯并[e]吲哚-2(3H)-亚基)-3-(5-((3-氧基-1-(4-氨磺酰基苯基)-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75-二十四氧杂-2-氮杂七十七烷-77-基)氨甲酰基)吡啶-2-基)戊-1,3-二烯-1-基)-1,1-二甲基-6,8-二磺基-1H-苯并[e]吲哚-3-鎓-3-基)丙烷-1-磺酸盐；
3-(2-((1E,3E,5E)-5-(1,1-二甲基-6,8-二磺基-3-(3-磺基丙基)-1H-苯并[e]吲哚-2(3H)-亚基)戊-1,3-二烯-1-基)-1,1-二甲基-6-(N-甲基-N-(4-氧基-4-((4-((5-氨磺酰基-1,3,4-噻二唑-2-基)氨甲酰基)苯甲基)氨基)丁基)氨磺酰基)-1H-苯并[e]吲哚-3-鎓-3-基)丙烷-1-磺酸盐；
3-(2-((1E,3Z,5E)-5-(1,1-二甲基-6,8-二磺基-3-(3-磺基丙基)-1H-苯并[e]吲哚-2(3H)-亚基)-3-(5-((6-氧基-6-((4-((5-氨磺酰基-1,3,4-噻二唑-2-基)氨甲酰基)苯甲基)氨基)己基)氨甲酰基)吡啶-2-基)戊-1,3-二烯-1-基)-1,1-二甲基-6,8-二磺基-1H-苯并[e]吲哚-3-鎓-3-基)丙烷-1-磺酸盐；
3-乙基-2-((1E,3Z,5E)-5-(3-乙基-1,1-二甲基-6,8-二磺基-1H-苯并[e]吲哚-2(3H)-亚基)-3-(5-((4-((5-氨磺酰基-1,3,4-噻二唑-2-基)氨甲酰基)苯甲基)氨甲酰基)吡啶-2-基)戊-1,3-二烯-1-基)-1,1-二甲基-8-磺基-1H-苯并[e]吲哚-3-鎓-6-磺酸盐；
3-(2-((1E,3Z,5E)-5-(1,1-二甲基-6,8-二磺基-3-(3-磺基丙基)-1H-苯并[e]吲哚-2(3H)-亚基)-3-(5-((4-((5-氨磺酰基-1,3,4-噻二唑-2-基)氨甲酰基)苯甲基)氨甲酰基)吡啶-2-基)戊-1,3-二烯-1-基)-1,1-二甲基-6,8-二磺基-1H-苯并[e]吲哚-3-鎓-3-基)丙烷-1-磺酸盐；
3-(2-((1E,3Z,5E)-5-(1,1-二甲基-6,8-二磺基-3-(3-磺基丙基)-1H-苯并[e]吲哚-2(3H)-亚基)-3-(5-((3-氧基-1-(4-((5-氨磺酰基-1,3,4-噻二唑-2-基)氨甲酰基)苯基)-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75-二十四氧杂-2-氮杂七十七烷-77-基)氨甲酰基)吡啶-2-基)戊-1,3-二烯-1-基)-1,1-二甲基-6,8-二磺基-1H-苯并[e]吲哚-3-鎓-3-基)丙烷-1-磺酸盐；
3-(2-((1E,3Z,5E)-5-(1,1-二甲基-6,8-二磺基-3-(3-磺基丙基)-1H-苯并[e]吲哚-2(3H)-亚基)-3-(5-((3-氧基-3-((5-氨磺酰基-1,3,4-噻二唑-2-基)氨基)丙基)氨甲酰基)吡啶-2-基)戊-1,3-二烯-1-基)-1,1-二甲基-6,8-二磺基-1H-苯并[e]吲哚-3-鎓-3-基)丙烷-1-磺酸盐；以及
3-(2-((1E,3Z,5E)-5-(3,3-二甲基-5-磺基-1-(3-磺基丙基)二氢吲哚-2-亚基)-3-(5-((3-氧基-3-((5-氨磺酰基-1,3,4-噻二唑-2-基)氨基)丙基)氨甲酰基)吡啶-2-基)戊-1,3-二烯-1-基)-3,3-二甲基-5-磺基-3H-吲哚-1-鎓-1-基)丙烷-1-磺酸盐；
及其可药用盐所组成的组。
26.一种适合于向对象给药的药物组合物，该药物组合物包含权利要求1-25任一项的药剂和可药用赋形剂。
27.一种体内成像方法，该体内成像方法包括：
（a）将权利要求1-25任一项的药剂给药于对象；
（b）使所述药剂在所述对象中分布；以及
（c）检测由所述碳酸酐酶成像剂发射的信号。
28.一种体内光学成像方法，该体内光学成像方法包括：
（a）将权利要求1-25任一项的药剂给药于对象，其中所述药剂包含荧光染料；
（b）使所述药剂在所述对象中分布；
（c）将所述对象暴露于所述荧光染料可吸收的波长的光；以及
（d）检测由所述药剂发射的信号。
29.根据权利要求27或28所述的方法，其中由所述药剂发射的所述信号用于构建图像。
30.根据权利要求27或28所述的方法，其中所述图像是断层扫描图像。
31.根据权利要求27所述的方法，其中步骤（a）至（c）以预定时间间隔重复，从而允许在所述对象体内随时间评估所述碳酸酐酶药剂的发射信号。
32.根据权利要求28所述的方法，其中步骤（a）至（d）以预定时间间隔重复，从而允许在所述对象体内随时间评估所述碳酸酐酶药剂的发射信号。
33.根据权利要求27-32任一项所述的方法，其中所述对象是动物或人类。
34.根据权利要求27或28所述的方法，其中在步骤（a）中，将信号特性可以彼此区分开的两种或更多种成像探针给药于对象，其中至少一种所述成像探针是碳酸酐酶结合剂。
35.根据权利要求28所述的方法，其中所述照射和检测步骤使用内窥镜、导管、断层扫描系统、手持光学成像系统或术中显微镜来进行。
36.根据权利要求27-35任一项所述的方法，其中发射信号的存在、不存在或水平指示疾病状态。
37.根据权利要求27-35任一项所述的方法，其中所述方法用于检测和/或监测疾病。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述疾病选自由骨病、癌症、心血管疾病、动脉粥样硬化、再狭窄、心肌缺血、心肌再灌注损伤、环境疾病、皮肤病、免疫疾病、遗传病、传染病、炎性疾病、代谢病、神经退行性疾病、眼科疾病和呼吸道疾病所组成的组。
39.根据权利要求27-38任一项所述的方法，其中在步骤（a）中，将用所述碳酸酐酶靶向剂标记的细胞给药于所述对象。
40.根据权利要求39所述的方法，其中由所述碳酸酐酶靶向剂发射的信号用于监测所述细胞的运输和定位。
41.一种对在对象体内的组织缺氧进行成像的方法，所述方法包括：
（a）将权利要求1-25任一项的药剂给药于对象；以及
（b）检测所述药剂的存在，由此产生表示所述对象组织中的碳酸酐酶表达和/或缺氧的图像。
42.一种在对象体内治疗疾病的方法，所述方法包括将权利要求1-25任一项的药剂系统或局部地给药于对象，其中所述药剂包含定位于所述疾病区域中并传递有效剂量的辐射的放射性标记物。
43.一种体外成像方法，该体外成像方法包括：
（a）将样品与权利要求1-25任一项的药剂相接触；
（b）使所述药剂结合于生物靶；
（c）可任选地除去未结合的药剂；以及
（d）检测从所述药剂发射的信号，由此确定所述药剂是否被所述生物靶激活或结合于生物靶。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述样品是生物样品。
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