CN105985769A

CN105985769A - 一种苯硫酚荧光探针的制备及应用

Info

Publication number: CN105985769A
Application number: CN201510043537.0A
Authority: CN
Inventors: 宋相志; 高丽; 刘兴江
Original assignee: SUZHOU LUOLAN BIOLOGICAL SCIENCE & TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: SUZHOU LUOLAN BIOLOGICAL SCIENCE & TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2015-01-28
Filing date: 2015-01-28
Publication date: 2016-10-05
Anticipated expiration: 2035-01-28
Also published as: CN105985769B

Abstract

本发明公开了一种可以用于荧光检测苯硫酚的新型化合物，具体涉及一种新型荧光探针的制备方法及其应用，属于化学分析检测技术领域。其分子结构式如下：该荧光探针选择性好，抗干扰能力强，灵敏度高，可用于生物或环境样品中的苯硫酚的荧光检测，具有很好的应用前景。

Description

一种苯硫酚荧光探针的制备及应用

技术领域

本发明涉及的是化学分析检测技术领域，具体涉及一种新型的苯硫酚荧光探针的制备方法以及该荧光探针在检测苯硫酚方面的应用。

背景技术

苯硫酚在有机合成中被广泛应用于医药、农药等中间体的制备，然而残留在水体及土壤中的苯硫酚会对环境及人类健康产生一系列危害。苯硫酚可通过吸入、食入或经皮吸收等途径被人体吸收，会引起咳嗽、头痛、呕吐，严重时会导致人体中枢神经系统受损，心率加快，肌肉萎缩，昏迷甚至死亡。目前巯基类化合物的荧光探针大多基于巯基的亲核性进行有效识别，但是由于苯硫酚与脂肪硫醇具有相似的结构，并且苯硫酚具有更强的亲核性，导致很多巯基类探针无法很好地区分二者。因此合成一种高灵敏度，高选择性，能够快速检测环境样品内的苯硫酚探针具有重要意义和实用价值。

发明内容

本发明目的之一是提供一种合成简单、反应条件温和、成本较低的荧光探针合成方法；目的之二是提供一种灵敏度高、选择性好，抗干扰能力强，能够实现荧光法检测苯硫酚的荧光探针。

本发明使用荧光法检测苯硫酚，以邻苯二甲酰亚胺衍生物为荧光团，以2，4-二硝基苯醚为苯硫酚的识别基团。

本发明解决问题采取的技术方案为，一种荧光检测苯硫酚荧光探针，其分子结构式为，该荧光探针的合成路线如下，

具体制备方法包括以下步骤：1)将3-硝基邻苯二甲酸酐溶解于乙酸中，缓慢加入正丁胺，室温下搅拌10min后，加热升温，120℃控温回流2.5h。反应结束后，冷却至室温，将反应液倒入冰水中，待固体析出后，抽滤并用冷水洗涤3次，得粗产物为白色固体，无需进一步纯化，直接进行下一步。2)将上一步所得粗产物1溶解于甲醇中，加入催化量的Pd/C，将体系抽真空，通入氢气，加热搅拌，控温65℃，12h后停止反应，抽滤除去固体催化剂。将滤液减压旋干，经层析柱分离得目标产物。3)将上步得到产物2溶解在50％硫酸溶液中，冰水浴下缓慢加入亚硝酸钠溶液，继续搅拌30min后，换油浴加热，控温90℃反应1h。停止加热，将反应液倒入水中，用乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥后，减压旋干，经层析柱进一步纯化得目标产物。4)将上步得到的产物3和2，4-二硝基氟苯溶解于二甲基甲酰胺中，加入碳酸钾，90℃加热搅拌10h。反应停止后，冷却至室温，过滤出去碳酸钾，滤液加水稀释，二氯甲烷萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩后经层析柱分离得探针分子。在本说明书的实施例中更详细地说明了该探针的合成和检测方法。

本发明的荧光分子探针使用方法如下，将探针分子溶解在含有20％乙腈、pH为7.4的HEPES缓冲溶液中，室温下进行测试。当加入苯硫酚时，由于2,4-二硝基苯醚基团可以在苯硫酚的诱导下发生的裂解，使荧光得以恢复。探针分子与苯硫酚作用原理如下，

本发明的苯硫酚荧光探针的具体特征如下：探针分子无明显发射峰，但与苯硫酚作用后，探针分子在516nm处出现明显的发射峰，荧光强度增强了60倍以上。

本发明所述的探针分子合成简单，成本较低，对苯硫酚的选择性好、抗干扰能力强、响应速度快使得该荧光探针在生物化学，环境科学等领域具有实际的应用价值。

附图说明

图1为本发明荧光探针的选择性，荧光探针(5.0×10^-6mol/L)在HEPES缓冲溶液(20mM，V_乙腈/_VHEPES＝2/8，pH＝7.4)中，与不同分析物作用后的荧光光谱，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度。

图2为本发明荧光探针的抗干扰能力，苯硫酚与其他分析物共存，与荧光探针5.0×10^-6mol/L)在缓冲溶液(V_乙腈/V_HEPES＝2/8，pH＝7.4)中作用后的荧光强度比值(I/I₀)柱状图。其中25种分析物分别为：1，苯硫酚；2，半胱氨酸；3，同型半胱氨酸；4，谷甘胱肽；5，巯基乙醇；6，3-巯基丙酸；7，丙氨酸；8，甘氨酸；9，苯酚；10，苯胺；11，叠氮化钠；12，硫氢化钠；13，氟化钠；14，氯化钠；15，溴化钠；16，碘化钾；17，亚硝酸钠；18，硫代硫酸钠；19，硫酸钠；20，磷酸钠；21，亚硫酸钠；22，氯化锌；23，氯化钙；24，氯化镁；25，氯化钾。

图3为本发明的荧光探针(5.0×10^-6mol/L)在HEPES缓冲溶液(20mM，V_乙腈/V_HEPES＝2/8，pH＝7.4)中，与不同浓度苯硫酚作用后的荧光光谱变化，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度。

图4为本发明的荧光探针(5.0×10^-6mol/L)在HEPES缓冲溶液(20mM，V_乙腈/V_HEPES＝2/8，pH＝7.4)中，与苯硫酚浓度的线性关系，横坐标为苯硫酚浓度，纵坐标为荧光强度。

图5为本发明的荧光探针(5.0×10^-6mol/L)在HEPES缓冲溶液(20mM，V_乙腈/V_HEPES＝2/8，pH＝7.4)中，与苯硫酚作用过程中荧光强度随时间的变化，横坐标为时间，纵坐标为荧光强度。

图6为本发明的荧光探针(5.0×10^-6mol/L)在不同pH值缓冲溶液中，与苯硫酚作用前后的荧光强度，横坐标为pH，纵坐标为荧光强度。

图7为本发明的荧光探针(5.0×10^-6mol/L)在长江水配制的HEPES缓冲溶液(20mM，V_乙腈/V_HEPES＝2/8，pH＝7.4)中，与苯硫酚浓度的线性关系，横坐标为苯硫酚浓度，纵坐标为荧光强度。

图8为本发明的荧光探针(5.0×10^-6mol/L)在太湖水配制的HEPES缓冲溶液(20mM，V_乙腈/V_HEPES＝2/8，pH＝7.4)中，与苯硫酚浓度的线性关系，横坐标为苯硫酚浓度，纵坐标为荧光强度。

图9为本发明的荧光探针(5.0×10^-6mol/L)在自来水配制的HEPES缓冲溶液(20mM，V_乙腈/V_HEPES＝2/8，pH＝7.4)中，与苯硫酚浓度的线性关系，横坐标为苯硫酚浓度，纵坐标为荧光强度。

图10为该探针在SH-SY5Y细胞内检测苯硫酚的荧光成像图。(a)和(c)为SH-SY5Y细胞在37℃下置于5μM探针的PBS溶液中培养30min后，在暗场和明场下的细胞图像。(b)和(d)为SH-SY5Y细胞在37℃下先置于25μM苯硫酚的PBS溶液中培养30min，再在37℃下置于5μM探针的PBS溶液中培养30min，经PBS缓冲液冲洗之后，在暗场和明场下的细胞图像。

具体实施方式

实施例1：化合物1的合成

3-硝基邻苯二甲酸酐(1.9361g,10mmol)溶于20ml乙酸中，缓慢加入正丁胺(1.0951g,15mmol)，室温下搅拌10min后，加热升温，120℃回流2.5h。反应结束后，冷却至室温，将反应液倒入50ml冷水中，待固体完全析出后，减压抽滤，并用冷水洗涤滤饼三次(9ml×3)，得化合物1，为白色固体。产量：2.1252g。产量：85.7％。化合物1表征如下:¹H NMR(500MHz,DMSO):δ_H 8.27(d,J＝8.1Hz,1H),8.16(d,J＝7.5Hz,1H),8.05(t,J＝7.8Hz,1H),3.57(t,J＝7.1Hz,2H),1.55–1.61(m,2H),1.39–1.20(m,2H),0.90(t,J＝7.4Hz,3H).¹³C NMR(126MHz,DMSO)δ_C:166.51,163.86,144.63,136.54,134.05,128.62,127.17,123.50,38.13,30.24,19.94,13.94.

实施例2：化合物2的合成

上步所得化合物1(0.4964g,2mmol)溶于15ml甲醇，加入10％w/w Pd/C(0.0496g,5mol％)，将体系抽真空，通入氢气并搅拌，65℃下回流12h。反应停止后，减压抽滤除去固体催化剂，所得滤液减压旋蒸除去溶剂，经层析柱分离得化合物2。产量：0.6240g。产量：71.5％。化合物2表征如下：¹H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.42(dd,J＝8.3,7.1Hz,1H),7.16(d,J＝7.6Hz,1H),6.86(d,J＝8.8Hz,1H),5.13(s,1H),3.65(t,J＝7.3Hz,2H),1.63–1.70(m,2H),1.35–1.42(m,2H).0.95(t,J＝7.4Hz,3H).¹³C NMR(126MHz,DMSO)δ_C:170.38,168.77,145.15,135.02,132.86,120.96,112.58,111.38,37.37,30.76,20.09,13.69.

实施例3：化合物3的合成

将上步所得化合物2溶于10ml 50％硫酸中，0℃冰水浴下搅拌，缓慢滴加亚硝酸钠水溶液(0.0692mg，1mmol，2mL水)。继续在0℃下搅拌30min后，加热升温至90℃，继续反应1h。反应结束后，将反应液倒入50ml水中，乙酸乙酯萃取3次(20mL×3)，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥后，旋蒸除去溶剂，真空干燥后经柱层析分离得到化合物3。产量：0.1862g。产率：85.4％。化合物3表征如下：¹H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.70(s,1H),7.56(t,J＝7.6Hz,1H),7.36(d,J＝7.2Hz,1H),7.15(d,J＝8.4Hz,1H),3.65(t,J＝7.3Hz,2H),1.68–1.62(m,2H),1.40–1.32(m,2H),0.95(t,J＝7.4Hz,3H).¹³C NMR(126MHz,DMSO)δ_C:170.51,167.91,154.60,136.14,132.11,122.53,115.80,114.63,37.49,30.62,19.87,13.40.

实施例4：探针分子的合成

将上步得到的产物3(0.4406g,2.0mmol)和2，4-二硝基氟苯(0.5582g,3.0mmol)溶解于10ml N,N-二甲基甲酰胺中，加入无水碳酸钾(0.9484g,6.0mmol)，90℃加热搅拌10h。反应停止后，冷却至室温，过滤出去碳酸钾，滤液加15ml水稀释，二氯甲烷(20mL×3)萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩后经层析柱分离得探针分子。产率74.5％。探针分子表征如下：HRMS(EI)m/z:calcd for C₁₈H₁₅N₃O₇[M+H],386.0910；found,450.0983.¹H NMR(500MHz,CDCl3)δ_H 8.96(d,J＝2.7Hz,1H),8.36(dd,J＝9.2,2.7Hz,1H),8.06–7.68(m,2H),7.49(d,J＝7.8Hz,1H),7.06(d,J＝9.2Hz,1H),3.59(t,2H),1.67–1.47(m,2H),1.34–1.29(m,2H),0.91(t,3H).¹³C NMR(125MHz,CDCl3)δ_C 166.96,165.09,155.23,149.53,142.45,139.68,136.73,134.10,128.90,126.90,122.45,121.47,121.29,118.83,38.09,30.42,20.03,13.56.

实施例5：本发明苯硫酚荧光探针的性能测试

将探针溶于缓冲溶液(V_乙腈/V_HEPES＝2/8，pH＝7.4)中配制成5.0×10^-6mol/L的溶液，向溶液中加入Cys,Hcy,GSH,2-巯基乙醇,3-巯基丙酸,Ala,Gly,PhOH,PhNH₂,NaN₃,NaSH,NaF,NaCl,NaBr,KI,NaNO₂,Na₂S₂O₃,Na₂SO₄,Na₃PO₄,Na₂SO₃,ZnCl₂,CaCl₂,MgCl₂,KCl后没有明显的荧光变化，加入苯硫酚后引起了极为明显的荧光变化，该荧光探针对苯硫酚表现出高灵敏度、高选择性的识别。当苯硫酚分别与干扰物质Cys,Hcy,GSH,2-巯基乙醇,3-巯基丙酸,Ala,Gly,PhOH,PhNH₂,NaN₃,NaSH,NaF,NaCl,NaBr,KI,NaNO₂,Na₂S₂O₃,Na₂SO₄,Na₃PO₄,Na₂SO₃,ZnCl₂,CaCl₂,MgCl₂,KCl共存时，探针不受干扰因素的影响，表现出来很好的抗干扰能力。探针分子在pH为6至10的范围内都可以对苯硫酚选择性识别。

实施例6：本发明苯硫酚荧光探针的实际应用

配制一系列5.0×10^-6mol/L探针的缓冲溶液(V_乙腈/V_HEPES＝2/8，pH＝7.4)，分别加入0-50μM的苯硫酚，完全反应后，测得的516nm处的荧光强度与苯硫酚浓度在0-10μM的范围内具有良好的线性，线性相关系数R＝0.99729，检出限为3.5nM。取实际水样：长江水、太湖水和自来水，经过滤后配制成缓冲溶液进行相同的测试，结果显示该探针在实际水样品中的检测苯硫酚含量与在二次蒸馏水中的检测结果高度一致。

实施例7：本发明苯硫酚荧光探针的细胞测试

将培养好的SH-SY5Y细胞在37℃下置于5μM探针的PBS溶液中培养30min后得到的细胞图像无荧光。而将SH-SY5Y细胞在37℃下先置于25μM苯硫酚的PBS溶液中培养30min，再在37℃下置于5μM探针的PBS溶液中培养30min，经PBS缓冲液冲洗之后，能够获得细胞的荧光成像。由此说明，探针具有良好的细胞膜渗透性，可用于生物医学领域的细胞成像分析。

Claims

1.一种苯硫酚荧光探针，其结构为：

2.如权利要求1所述的苯硫酚荧光探针的制备方法，其特征在于按以下步骤进行制备：

(a)将3-硝基邻苯二甲酸酐溶解于乙酸中，缓慢加入正丁胺，室温下搅拌10min后，加热升温，120℃控温回流2.5h。反应结束后，冷却至室温，将反应液倒入冰水中，待固体析出后，抽滤并用冷水洗涤3次，得粗产物为白色固体，无需进一步纯化，直接进行下一步。

(b)将上一步所得粗产物1溶解于甲醇中，加入催化量的Pd/C，将体系抽真空，通入氢气，加热搅拌，控温65℃，12h后停止反应，抽滤除去固体催化剂。将滤液减压旋干，经层析柱分离得目标产物。

(c)将上步得到产物2溶解在50％硫酸溶液中，冰水浴下缓慢加入亚硝酸钠溶液，继续搅拌30min后，换油浴加热，控温90℃反应1h。停止加热，将反应液倒入水中，用乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥后，减压旋干，经层析柱进一步纯化得目标产物。

(d)将上步得到的产物3和2，4-二硝基氟苯溶解于二甲基甲酰胺中，加入碳酸钾，90℃加热搅拌10h。反应停止后，冷却至室温，过滤出去碳酸钾，滤液加水稀释，二氯甲烷萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩后经层析柱分离得探针分子。

3.根据权利要求1所述的苯硫酚荧光探针的用途，其特征在于该苯硫酚荧光探针用于环境或生物样品中苯硫酚的荧光检测和分析。