CN103773361B - 一种以香豆素为母核的半胱氨酸荧光探针及其应用 - Google Patents
一种以香豆素为母核的半胱氨酸荧光探针及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103773361B CN103773361B CN201410064348.7A CN201410064348A CN103773361B CN 103773361 B CN103773361 B CN 103773361B CN 201410064348 A CN201410064348 A CN 201410064348A CN 103773361 B CN103773361 B CN 103773361B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- ethanoyl
- fluorescence probe
- cysteine
- tonka bean
- bean camphor
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种以香豆素为荧光团的半胱氨酸荧光探针，所述探针是2-(3-乙酰基)香豆素基丙烯酸酯，其化学结构式如式（I）所示。本发明公开的2-(3-乙酰基)香豆素基丙烯酸酯可以选择性的与半胱氨酸作用，由无色变为淡黄色，具有荧光增强效应，可肉眼分辨，也可以通过紫外吸收和荧光光度法进行分析。本发明公开的半胱氨酸荧光探针可实现对半胱氨酸的微量高灵敏度检测，具有重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种以香豆素为荧光母体的荧光探针，尤其涉及一种以2-(3-乙酰基)香豆素基丙烯酸酯为母体的半胱氨酸荧光探针及其应用；属于有机小分子荧光探针领域。
背景技术
香豆素具有较大的摩尔消光系数和量子产率，是很重要的绿色荧光染料，经过修饰后用于发光材料、化学传感器以及标记生物分子。近几年利用荧光增强效应检测活体细胞中半胱氨酸的研究得到不断发展。
半胱氨酸在细胞内的含量为30-200μM，是细胞中很重要的成分，是谷胱甘肽、辅酶A、氨基乙磺酸的前驱体，铁硫磺族的硫化物的来源等。同时也具有很多重要的生物化学作用，例如生物催化、转录修饰、解毒等。半胱氨酸缺乏时会引起很多并发症，儿童生长缓慢、皮肤衰老、头发褪色、肝损伤和水肿等。而半胱氨酸含量过高会引起风湿性关节炎、帕金森综合症，老年痴呆症，不良妊娠反应等。因此在生物和环境样品中生物分子硫醇的检测始终吸引着科学研究者的极大兴趣。但检索发现中国专利如【201110439870】、【201210586667】、【201210441256】中有报道可以选择生物体中的活性硫醇，而专一性选择半胱氨酸的专利却很少。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种以香豆素为荧光团的高选择性和高灵敏度的半胱氨酸荧光探针及其应用。
本发明所述的以香豆素为荧光团的半胱氨酸荧光探针，其特征在于：所述荧光探针是2-(3-乙酰基)香豆素基丙烯酸酯，其化学结构式如式（I）所示：
上述2-(3-乙酰基)香豆素基丙烯酸酯由如下方法制得：
2,4-二羟基苯甲醛与乙酰乙酸乙酯反应得到3-乙酰基-7-羟基香豆素，然后与丙烯酰氯反应得到2-(3-乙酰基)香豆素基丙烯酸酯。
上述的荧光探针2-(3-乙酰基)香豆素基丙烯酸酯作为半胱氨酸荧光探针在检测PBS/乙醇缓冲液、牛血清或细胞中的半胱氨酸的应用。
本发明所述的2-(3-乙酰基)香豆素基丙烯酸酯可以与半胱氨酸发生迈克加成环化反应，释放出具有荧光的3-乙酰基-7-羟基香豆素，从而达到检测的效果，见图1。
配制2-(3-乙酰基)香豆素基丙烯酸酯的PBS/乙醇缓冲液（pH=7.4，v/v=2:3）的溶液，分别定量加入微升级的Cys,Hcy,GSH,arginine,aspartic acid,glutamic acid,glycine,histidine,lysine,proline,threonine,tryptophan,tyrosine,KNO3,Ca(NO3)2,NaNO3,Mg(NO3)2,Zn(NO3)2,Fe(NO3)3,H2O2和葡萄糖的水溶液。通过紫外可见分光光度法和荧光分光光度法测试对不同氨基酸、人体常见金属离子、双氧水和葡萄糖的选择性和响应能力，结果见图1-3。
在不加入NEM和加入NEM的活HeLa细胞中加入2-(3-乙酰基)香豆素基丙烯酸酯，对照细胞染色后荧光显微成像变化，结果见图4。
在不同浓度牛血清中加入1μM的2-(3-乙酰基)香豆素基丙烯酸酯检测其荧光强度变化，结果见图5。
本发明设计合成的2-(3-乙酰基)香豆素基丙烯酸酯可以与半胱氨酸发生加成环化反应，从而使溶液发出荧光，专一的选择半胱氨酸，能够区分半胱氨酸与还原型谷胱甘肽、同型半胱氨酸，实现了对半胱氨酸的微量高灵敏度检测，具有重要的应用价值。
附图说明
图1：为2-(3-乙酰基)香豆素基丙烯酸酯的PBS/乙醇缓冲液（pH=7.4，v/v=2:3，10μM）中加入不同的氨基酸、常见金属离子、双氧水、葡萄糖和半胱氨酸的紫外吸收图谱。
图2：为2-(3-乙酰基)香豆素基丙烯酸酯的PBS/乙醇缓冲液（pH=7.4，v/v=2:3，10μM）中加入不同的氨基酸、常见金属离子、双氧水、葡萄糖和半胱氨酸的荧光发射图谱。
图3：为2-(3-乙酰基)香豆素基丙烯酸酯与半胱氨酸加成环化产物的高分辨质谱。
图4：为2-(3-乙酰基)香豆素基丙烯酸酯在HeLa细胞内荧光显微成像图。
其中：A组是在37℃条件下，HeLa细胞在加入20.0μM的2-(3-乙酰基)香豆素基丙烯酸酯的细胞培养液中培养5小时；B组为HeLa细胞在含有20mM N-乙基马来酰亚胺细胞培养液中浸泡2小时，PBS缓冲溶液洗涤三次后，再在加入20.0μM的2-(3-乙酰基)香豆素基丙烯酸酯的细胞培养液中培养5小时的图像。
图5：为2-(3-乙酰基)香豆素基丙烯酸酯在牛血清中的荧光强度及照片。
显示在不同浓度的牛血清溶液（0,0.01,0.05,0.2,0.5,1）中加入1.0μM的2-(3-乙酰基)香豆素基丙烯酸酯培养20分钟的荧光强度及照片。
具体实施方式
实施例1
由2,4-二羟基苯甲醛与乙酰乙酸乙酯反应得到3-乙酰基-7-羟基香豆素，然后与丙烯酰氯反应得到2-(3-乙酰基)香豆素基丙烯酸酯。生成的2-(3-乙酰基)香豆素基丙烯酸酯可以与半胱氨酸发生迈克加成环化反应，释放出有荧光的3-乙酰基-7-羟基香豆素，从而实现检测。
上述反应过程反应式如下：
将2,4-二羟基苯甲醛（1，20mmol），乙酰乙酸乙酯（24mmol）和1mL哌啶加入到30mL无水乙醇中，加热至回流，反应3小时后冷至室温，有绿色固体析出，抽滤，乙醇洗三次，粗产品用乙醇重结晶得到淡绿色固体2，熔点：237℃，产率91%。
红外测定(KBr,cm-1):3482(O-H),3050(Ar-H),2928(=CH),1678(C=O),1620(C=C),1211(C-O-C)。
核磁共振氢谱测定：1H NMR(300MHz,DMSO-d6):δ=2.55(3H,s,CH3),6.75(1H,d,J=2.4Hz,Ar-H),6.85(1H,q,J=2.4and8.7Hz,Ar-H),7.79(1H,d,J=8.7Hz,Ar-H),8.59(1H,s,coumarin-H),11.12(1H,s,OH)。
核磁共振碳谱测定：13C NMR(75MHz,DMSO-d6):30.02,39.50,101.73,110.76,114.19,119.23,132.66,147.84,158.12,164.15,194.65。
高分辨质谱：m/z[M-H]-calcd for C11H7O4:203.0344,found:203.0360。
把3-乙酰基-7-羟基香豆素2（2mmol）和三乙胺（1.5mL）溶在30mL二氯甲烷中，冰浴条件下加入丙烯酰氯（4mmol），反应体系缓慢升至室温然后搅拌2小时。反应液用饱和食盐水洗涤三次，无水硫酸镁干燥，柱层析得淡黄色固体，即本发明的荧光探针，熔点：154-155oC，产率：80%。
红外测定(KBr,cm-1):3048(Ar-H),2926(=CH),1737(COO),1680(C=O),1613(C=C),1210(C-O-C)。
核磁共振氢谱测定：1H NMR(300MHz,CDCl3):δ=2.73(3H,s,CH3),6.12(1H,q,J=1.2and10.5Hz,alkene-H),6.34(1H,q,J=10.5and17.0Hz,alkene-H),6.68(1H,q,J=1.2and17.0Hz,alkene-H),7.18(1H,q,J=2.3and8.6Hz,Ar-H),7.24(1H,d,J=2.3Hz,Ar-H),7.68(1H,d,J=8.6Hz,Ar-H),8.51(1H,s,coumarin-H)。
核磁共振碳谱测定：13C NMR(75MHz,CDCl3):29.53,76.00,109.12,115.03,118.06,122.72,126.11,130.08,133.07,145.89,154.65,157.91,162.40,194.24。
高分辨质谱：m/z[M+H]+calcd for C14H10O5:259.0606,found:259.0600。
实施例2
用微量注射器向10mL配好的2-(3-乙酰基)香豆素基丙烯酸酯的PBS/乙醇缓冲液（pH=7.4，v/v=2:3，10μM）中，分别定量加入60μM的Cys,Hcy,GSH,arginine,aspartic acid,glutamicacid,glycine,histidine,lysine,proline,threonine,tryptophan,tyrosine,KNO3,Ca(NO3)2,NaNO3,Mg(NO3)2,Zn(NO3)2,Fe(NO3)3,H2O2和葡萄糖的水溶液，作用3小时后进行紫外可见分光光度法和荧光分光光度法测试，显示探针2-(3-乙酰基)香豆素基丙烯酸酯对半胱氨酸有较好的选择性，加入半胱氨酸前后对照显示具有较强荧光增强效应。见图1，2。
实施例3
细胞内荧光成像测试：
A、B两组为对照组，对照组A：在37℃条件下，HeLa细胞在加入20.0μM的2-(3-乙酰基)香豆素基丙烯酸酯的细胞培养液中培养5小时；对照组B：HeLa细胞在含有20mM N-乙基马来酰亚胺细胞培养液中浸泡2小时，PBS缓冲溶液洗涤三次后，再在加入20.0μM的2-(3-乙酰基)香豆素基丙烯酸酯的细胞培养液中培养5小时。荧光成像显示2-(3-乙酰基)香豆素基丙烯酸酯渗透进细胞内。对照组A细胞内显较强荧光。对照组B不显荧光。见图4。
牛血清中荧光测试：
在37℃条件下，将1μM的2-(3-乙酰基)香豆素基丙烯酸酯分别加入到不同浓度的牛血清溶液（0,0.01,0.05,0.2,0.5,1）中培养20分钟。荧光酶标仪检测荧光强度，结果显示2-(3-乙酰基)香豆素基丙烯酸酯可成功的应用于生物液体中，且血清浓度越大，荧光越强。见图5。
Claims (1)
1.2-(3-乙酰基)香豆素基丙烯酸酯荧光探针在检测PBS/乙醇缓冲液中的半胱氨酸的应用，其中所述2-(3-乙酰基)香豆素基丙烯酸酯化学结构式如式(I)所示：
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410064348.7A CN103773361B (zh) | 2014-02-25 | 2014-02-25 | 一种以香豆素为母核的半胱氨酸荧光探针及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410064348.7A CN103773361B (zh) | 2014-02-25 | 2014-02-25 | 一种以香豆素为母核的半胱氨酸荧光探针及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103773361A CN103773361A (zh) | 2014-05-07 |
| CN103773361B true CN103773361B (zh) | 2015-04-22 |
Family
ID=50566136
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410064348.7A Expired - Fee Related CN103773361B (zh) | 2014-02-25 | 2014-02-25 | 一种以香豆素为母核的半胱氨酸荧光探针及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103773361B (zh) |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104893710B (zh) * | 2015-04-08 | 2016-09-07 | 辽宁大学 | 一种荧光探针及其制备方法和应用 |
| CN105669661B (zh) * | 2016-03-14 | 2019-02-01 | 深圳大学 | 一种半胱氨酸检测试剂及其制备方法 |
| CN105820810B (zh) * | 2016-04-27 | 2018-03-30 | 中南大学 | 一种识别半胱氨酸和同型半胱氨酸新型荧光探针的合成与应用 |
| CN106432164B (zh) * | 2016-09-26 | 2018-10-16 | 山西大学 | 一种香豆素衍生物docopa及其制备方法和应用 |
| CN106588855A (zh) * | 2016-12-09 | 2017-04-26 | 济南大学 | 一种新型检测水溶性环境中生物硫醇的荧光探针及其制备方法和应用 |
| CN106632212A (zh) * | 2016-12-19 | 2017-05-10 | 济南大学 | 一种检测细胞内半胱氨酸的荧光探针 |
| CN107056769A (zh) * | 2017-04-07 | 2017-08-18 | 济南大学 | 一种l‑半胱氨酸荧光探针及其制备方法 |
| CN108383774B (zh) * | 2018-04-04 | 2020-05-05 | 郑州大学 | 一种基于端基炔酮的半胱氨酸荧光探针及其制备和应用 |
| CN108383819B (zh) * | 2018-04-04 | 2020-03-31 | 郑州大学 | 一种基于香豆素酮醛的半胱氨酸荧光探针及其制备和应用 |
| CN110894193B (zh) * | 2018-09-13 | 2022-04-22 | 南京大学 | 一种新型荧光探针的合成及在检测半胱氨酸中的应用 |
| CN109232499A (zh) * | 2018-11-07 | 2019-01-18 | 长沙理工大学 | 水溶性香豆素基荧光探针的合成及其生化应用 |
| CN110082321B (zh) * | 2018-11-30 | 2020-06-16 | 中山大学 | 一种用于检测水体中多类有机胺的荧光纳米材料及其应用 |
| CN113999218B (zh) * | 2021-12-03 | 2023-06-09 | 德州学院 | 黄酮醇类化合物及制备方法与其在检测生物硫醇中的应用 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3525753A (en) * | 1966-09-21 | 1970-08-25 | Hickson & Welch Ltd | Coumarin derivatives having optical whitening properties |
| CN101578308A (zh) * | 2007-01-17 | 2009-11-11 | 旭硝子株式会社 | 斥油性共聚物及其制造方法以及斥油性处理液 |
| CN102234261A (zh) * | 2010-04-26 | 2011-11-09 | 中国科学院理化技术研究所 | 检测生物巯基化合物的荧光探针及其合成方法与应用 |
| CN103570701A (zh) * | 2013-11-01 | 2014-02-12 | 山西大学 | 一种香豆素衍生物及其制备方法和应用 |
-
2014
- 2014-02-25 CN CN201410064348.7A patent/CN103773361B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3525753A (en) * | 1966-09-21 | 1970-08-25 | Hickson & Welch Ltd | Coumarin derivatives having optical whitening properties |
| CN101578308A (zh) * | 2007-01-17 | 2009-11-11 | 旭硝子株式会社 | 斥油性共聚物及其制造方法以及斥油性处理液 |
| CN102234261A (zh) * | 2010-04-26 | 2011-11-09 | 中国科学院理化技术研究所 | 检测生物巯基化合物的荧光探针及其合成方法与应用 |
| CN103570701A (zh) * | 2013-11-01 | 2014-02-12 | 山西大学 | 一种香豆素衍生物及其制备方法和应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Convenient Synthesis of 3-Vinyl and 3-Styryl Coumarins;GORDO等;《Org. Lett.》;20111230;第13卷(第19期);第5112-5115页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103773361A (zh) | 2014-05-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103773361B (zh) | 一种以香豆素为母核的半胱氨酸荧光探针及其应用 | |
| CN106279278B (zh) | 一种具有线粒体靶向和双光子性质的硫化氢分子荧光探针及其制备方法和应用 | |
| Liu et al. | A two-photon fluorescent probe for imaging hydrogen sulfide in living cells | |
| Zhang et al. | A simple and readily available fluorescent turn-on probe for cysteine detection and bioimaging in living cells | |
| Shi et al. | A colorimetric and fluorescent probe for thiols based on 1, 8-naphthalimide and its application for bioimaging | |
| CN107602502B (zh) | 一种用于生物硫醇检测的esipt型荧光探针及应用 | |
| Liang et al. | A lysosome-targetable turn-on fluorescent probe for the detection of thiols in living cells based on a 1, 8-naphthalimide derivative | |
| CN108129428B (zh) | 一种检测亚硫酸氢根的比率荧光探针及其应用 | |
| CN105802606B (zh) | 一种含巯基氨基酸荧光探针的制备及应用 | |
| CN107056769A (zh) | 一种l‑半胱氨酸荧光探针及其制备方法 | |
| CN113683631B (zh) | 一种有机硼酸类葡萄糖探针及其制备方法和应用 | |
| Zhang et al. | A novel naphthalene-based fluorescent probe for highly selective detection of cysteine with a large Stokes shift and its application in bioimaging | |
| CN105985769B (zh) | 一种苯硫酚荧光探针的制备及应用 | |
| CN106631980B (zh) | 一种水溶性的生物硫醇双光子荧光探针及其制备方法和应用 | |
| CN109651249A (zh) | 一种检测细胞内质网半胱氨酸的荧光探针及其合成和应用 | |
| CN106929006B (zh) | 一种以萘酰亚胺为母核的识别半胱氨酸和同型半胱氨酸荧光探针及其制备与应用 | |
| CN103951673B (zh) | 一种试剂及其在硫醇检测中的应用 | |
| CN106518855B (zh) | 一种以半川菁及黄酮醇为荧光团的二氧化硫衍生物比例荧光探针及其应用 | |
| CN109928940A (zh) | 基于碱性蓝-3的检测次氯酸的近红外荧光探针分子的制备 | |
| CN107417638B (zh) | 一种基于7-硝基苯呋咱的谷胱甘肽和半胱氨酸荧光探针及其制备方法 | |
| CN111057057B (zh) | 一种用于半胱氨酸特异性检测的荧光化合物及制备方法 | |
| CN110894193B (zh) | 一种新型荧光探针的合成及在检测半胱氨酸中的应用 | |
| CN108148056B (zh) | 比率型近红外半胱氨酸荧光探针 | |
| Erdemir et al. | Design and fabrication of a novel “turn-on” NIR fluorescent sensor based on triphenylamine-isophorone for cysteine sensing and its application to drug analysis and bioimaging | |
| CN111116511A (zh) | 一种苯并噻唑类生物硫醇探针及其制备方法和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20150422 Termination date: 20180225 |