CN109928940A

CN109928940A - 基于碱性蓝-3的检测次氯酸的近红外荧光探针分子的制备

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Publication number: CN109928940A
Application number: CN201910228308.4A
Authority: CN
Inventors: 吕光磊; 郑武斌; 杨佳佳; 沈扬; 李春霞
Original assignee: Zhejiang Normal University CJNU
Current assignee: Zhejiang Normal University CJNU
Priority date: 2019-03-25
Filing date: 2019-03-25
Publication date: 2019-06-25
Anticipated expiration: 2039-03-25
Also published as: CN109928940B

Abstract

本发明涉及基于碱性蓝‑3的检测次氯酸的近红外荧光探针分子的制备。该近红外荧光探针分子是基于碱性蓝‑3的衍生物作为次氯酸响应的荧光探针分子，具有响应时间短、灵敏度高等优点，从而为检测某些病变组织中微量的次氯酸提供了可能。本发明的优点是：合成的探针分子具有迅速的次氯酸响应、良好的特异性和较低的检测限，为实现病变组织中微量次氯酸提供了可能；通过调整苯胺对位官能团的取代基可以设计合成一系类对次氯酸响应的探针分子。

Description

基于碱性蓝-3的检测次氯酸的近红外荧光探针分子的制备

技术领域

本发明涉及基于碱性蓝-3(BB-3)类化合物作为次氯酸响应的荧光探针分子，该类探针分子具有响应时间短、灵敏度高等优点，从而为检测某些病变组织中微量的次氯酸提供了可能。

背景技术

活性氧(ROS)是需氧细胞在代谢过程中产生一系列活性氧，包括：O^2-、H₂O₂及HClO等。次氯酸是最重要的ROS之一，它是由过氧化氢和氯离子在髓过氧化物酶(MPO)催化作用下产生，在生物体内担当维持氧化还原平衡和抵御病原体等角色。但是，过度表达的次氯酸就会引起氧化应激，从而造成各种疾病，包括心血管疾病、神经退行性疾病、动脉粥样硬化等。因此，开发一种可靠、精准以及能够在生理水平条件下检测次氯酸的分析方法是至关重要的。目前为止，检测次氯酸的主要方法有：比色法、电位分析法、化学发光法、库仑滴定法和荧光分析法等。在众多的分析方法之中，荧光分析法以其操作简便、响应迅速和高灵敏度被广泛应用于生物组织中的次氯酸检测。但是，目前所报道的次氯酸检测探针具有灵敏度低、响应速度慢以及合成复杂等缺点。近些年有一些有机小分子荧光探针被用于次氯酸检测，按发光母核的不同大致可以分为：豆香素、BODIPY、花青染料等，但以碱性蓝-3(BB-3)为原料合成的近红外次氯酸检测探针并未有相关报道。为了进一步探索HClO的致病机理，需开发一种基于碱性蓝-3的制备简单、响应迅速、高特异性以及能够实现实时监测的次氯酸荧光探针分子的制备方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种制备简单、响应迅速、高特异性的HClO响应荧光探针。该类探针为检测病变组织部位的次氯酸，探索次氯酸与其关联疾病之间的相关性提供了可能。

本发明解决其技术问题采用以下的技术方案：

本发明提供的近红外荧光探针分子，是一种基于碱性蓝-3的检测次氯酸的近红外荧光探针分子，其结构式为：

上述结构式中：X为不同的吸电子基团和供电子基、氢原子，烷基或环烷基，取代的烷基或环烷基。

所述的近红外荧光探针分子，可以采用6个碳以下的烷基或环烷基，这样可以验证不同烷基取代次氯酸探针的相关性质。

所述的近红外荧光探针分子，用于制备响应迅速、非侵入式的特异性检测次氯酸探针，特别是用于特异性检测次氯酸。

本发明提供的近红外荧光探针分子的制备方法，采用以下合成路线方法制备上述基于碱性蓝-3的检测次氯酸的荧光探针分子：

上述合成路线中：BB-3是碱性蓝-3，BC是碱性蓝-3酰氯化后的产物，2是对位不同取代基苯胺，BC-X是方案实施后得到的一系类目标荧光探针分子。

上述制备方法，其制备过程是：

(1)制备化合物BC：

称取化合物BB-3和Na₂CO₃溶解到水和二氯甲烷的混合溶液中，将保险粉溶于水中缓慢注入反应体系，N₂保护40℃反应1h；在干燥的三口瓶内加入Na₂CO₃，然后将上述反应液移入到三口瓶中，缓慢滴加三光气的二氯甲烷溶液，在氮气氛围下保持40℃反应；反应结束后，反应液用二氯甲烷-水的体系进行萃取，滤液用无水硫酸钠干燥，柱层析分离；

(2)制备化合物BC-X：

将化合物BC、碳酸钠和化合物2加入二氯甲烷溶剂中，40℃反应8h，柱层析得到最终化合物。

上述制备过程可以采用以下具体步骤：

(1)制备化合物BC：

称取1.0g化合物BB-3和297mg的Na₂CO₃溶解到8.0mL水和4.0mL二氯甲烷的混合溶液中，将487mg保险粉溶于10.0mL水中缓慢注入反应体系，N₂保护40℃反应1h；在干燥的三口瓶内加入297mg Na₂CO₃，然后将上述反应液移入到三口瓶中，将125mg三光气溶于8.0mL二氯甲烷后缓慢滴加到反应溶液中；在氮气氛围下保持40℃反应3h，反应结束后，反应液用二氯甲烷-水的体系进行萃取，滤液用无水硫酸钠干燥，柱层析分离；

(2)制备化合物BC-X：

将50mg的化合物BC，55.4mg的碳酸钠和4eq的化合物2，加入5.0mL二氯甲烷溶剂中，40℃反应8h，柱层析得到最终化合物。

本发明制备过程可以通过调整苯胺对位官能团的取代基，设计合成一系类对次氯酸响应的探针分子，以便实现次氯酸检测探针平台的构筑。

本发明制备的近红外荧光探针分子，其用于制备响应迅速、非侵入式的特异性检测次氯酸探针，特别是用于特异性检测次氯酸。

本发明制备的近红外荧光探针分子，在其应用过程中，次氯酸通过诱导酰胺键断裂，释放出具有荧光发射的氧化态的碱性蓝-3。

本发明与现有技术相比，具有以下主要的优点：

1.首次利用了碱性蓝-3(BB-3)的氧化态形式与还原态形式前后荧光变化的特性设计次氯酸响应探针，这种近红外荧光增强的次氯酸响应方式为生物组织成像提供保障。

2.合成的探针分子具有迅速的次氯酸响应、良好的特异性和优异的灵敏性，为实现病变组织中微量次氯酸提供了可能。

3.本发明设计方法可以通过调整苯胺对位官能团的取代基设计合成一系类对次氯酸响应的探针分子，实现BB-3衍生物的次氯酸检测探针的平台构筑。合成的探针分子荧光强度的变化呈现浓度依赖性，可以实现特定区域的次氯酸浓度定量检测，为实现生理水平上的次氯酸检测提供了可能。

附图说明

图1为BC-2和BC-3在pH值为7.4的磷酸缓冲溶液中对不同浓度次氯酸的荧光增强光谱与相应的线性拟合曲线，反应时间2min，探针浓度10μM，次氯酸的浓度0-0.2μM。图1中，图A是施例1分子BC-3的荧光滴定曲线图，图B是施例1分子BC-3的滴定线性拟合图，图C是施例2分子BC-2的荧光滴定曲线图，图D是施例2分子BC-2的滴定线性拟合图。

图2为化合物BC-2与BC-3在pH值为7.4的磷酸缓冲溶液中对不同次氯酸浓度的响应时间示意图，探针浓度10μM；图2中，图A是BC-3对0.1-0.4μM次氯酸的时间响应曲线，图B是BC-2对0.025-0.1μM次氯酸的响应曲线。

图3为化合物BC-3在pH值为7.4的磷酸缓冲溶液中对不同活性物种的特异性检测结果示意图，探针浓度10μM，次氯酸浓度为0.2μM，其他活性物种浓度为分别选用1倍、10倍和20倍浓度。

图4为化合物BC-2在pH值为7.4的磷酸缓冲溶液中对5种不同活性物种的特异性检测结果示意图，探针浓度10μM，次氯酸浓度为0.2μM，其他活性物种浓度为分别选用1倍、10倍和20倍浓度。

图5为化合物BC-2与BC-3在pH值为7.4的磷酸缓冲溶液中对不同阴离子选择性测试结果示意图，探针浓度10μM，次氯酸浓度为0.2μM；图5中，图A是BC-3对500倍阴离子的选择性检测图，图B是BC-2对100倍阴离子的选择性检测图。

图6为化合物BC-2与BC-3在pH值为7.4的磷酸缓冲溶液中对不同阳离子的选择性测试结果示意图，探针浓度10μM，次氯酸浓度为0.2μM；图6中，图A是BC-3对100倍阳离子的选择性检测图，图B是BC-2对100倍阳离子的选择性检测图。

图7为化合物BC-3在pH值为7.4的磷酸缓冲溶液中对16种不同氨基的选择性测试结果示意图，探针浓度10μM，次氯酸浓度为0.2μM，16种氨基酸浓度为80μM。

图8为化合物BC-2在pH值为7.4的磷酸缓冲溶液中对16种不同氨基的选择性测试结果示意图，探针浓度10μM，次氯酸浓度为0.2μM，16种氨基酸浓度为80μM。

图9为化合物BC-3在不同pH值的磷酸缓冲溶液中对次氯酸的响应结果示意图，探针浓度10μM，次氯酸浓度为0.2μM。

图10为化合物BC-2在不同pH值的磷酸缓冲溶液中对次氯酸的响应结果示意图，探针浓度10μM，次氯酸浓度为0.2μM。

图11为化合物BC-2与BC-3在pH值为5的磷酸缓冲溶液中对5种不同活性物种的选择性结果示意图，探针浓度10μM，次氯酸浓度为0.2μM，活性物种浓度为2.0μM。

图12为发光母核BB-3在三种不同缓冲体系的高浓度次氯酸条件下的稳定性测试结果示意图，探针浓度10μM，次氯酸浓度为50μM，缓冲体系分别为磷酸缓冲溶液(PBS)、RPMI-1640培养基、高糖培养基(DMEM)。

具体实施方式

下面将结合实施例及附图对本发明作进一步说明，但不限定本发明。

实施例1

本实施例提供的近红外荧光探针分子，是一种基于碱性蓝-3的检测次氯酸的近红外荧光探针分子，其结构式为：

所述的近红外荧光探针分子，可以采用6个碳以下的烷基或环烷基。

下述实施例制备了两个化合物BC-2和BC-3，以其为案例做详细的说明。

上述图中，BB-3为碱性蓝-3分子，BC为BB-3酰氯化后产物，3为对异丙基苯胺，4为对甲氧基苯胺，BC-2与BC-3为方案实施得到的目标分子。

化合物BC的制备：称取BB-3(1.0g，0.7mmol，25％)，碳酸钠(297mg，2.8mmol)溶于8.0mL水和4.0mL二氯甲烷的混合溶液中，再将保险粉(487mg，2.8mmol)溶于10.0mL水中缓慢注入反应体系，N₂保护40℃反应1h。在干燥的三口烧瓶内加入碳酸钠(297mg，2.8mmol)，然后将上述反应液移入三口烧瓶，在低温条件下缓慢滴加三光气(125mg，0.42mmol)的二氯甲烷溶液。反应在氮气氛围下保持40℃反应3h，反应结束后，反应液用二氯甲烷-水的体系进行萃取，滤液用无水硫酸钠干燥，减压浓缩，柱层析分离提纯就可以得到化合物BC(白色固体，66.8％；乙酸乙酯:石油醚＝1:40)。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ＝7.38(d,J＝9.7Hz,2H),6.39(dd,J＝5.6,2.6Hz,4H),3.33(t,J＝7.1Hz,8H),1.16(t,J＝7.1Hz,12H).

HR-MS(ESI,m/z):calcd for C₂₁H₂₆N₃O₂Cl[M+H]⁺,388.1747,found 388.1787.

实施例2(BC-2)：

化合物BC-2的制备：向100mL的schlenk管中加入化合物BC(50mg,0.13mmol)，Na₂CO₃(55.4mg,0.52mmol)，对异丙基苯胺(70.3mg,0.52mmol)，加入溶剂二氯甲烷(5.0mL)。反应液在40℃下反应8h直至反应完全。反应结束后，反应液冷却到室温，减压浓缩，柱层析分离提纯就可以得到化合物BC-2(淡蓝色固体，64.8％；乙酸乙酯:石油醚＝1:10)。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ＝7.43–7.37(m,2H),7.35(d,J＝8.5Hz,2H),7.23(s,1H),7.15(d,J＝8.4Hz,2H),6.44(s,4H),3.36(q,J＝7.0Hz,8H),2.87(dt,J＝13.8,6.9Hz,1H),1.26–1.16(m,18H).

¹³C NMR:(100MHz,CDCl₃)δ＝153.25,152.50,146.81,143.86,136.22,126.77,125.04,119.73,117.60,106.74,100.07,44.65,33.54,24.13,12.58.

HR-MS(ESI,m/z):calcd for C₃₀H₃₈N₄O₂[M+H]⁺,487.3028,found 487.3076.

实施例3(BC-3)：

化合物BC-3的制备：向100mL的schlenk管中加入化合物BC(50mg,0.13mmol)，Na₂CO₃(55.4mg,0.52mmol)，对甲氧基苯胺(64.0mg,0.52mmol)，加入溶剂二氯甲烷(5.0mL)。反应液在40℃下反应8h直至反应完全。反应结束后，反应液冷却到室温，减压浓缩，柱层析分离提纯就可以得到化合物BC-3(灰白色固体，65.3％；乙酸乙酯:石油醚＝1:5)。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ＝7.40–7.35(m,2H),7.32(d,J＝9.0Hz,2H),7.15(s,1H),6.82(d,J＝9.0Hz,2H),6.43(d,J＝2.7Hz,4H),3.77(s,3H),3.34(q,J＝7.0Hz,8H),1.16(t,J＝7.0Hz,12H).

¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ＝155.82,153.60,152.49,146.80,131.59,125.06,121.69,117.58,114.04,106.72,100.04,55.50,44.64,12.57.

HR-MS(ESI,m/z):calcd for C₂₈H₃₄N₄O₃[M+H]⁺,475.2664,found 475.2735.

为了测试与生理环境相契合，实验所有数据皆在磷酸缓冲溶液(PBS)中进行，PBS是生物化学研究中使用最为广泛的一种缓冲液。我们用荧光的方法探索了BB-3衍生物BC-X是否能够响应次氯酸。如果可以响应次氯酸，响应之后荧光就会增强，反之荧光不会发生变化。通过由实施案例合成的化合物BC-2和BC-3对0-0.2μM不同浓度的次氯酸进行检测所得到的光谱变化曲线(附图1)，我们可知该类探针分子针对次氯酸呈现浓度依赖性响应，可以实现次氯酸的定量检测。通过计算得出该类探针对次氯酸的检测限(LOD)都低于0.1nM，该类探针的检测限是目前所有报道的探针中最低的，这就使该类探针能够更好地响应病变组织中微量的次氯酸，从而为探索HClO与其关联疾病发病之间的相关性提供了可能。

由实施案例合成的化合物BC-2和BC-3都对次氯酸表现出了快速的响应能力(图2)，两者荧光强度基本在20s后达到平衡。较短的响应时间为该类探针分子实时监测生物组织中的次氯酸提供了可能，避免了长时间检测带来的干扰。

为了研究该类探针分子对次氯酸响应的特异性，我们选用5种不同的活性物种进行探针特异性分析(图3和图4)，即使其他物种的加入量是次氯酸的20倍，该类探针分子对次氯酸依旧展现出最强的荧光响应。除此之外，我们还选用了一系类的阴阳离子来验证探针的选择性(图5和图6)，当加入500倍不同阴离子与100倍阳离子时BC-3的荧光强度基本无增强，当加入100倍不同阴阳离子时BC-2的荧光强度基本无增强，这就排除了阴阳离子对BC-3和BC-2检测次氯酸的干扰。人体富含多种氨基酸，为了验证氨基酸对次氯酸的检测是否造成干扰，我们选用16种氨基酸进行验证(图7和图8)，结果表明即使加入400倍的氨基酸，探针分子的荧光基本无增强，这就排除了氨基酸对次氯酸检测的干扰。人体不同组织的生理环境有不同的pH值，我们进一步探索了该类探针分子在不同pH下的探针的稳定性和响应能力。实验证实在pH值为5-9之间这两个探针分子都能很好地响应次氯酸(图9和图10)。溶酶体(lysosomes)为真核细胞中的一种细胞器，其最适宜的生存环境为pH值等于5。因此，我们选择pH值为5的磷酸缓冲溶液进行相应的活性物种选择性测试(图11)，实验结果表明即使于10倍浓度的其他活性物种相比探针分子对次氯酸展现出良好的特异性。除此之外，我们还探索了发光母核BB-3在不同缓冲体系中的稳定性(图12)，试验结果证实即使在高浓度次氯酸条件下，发光母核BB-3在三种复杂缓冲体系中的荧光强度基本保持不变，表明该类探针能够在复杂的生理环境中实现次氯酸检测。综上所述，BC-2和BC-3对次氯酸的检测呈现良好的选择性和响应性，能够实现在生理水平上进行次氯酸检测的可能。

本发明的优点在于首次利用了碱性蓝-3(BB-3)的氧化态形式与还原态形式前后荧光变化的特性设计次氯酸响应探针。合成的探针分子具有迅速的次氯酸响应、良好的特异性和优异的灵敏性，为实现病变组织中微量次氯酸提供了可能。除此之外，本发明设计方法以酰胺键作为次氯酸响应位点，通过调整苯胺对位官能团的取代基设计合成一系类对次氯酸响应的探针分子，首次实现了BB-3衍生物的次氯酸检测探针的平台构筑。合成的探针分子荧光强度的变化呈现浓度依赖性，可以实现特定区域的次氯酸浓度定量检测，为实现生理水平上的次氯酸检测提供了可能。

上述实施例为本发明的优选例，并不用来限制本发明，凡在本发明的原则之内，所做的任何修改、变化、变通或替换方案，均在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种近红外荧光探针分子，其特征是一种基于碱性蓝-3的检测次氯酸的近红外荧光探针分子，其结构式为：

2.根据权利要求1所述的近红外荧光探针分子，其特征是采用6个碳以下的烷基或环烷基。

3.根据权利要求1或2所述的近红外荧光探针分子，用于制备响应迅速、非侵入式的特异性检测次氯酸探针。

4.一种近红外荧光探针分子的制备方法，其特征是采用以下合成路线方法制备权利要求1或2所述的荧光探针分子：

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于制备过程是：

(1)制备化合物BC：

(2)制备化合物BC-X：

6.根据权利要求5所述的荧光探针分子的制备方法，其特征在于制备过程是：

(1)制备化合物BC：

(2)制备化合物BC-X：

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于通过调整苯胺对位官能团的取代基设计合成一系类对次氯酸响应的探针分子。

8.权利要求4至8中任一所述方法制备的近红外荧光探针分子的应用，其特征在于用于制备响应迅速、非侵入式的特异性检测次氯酸探针。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于应用过程中，次氯酸通过诱导酰胺键断裂，释放出具有荧光发射的氧化态的碱性蓝-3。