CN102234261A - 检测生物巯基化合物的荧光探针及其合成方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种检测生物巯基化合物的荧光探针及其合成方法和用途。该荧光探针的结构式如式I所示，式I中，R¹、R²各自独立地选自氢、1-5个碳原子的烷基和3-8个碳原子的环烷基中的一种；R³、R⁴、R⁵独立的选自氢或1～5个碳原子的烷基；在多种有机溶剂或有机溶剂/水混合体系中，该荧光探针对生物巯基化合物还原型谷胱甘肽和半胱氨酸有很好的选择性，而其他氨基酸类对检测没有干扰。探针分子在加入巯基化合物后发射光谱强度明显增加。

Description

检测生物巯基化合物的荧光探针及其合成方法与应用

技术领域

本发明涉及高选择性检测生物巯基化合物的荧光探针及其合成方法与应用。

背景技术

生物细胞内含有一些维持正常生理活性并保护细胞免受外来物质伤害的小分子化合物，它们主要是通过所含的巯基-SH而发挥生理作用的，巯基(-SH)是细胞中化学活性最高的基团。由于巯基的强配位能力和还原性，它们可以与重金属离子结合，或清除掉人体内的活性氧，在细胞的抗氧化系统中具有重要的作用。这些含巯基的小分子化合物包括半胱氨酸(Cysteine)、高胱氨酸(Homocysteine)、还原型谷胱甘肽(Glutathione，GSH)等。以还原型谷胱甘肽为例，它的一个重要功能是与重金属离子如Hg等相结合生成稳定的配合物，促使其排出体外，起到解毒作用。而且还原型谷胱甘肽也能与外源毒素及其代谢物发生结合反应，最终生成硫醇脲酸经尿排出。这样能起到保护肝脏，促进胆酸代谢的作用，从而促进消化道吸收脂溶性维生素。还原型谷胱甘肽在氧化应激时可被氧化成氧化型谷胱甘肽(GSSG)，体内存在GSSG与GSH的氧化还原动态平衡，因此GSH与GSSG的相对含量成为了评估脂质过氧化损伤的重要指标。

半胱氨酸和还原型谷胱甘肽是生物体内重要的抗氧化剂。它们在人体红细胞中含量很高，可以使红细胞膜蛋白的巯基保持还原状态而不变性，这对于有效防止溶血具有重要意义。而且还可以保护血红蛋白不受载氧过程中产生的内源O₂ ^-、HO·等自由基氧化，从而使它持续正常在发挥运输氧的能力。红细胞中部分血红蛋白在H₂O₂等氧化剂的作用下，发生著名的Fenton反应，其中Fe²⁺氧化为Fe³⁺，使血红蛋白转变为高铁血红蛋白而失去了携氧能力。半胱氨酸和还原型谷胱甘肽都能直接与H₂O₂等氧化剂结合，分别生成胱氨酸和氧化型谷胱甘肽，将高铁血红蛋白还原为血红蛋白，这样即保证了血红蛋白携氧过程的稳定。

随着-SH官能团在生物体系中的重要作用逐渐被认识，鉴别和定量测定生物巯基化合物日益受到关注。传统的检测方法有硝普盐法、碘量法、电流分析法、分光光度法、比色法等，但这些方法灵敏度低，不能适应有些生物样品中巯基化合物的测定，因此需要合成一些高灵敏的分析检测试剂，新型的荧光-SH衍生试剂成为研究的焦点。-SH荧光探针由于具有灵敏度高、可以直接测定含-SH化合物与试剂的反应速度及可作为生物结构研究的指示系统等优点，而被广泛应用，因此对这些生物巯基化合物的检测具有重要意义。

光化学传感器是近年来迅速发展起来的一个新的科学问题，它的出现显然和超分子科学的进展注入分子组装、主客体化学、非共价相互作用、氢键作用、疏水作用等以及光诱导电子转移(PET)过程、分子内共轭的电荷转移化合物结构及其发光特性等研究密切相关：它的发展也和许多科学技术领域诸如生物化学、临床医学、药物化学以及环境科学中提出的大量实际问题密切相关。由于上述种种原因，有力地推动了光化学传感器的研究发展。光化学传感器按其信号检测方法的不同，主要分为荧光化学传感器和比色化学传感器。荧光化学传感器主要是依靠荧光信号为检测手段，通常有荧光的增强、淬灭或者发光波长的移动，而比色化学传感器主要是借助于色调的变化，通过肉眼观察就可以检测，方便实际应用。对于外来物种进行检测的荧光化学传感器的设计和研究，是近年来受到广泛关注的一个科学问题。

荧光法由于其具有灵敏度高、能够实现对活体甚至单个细胞的实时可视化示踪的优点，成为目前广泛采用检测细胞内巯基类物质的一种重要手段。生物体内存在巯基和二硫键的氧化还原动态平衡，因此可以利用巯基和二硫键的氧化还原反应来设计检测硫醇的探针。

发明内容

本发明的目的是提供一种性能优良、适用于检测巯基化合物的以香豆素为荧光团的荧光探针。

本发明所提供的荧光探针的结构式如式I所示：

(式I)

其中，R¹、R²各自独立地选自氢、1-5个碳原子的烷基和3-8个碳原子的环烷基中的一种；R³、R⁴、R⁵独立的选自氢或1-5个碳原子的烷基；

所述的R¹、R²中的1-5个碳原子的烷基具体可以分别是或者同时为甲基，乙基，丙基，烯丙基，异丙基，丁基，异丁基，戊基和异戊基中的一种；

所述的R¹、R²中的3-8个碳原子的环烷基具体可以分别或者同时为环丙烷基，环丁烷基，环戊烷基，环己烷基或环庚烷基中的一种；

所述的R³、R⁴、R⁵中的1-5个碳原子的烷基具体可以分别或者同时为甲基，乙基，丙基，异丙基，丁基，异丁基，叔丁基和戊基中的一种。

本发明所提供的荧光探针的制备方法，包括下述步骤：

1)将式II所示的化合物和式III所示的化合物在六氢吡啶存在下，于干燥有机溶剂中进行Knoevenage缩合反应，反应完全后，将反应体系冷却至室温，除去所述有机溶剂；然后加入酸进行回流反应，待反应完全，将反应液冷却至室温，加入冰水，并用碱调节所述反应液的pH值至有大量的黄褐色固体析出；继续搅拌然后放置过夜，用甲苯或乙醇重结晶得到浅黄色晶体，即为式IV所示的化合物；

(式II)                       (式III)                     (式IV)

其中，式II中的R¹、R²、R³、R⁴均与式I相同，式III中的R⁵与式I相同；

2)将POCl₃溶于干燥的二甲基甲酰胺中，并向其中滴加式IV所示的化合物的二甲基甲酰胺溶液，待滴加完毕，反应液加热回流，反应完毕有固体析出；将反应液倒入冰水中，然后用碱调节反应液的pH值至有大量固体析出，即得到式V所示的化合物；

(式V)

3)将式V所示化合物和2，2’-二氨基二苯二硫醚溶于干燥有机溶剂中，惰性气体保护下加热回流，反应完全后，减压除去所述有机溶剂，得到式I所示化合物。

其中，步骤1)所述缩合反应中式II所示的化合物和式III所示的化合物的摩尔比可为1∶1；所述缩合反应可在加热回流的条件下进行8至12小时；步骤1)中所述酸具体可为醋酸和质量浓度为37％盐酸以体积比1∶1混合得到的混酸；步骤1)中所述碱为质量浓度10％-20％的氢氧化钠水溶液。

步骤2)中POCl₃与式IV所示的化合物的摩尔比为1.5∶1；步骤2)中所述加热回流的时间可为0.5-2小时。

步骤3)中式V所示化合物和2，2’-二氨基二苯二硫醚的摩尔比为2∶1；步骤3)中所述加热回流的时间为3-5小时；步骤1)和步骤3)中所述干燥的有机溶剂选自下述任意一种：甲醇，乙醇、乙腈、二甲亚砜和二甲基甲酰胺。

所述方法还包括对步骤3)得到的式I所示化合物用柱层析进行纯化的步骤，具体方法如下：将式I所示化合物的四氢呋喃溶液加入以200-300目硅胶为填料的层析柱，采用体积比为1∶2的乙酸乙酯与石油醚的混合液作为流动相进行洗脱，分段收集，通过薄层色谱检测反应，在硅胶板上以体积比为1∶2的乙酸乙酯与石油醚的混合液为展开剂，合并Rf值为0.3的组分，除去溶剂，得到纯化的式I所示化合物。

本发明的再一个目的是提供式I所示化合物的应用。

本发明所提供的应用是式I化合物作为荧光探针在检测巯基化合物中的应用。

所述巯基化合物具体可为具有生物活性的巯基化合物，优选为半胱氨酸或还原型谷胱甘肽。

利用本发明的荧光探针检测生物巯基化合物时没有特殊的限制，可以将探针分子溶解在生理盐水或Tris-HCl的缓冲水溶液中；或者将探针分子溶解在甲醇，乙醇、乙腈、二甲亚砜，二甲基甲酰胺、四氢呋喃(THF)等有机溶剂中；或者水和上述有机溶剂任意比例的混合溶剂，然后在溶解有探针分子的上述溶液中加入生物巯基化合物。当加入巯基化合物后，会使探针分子的荧光强度明显增强，可通过检测荧光强度确定巯基化合物的含量。

本发明提供了一种以香豆素为母体，用于检测生物巯基化合物的荧光探针。该荧光探针对生物巯基化合物还原型谷胱甘肽和半胱氨酸有很好的选择性，苯丙氨酸、苏氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬酰氨酸、亮氨酸、丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸、氨基乙酸、赖氨酸、谷氨酸、丝氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、色氨酸等氨基酸对监测没有影响。该荧光探针选择性良好，并且结构简单，合成方法简单且效率高，使得极易推广应用。

附图说明

图1为实施例1制备的荧光探针-化合物对还原型谷胱甘肽与半胱氨酸的识别作用(荧光发射光谱图)；其中，1为荧光探针的荧光发射光谱图，2为荧光探针+还原型谷胱甘肽的荧光发射光谱图，3为荧光探针+半光氨酸的荧光发射光谱图，。

图2为实施例1制备的荧光探-化合物对各种氨基酸的选择性识别；横坐标为波长(522nm)，纵坐标为荧光强度。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明做进一步的说明，但本发明并不局限于此。

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1、制备式I中R¹、R²均为乙基，R³、R⁴、R⁵均为氢的化合物

(1)将1摩尔4-N，N-二乙基氨基水杨醛和1摩尔丙二酸二乙酯溶于干燥乙醇中，室温搅拌下加入1.5mol六氢吡啶，加热回流反应8小时。反应完成后，冷却至室温，旋转蒸发去除溶剂，然后加入混酸(HOAc/37％HCl；v∶v＝1∶1)继续升温回流反应6小时，待反应完全，反应液冷却至室温，加入冰水，再以20％NaOH溶液调节溶液的pH值至有大量的黄褐色固体析出。继续搅拌然后放置过夜，用甲苯或乙醇重结晶得到浅黄色晶体，即为7N，N-二乙基氨基香豆素。

结构确证数据如下：

¹H NMR(CDCl₃)δ7.55(d，1H，ArH)，7.23(d，1H，ArH)，6.59(d，1H，ArH)，6.51(s，1H，ArH)，6.06(d，1H，ArH)，3.42(m，4H，CH₂)，1.21(t，6H，CH₃)。

(2)将1.5molPOCl₃溶于干燥DMF中，缓慢滴加30mL溶有1mol 7-N，N-二乙基氨基香豆素的DMF溶液。待滴加完毕，反应液加热回流1小时，反应完毕有固体析出。将反应液倒入冰水中，然后用20％NaOH水溶液调节反应液的pH值至有大量固体析出。粗产品经过滤、水洗多次、真空干燥，然后用无水乙醇重结晶得到纯净晶体7-N，N-二乙基氨基香豆素-3-甲醛。

结构确证数据如下：

¹H NMR(CDCl₃)δ10.13(s，1H，CHO)，8.26(s，1H，ArH)，7.43(d，1H，ArH，J＝8.9Hz)，6.67(d，1H，ArH，J＝7.6Hz)，6.50(S，1H，ArH)，3.49(m，4H，CH₂，J＝7.1Hz)，1.25(t，6H，CH₃，J＝7.0Hz)。

¹³C NMR(CDCl₃)δ188.0，162.0，159.1，153.6，145.5，132.6，114.5，110.3，108.4，97.3，45.4，12.6。

MS-EI(M+H⁺)：245.1.Found：245.2.

(3)将7-N，N-二乙基氨基香豆素-3-甲醛和2，2’-二氨基二苯二硫醚以摩尔比2∶1溶于干燥乙醇中，惰性气体(如氮气、氩气等)保护下加热回流3小时，反应完成后，减压除去有机溶剂，柱层析法(采用以200-300目硅胶为填料的层析柱，洗脱剂为乙酸乙酯∶石油醚＝1∶2(v/v)，通过薄层色谱检测反应，在硅胶板上以体积比为1∶2的乙酸乙酯与石油醚的混合液为展开剂，合并Rf值为0.3的组分)分离得到目标产物。

结构确证数据如下：

¹H NMR(CDCl₃)δ7.83(s，2H，ArH)，7.52(m，4H，ArH)，7.41(m，2H，ArH)，7.31(m，4H，ArH)，7.23(m，2H，ArH)，6.69(d，2H，ArH)，6.49(d，2H，ArH)，3.36(m，8H，CH₂)，1.10(t，12H，CH₃)。

MS-EI(M+H⁺)：702.23.Found：702.35.

实施例2、制备式I中R¹、R²均为甲基，R³、R⁴、R⁵均为氢的化合物

(1)将1摩尔4-N，N-二甲基氨基水杨醛和1摩尔丙二酸二乙酯溶于干燥乙醇中，室温搅拌下加入1.5mol六氢吡啶，加热回流反应8小时。反应完成后，冷却至室温，旋转蒸发去除溶剂，然后加入混酸(HOAc/37％HCl；v∶v＝1∶1)继续升温回流反应，待反应完全，反应液冷却至室温，加入冰水，再以20％NaOH溶液调节溶液的pH值，有大量的黄褐色固体析出。继续搅拌然后放置过夜，用甲苯或乙醇重结晶得到浅黄色晶体，即为7-N，N-二甲基氨基香豆素。

结构确证数据如下：

¹H NMR(CDCl₃)δ7.97(m，1H，ArH)，7.41(d，1H，ArH)，6.59(m，1H，ArH)，6.49(s，1H，ArH)，6.25(d，1H，ArH)，2.90(m，6H，CH₃)。

(2)将1.5molPOCl₃溶于干燥DMF中，缓慢滴加30ml溶有1mol7-N，N-二甲基氨基香豆素的DMF溶液。待滴加完毕，反应液加热回流2小时，反应完毕有固体析出。将反应液倒入冰水中，然后用NaOH水溶液调节反应液的pH值，有大量固体析出。粗产品经过滤、水洗多次、真空干燥，然后用无水乙醇重结晶得到纯净晶体7-N，N-二甲基氨基香豆素-3-甲醛。

结构确证数据如下：

¹H NMR(CDCl₃)δ9.68(s，1H，CHO)，8.75(s，1H，ArH)，7.41(m，1H，ArH)，6.69(m，1H，ArH)，6.49(S，1H，ArH)，2.92(m，6H，CH₃)。

MS-EI(M+H⁺)：217.07.Found：217.12.

(3)将7-N，N-二甲基氨基香豆素-3-甲醛和2，2’-二氨基二苯二硫醚以摩尔比2∶1溶于干燥乙醇中，惰性气体(如氮气、氩气等)保护下加热回流5小时，反应完成后，减压出去有机溶剂，柱层析法(采用以200-300目硅胶为填料的层析柱，洗脱剂为乙酸乙酯∶石油醚＝1∶2(v/v)，通过薄层色谱检测反应，在硅胶板上以体积比为1∶2的乙酸乙酯与石油醚的混合液为展开剂，合并Rf值为0.3的组分)分离得到目标产物。

结构确证数据如下：

¹H NMR(CDCl₃)δ7.83(s，2H，ArH)，7.52(m，4H，ArH)，7.41(m，2H，ArH)，7.31(m，4H，ArH)，7.23(m，2H，ArH)，6.69(d，2H，ArH)，6.49(d，2H，ArH)，2.94(m，12H，CH₃)。

MS-EI(M+H⁺)：646.17.Found：646.14.

实施例3、检测本发明探针对还原型谷胱甘肽和半胱氨酸的识别作用

使用实施例1中的化合物作为荧光探针，并评价该荧光探针对巯基化合物的选择性，该荧光探针的激发波长为465nm，最大发射波长为522nm。将化合物溶解在THF∶H₂O(v/v＝6∶4，Tris-HCl，pH＝7.6)中，得到浓度为1.0×10^-5摩尔/升的化合物溶液，该化合物的荧光曲线见图1中曲线1。当向上述探针化合物溶液中分别加入是探针化合物10倍摩尔量的还原型谷胱甘肽和半胱氨酸时，溶液的荧光有明显增强，见图1曲线2(探针+还原型谷胱甘肽)和曲线3(探针+半胱氨酸)。由此可知，该化合物是一种良好的识别生物巯基化合物的荧光探针。

实施例4、检测本发明探针对各种氨基酸的选择性识别作用

使用实施例1中的化合物作为荧光探针，并评价该荧光探针对巯基化合物的选择性，该荧光探针的激发波长为465nm，最大发射波长为522nm。将化合物溶解在THF∶H₂O(v/v＝6∶4，Tris-HCl，pH＝7.6)中，得到浓度为1.0×10^-5摩尔/升的化合物溶液。当向上述探针化合物溶液中分别加入是探针化合物10倍摩尔量的苯丙氨酸(Phe)、苏氨酸(Thr)、精氨酸(Arg)、组氨酸(His)、天冬酰氨酸(Asp)、亮氨酸(Leu)、丙氨酸(Ala)、脯氨酸(Pro)、缬氨酸(Val)、氨基乙酸(Gly)、赖氨酸(Lys)、谷氨酸(Glu)、丝氨酸(Ser)、异亮氨酸(Iso)、酪氨酸(Try)、色氨酸(Asp)等各种氨基酸时，该化合物溶液的荧光基本没有变化；当向上述化合物溶液中加入的是还原型谷胱甘肽和半胱氨酸时，化合物荧光增强明显。由上述结果可说明，在将该化合物作为荧光探针时，该荧光探针对生物巯基化合物还原型谷胱甘肽和半胱氨酸有良好的选择性识别和实际应用性。

Claims (10)

1.式I所示的化合物：

(式I)

其中，R¹、R²各自独立地选自氢、1-5个碳原子的烷基和3-8个碳原子的环烷基中的一种；R³、R⁴、R⁵独立的选自氢或1～5个碳原子的烷基。

2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于：所述的R¹、R²中的1-5个碳原子的烷基分别或者同时为甲基，乙基，丙基，烯丙基，异丙基，丁基，异丁基，戊基和异戊基中的一种；

所述的R¹、R²中的3-8个碳原子的环烷基分别或者同时为环丙烷基，环丁烷基，环戊烷基，环己烷基或环庚烷基中的一种；

所述的R³、R⁴、R⁵中的1-5个碳原子的烷基分别或者同时为甲基，乙基，丙基，异丙基，丁基，异丁基，叔丁基和戊基中的一种。

3.根据权利要求1或2所述的化合物，其特征在于：式I所示的化合物为下述1)或2)中的化合物：

1)式I中R¹、R²均为乙基，R³、R⁴、R⁵均为氢的化合物；

2)式I中R¹、R²均为甲基，R³、R⁴、R⁵均为氢的化合物。

4.式I所示化合物的制备方法，包括下述步骤：

1)将式II所示化合物和式III所示化合物在六氢吡啶存在下，于干燥有机溶剂中进行Knoevenage缩合反应，反应完全后，将反应体系冷却至室温，除去所述有机溶剂；然后加入酸进行回流反应，待反应完全，将反应液冷却至室温，加入冰水，并用碱调节所述反应液的pH值至有大量的黄褐色固体析出；并用甲苯或乙醇对所述黄褐色固体进行重结晶得到浅黄色晶体，即为式IV所示的化合物；

(式II)                     (式III)                         (式IV)

其中，式II中的R¹、R²、R³、R⁴均与式I相同，式III中的R⁵与式I相同；

2)将POCl₃溶于干燥的二甲基甲酰胺中，并向其中滴加式IV所示的化合物的二甲基甲酰胺溶液，待滴加完毕，反应液加热回流，反应完毕有固体析出；将反应液倒入冰水中，然后用碱调节反应液的pH值至有大量固体析出，即得到式V所示的化合物；

(式V)

3)将步骤2)所得产物和2，2’-二氨基二苯二硫醚溶于干燥有机溶剂中，惰性气体保护下加热回流，反应完全后，减压除去所述有机溶剂，得到式I所示化合物。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤1)所述缩合反应中式II所示化合物和式III所示化合物的摩尔比为1∶1；所述缩合反应在加热回流的条件下进行8-12小时；步骤1)中所述酸为醋酸和质量浓度为37％盐酸以体积比1∶1混合得到的混酸；步骤1)中所述碱为质量浓度10％-20％的氢氧化钠水溶液。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：步骤2)中POCl₃与式IV所示的化合物的摩尔比为1.5∶1；步骤2)中所述加热回流的时间为0.5-2小时。

7.根据权利要求4-6中任一所述的方法，其特征在于：步骤3)中式V所示化合物和2，2’-二氨基二苯二硫醚的摩尔比为2∶1；步骤3)中所述加热回流的时间为3-5小时；步骤1)和步骤3)中所述干燥的有机溶剂选自下述任意一种：甲醇，乙醇、乙腈、二甲亚砜和二甲基甲酰胺。

8.根据权利要求4-7中任一所述的方法，其特征在于：所述方法还包括对步骤3)得到的式I所示化合物用柱层析进行纯化的步骤，方法如下：将式I所示化合物的四氢呋喃溶液加入以200-300目硅胶为填料的层析柱，采用体积比为1∶2的乙酸乙酯与石油醚的混合液作为流动相进行洗脱，分段收集，通过薄层色谱检测反应，在硅胶板上以体积比为1∶2的乙酸乙酯与石油醚的混合液为展开剂，合并Rf值为0.3的组分，除去溶剂，得到纯化的式I所示化合物。

9.权利要求1-3中任一所述的化合物作为荧光探针在检测巯基化合物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述巯基化合物为具有生物活性的巯基化合物，优选为半胱氨酸或还原型谷胱甘肽。

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