CN105315986A - 一类荧光强度对温度不敏感的荧光系统 - Google Patents
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Abstract
本发明的目的在于提供一种对温度变化不敏感的香豆素类荧光分子，它是以香豆素为母体设计的香豆素类衍生物荧光分子，本发明以单体-聚集体系统设想来实现通过选定合适的激发波长，实现系统荧光强度对温度的变化不敏感，可用于设计能够排除温度因素干扰的荧光探针，也可用于建立一种温度荧光探针的矫正标准。
Description
技术领域
本发明属于分析化学领域，涉及一种对温度不敏感的香豆素类荧光分子、荧光分子的制备及其荧光强度与温度的变化关系。它是以香豆素为母体设计的香豆素类衍生物荧光分子，通过选定合适的激发波长，其荧光强度对温度的变化不敏感，可用于设计能够排除温度因素干扰的荧光探针，也可用于建立一种温度荧光探针的矫正标准。
背景技术
荧光探针作为一种有效的检测手段，具有较高的时空分辨率和实时监测性能，已广泛的应用于生物系统中重要物种和生理过程的成像研究1，和其他微环境领域的研究，如沸石催化剂的活性位点成像2、微流体装置中检测某些物种或者监测某些过程3等。然而，在现有荧光探针的开发中，温度效应对荧光探针光物理或者光化学特性的影响往往被忽略了4，而这种效应直接影响到荧光信号的准确性和可靠性。这是由于通常来说，温度升高后系统的荧光强度和荧光量子产率会下降，这是由于温度升高加快了染料分子的碰撞、旋转和振动，促进了其溶解，从而导致了更高的非辐射跃迁率。这种普遍现象的存在，就使得所有的荧光探针都会不同程度的对温度变化做出响应，主要表现为荧光强度的降低或增高。
近期研究表明，细胞内和某些微环境中温度的分布是高度不均匀和时刻变化的5-6。因此，在荧光探针用于细胞和其他微环境成像时，就必须考虑到探针对温度和识别物种的交叉响应，并设法排除温度效应对荧光信号的干扰，从而提高荧光信号的准确性和可靠性7。然而到目前为止，还没有对温度不敏感的荧光系统被报道。在荧光系统中能够提供低温度依赖的唯一方法是使用某些刚性的染料，如罗丹明101。但是这种染料的荧光对温度变化依然较敏感，在20℃下的温度相关系数为0.13％/℃，当环境变化50℃时，这一强度变化可以达到6％8。因此，设计一种具有超低的温度相关系数的荧光系统成为很迫切和具有挑战性的工作。
基于近些年来对于分子聚集体以及其功能的一些研究进展9-11，我们提出和构建了一种新的设计理念，以单体-聚集体系统来实现荧光强度对温度变化不敏感的设想。在这一设计的简化想法中，染料的荧光量子产率随着温度升高而下降；同时，温度升高导致处于分离状态的非自发光的分子发生聚集，这样就增加了发光分子的量。在这两种因素相平衡时，荧光系统的总体发光强度就会维持在一个恒定的水平。然而，实际的效果可能更加复杂，因为不同种类的聚集体可能同时存在，而且某些分子的聚集体是处在高度发光状态的，或者大部分具有很弱以及几乎没有荧光。
发明内容
为了克服温度效应对荧光探针的影响，本发明提供一种对温度变化不敏感的香豆素类荧光分子。它是以香豆素为母体设计的香豆素类衍生物荧光分子，本发明以单体-聚集体系统设想来实现通过选定合适的激发波长，实现系统荧光强度对温度的变化不敏感，可用于设计能够排除温度因素干扰的荧光探针，也可用于建立一种温度荧光探针的矫正标准。
本发明的技术方案是，一种荧光强度对温度变化不敏感的香豆素类荧光分子，其特征在于，结构式如下：
其合成路线如下所示：
具体合成步骤为：
(1)、中间体4-二甲基氨基-2-羟基苯甲醛的合成(化合物3)
0℃-5℃下将30mmol的POCl3滴加到无水DMF中，搅拌30-40分钟后，将事先溶解在无水DMF中的3-二甲基氨基苯酚20mmol缓慢滴加到该溶液中，升温至80℃-90℃。反应过夜后，将反应液倒入冰水中，用氢氧化钠溶液调至中性，过滤得固体。将所得固体放在真空干燥箱中干燥6-12小时，柱层析分离得黄色固体4-(二甲基氨基)-2-羟基苯甲醛，柱层析分离得黄色固体4-(二甲基氨基)-2-羟基苯甲醛，柱层析分条件为石油醚：乙酸乙酯＝3：1。
(2)、7-二甲基氨基香豆素的合成(化合物2)
在圆底烧瓶中加入1.5mmol的4-二甲基氨基-2-羟基苯甲醛和3mmol丙二酸二甲酯，哌啶，以乙醇为溶剂回流反应6-12小时；反应后减压蒸出乙醇，加入浓盐酸(优选浓度为36.5％)和冰醋酸搅拌6-12小时，反应液倒入冰水中，用氢氧化钠溶液调节pH到5-6，抽滤得黄色固体，真空干燥箱干燥6-12小时，柱层析分离得到中间体7-二甲基氨基香豆素，柱层析分条件为石油醚：乙酸乙酯＝3：1，浓盐酸与冰醋酸的体积比为1:1-3:1。
(3)、7-二甲基氨基-3-醛基香豆素的合成(化合物1)
0℃-5℃下将1.6mmol的POCl3滴加到无水DMF中，搅拌30-40分钟，将事先溶解在干燥DMF中的7-二甲基氨基香豆素1.06mmol滴加到该溶液中，升温至60℃-70℃；反应12-16小时后，将反应液倒入冰水中，用氢氧化钠溶液调至中性，过滤得固体，乙醇重结晶得产品7-二甲基氨基-3-醛基香豆素。
步骤(1)中所用的氢氧化钠溶液的物质的量浓度为2摩尔每升。
步骤(2)中所用的溶剂乙醇是预先进行蒸馏处理过的不含水或含有极少量水的乙醇。
步骤(3)中所用的氢氧化钠溶液的物质的量浓度为2摩尔每升。
本发明所述香豆素类荧光分子，在不同溶剂中存在H-聚合体。在氯仿中，用350nm激发时，除了470nm处出现的主要发射峰，在406nm和436nm处也出现了两个发射峰，而当激发波长增加时，470nm处的峰变得更强，其他的两个峰变的更弱，直到检测不到；并且当发射波长分别为406nm、436nm、470nm，发现在370nm、395nm和445nm处有三个不同的吸收峰，从而证明了分子聚集的存在，说明了在溶液中同时存在着三个物种，我们分别称其为高度H-聚合体，二聚体和单体。
本发明所述香豆素类单体聚合体荧光系统，其荧光强度对温度的变化不敏感，可作为排除温度因素干扰的荧光探针。当用395nm激发时，由于二聚体的强吸收，温度升高时，荧光强度会发生很明显的增强。而当用415nm激发时，在温度变化从5℃到50℃时，系统的总体荧光强度几乎不发生变化，实现了到目前为止报道的最低的荧光与温度相关系数-0.05％/℃。当用440nm激发时，由于单体的低补偿能力，使得系统温度升高时荧光强度会下降。
本发明所述香豆素类荧光分子，在乙酸乙酯中不同激发光下，由于二聚体荧光的增强抵消了单体荧光的降低，从而使得在特定的激发波长下，荧光随温度变化很小，可以达到0.05％℃。
本发明所述香豆素类荧光分子，在四氢呋喃中不同激发光下，由于二聚体荧光的增强抵消了单体荧光的降低，从而使得在特定的激发波长下，荧光随温度变化很小，可以达到0.07％℃。
在选定的激发波长下，所述荧光系统的荧光强度对温度的变化不敏感，而其他的荧光分子，以罗丹明6G为例，其荧光强度随温度的增加会出现明显的下降。因此，我们用该化合物和罗丹明6G组成混合体系，通过研究混合体系温度的变化而导致的两种分子荧光强度的不同变化，来建立一种用内标法精确矫正体系温度的方法。
附图说明
图1本发明荧光分子3的1HNMR谱图；
图2本发明荧光分子2的1HNMR谱图；
图3本发明荧光分子2的13CNMR谱图；
图4本发明荧光分子1的1HNMR谱图；
图5本发明荧光分子1的13CNMR谱图；
图6本发明荧光分子1在氯仿溶液中不同浓度下归一化的紫外可见吸收光谱。
图7本发明荧光分子1在氯仿溶液中二维的吸收-发射谱图。
图8本发明荧光分子1在氯仿溶液中不同激发波长下的荧光发射光谱。
图9本发明荧光分子1在氯仿溶液中发射波长为406nm不同温度下的荧光吸收光谱。
图10本发明荧光分子1在氯仿溶液中发射波长为436nm不同温度下的荧光吸收光谱。
图11本发明荧光分子1在氯仿溶液中发射波长为470nm不同温度下的荧光吸收光谱。
图12本发明荧光分子1在氯仿溶液中激发波长为395nm不同温度下的荧光发射光谱。
图13本发明荧光分子1在氯仿溶液中激发波长为415nm不同温度下的荧光发射光谱。
图14本发明荧光分子1在氯仿溶液中激发波长为440nm不同温度下的荧光发射光谱。
图15本发明荧光分子1在氯仿溶液中不同温度下归一化的紫外可见吸收光谱。
图16本发明荧光分子1在乙酸乙酯溶液中激发波长为380nm、415nm、435nm不同温度下的荧光发射光谱。
图17本发明荧光分子1在四氢呋喃溶液中激发波长为380nm、410nm、435nm不同温度下的荧光发射光谱。
图18本发明荧光分子1在氯仿溶液中激发波长为415nm时不同温度下的荧光发射光谱。
图19罗丹明6G在氯仿溶液中激发波长为520nm时不同温度下的荧光发射光谱。
图20罗丹明6G和香豆素分子混合体系在氯仿溶液中激发波长为415nm和520nm时不同温度下的荧光发射光谱。
图212μm的罗丹明6G溶液荧光强度和2μm的香豆素分子荧光强度的比值随温度变化的线性拟合图。
图222μm的罗丹明6G和2μm的香豆素分子混合溶液的荧光强度的比值随温度变化的线性拟合图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不限于此。
实施例1
1、中间体4-二甲基氨基-2-羟基苯甲醛(荧光分子3)的合成
0℃下将30mmol的POCl3缓慢滴加到无水DMF中，搅拌30分钟后，将事先溶解在无水DMF中的3-二甲基氨基苯酚20mmol缓慢滴加到该溶液中，升温至80℃。反应过夜后，将反应液倒入冰水中，用氢氧化钠溶液调至中性，过滤得固体。将固体放在真空干燥箱中干燥6小时，柱层析分离得黄色固体4-(二甲基氨基)-2-羟基苯甲醛，柱层析分离条件为石油醚：乙酸乙酯＝3：1。
该中间体的氢谱数据如下：1HNMR(400MHz,CDCl3)δ11.59(s,1H),9.52(s,1H),7.28(d,J＝8.9Hz,1H),6.28(dd,J＝8.8Hz,2.4Hz,1H),6.07(s,1H),3.06(s,6H).
2、中间体7-二甲基氨基香豆素(荧光分子2)的合成
在圆底烧瓶中加入4-二甲基氨基-2-羟基苯甲醛1.5mmol和3mmol丙二酸二甲酯，少量哌啶，以乙醇为溶剂回流反应6小时。反应后减压蒸出乙醇，加入少量浓盐酸和冰醋酸搅拌6小时，反应液倒入冰水中，用氢氧化钠溶液调节pH到5，抽滤得黄色固体，真空干燥箱干燥6小时，柱层析分离得到中间体7-二甲基氨基香豆素，柱层析分条件为石油醚：乙酸乙酯＝3：1。
该中间体的氢谱和碳谱数据如下：
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ7.55(d,J＝9.2Hz,1H),7.26(d,J＝8.8Hz,1H),6.60(dd,J＝8.8,2.4Hz,1H,),6.51(s,1H),6.06(d,J＝9.6Hz,1H),3.05(s,6H).
13C-NMR(CDCl3,100MHz)δ162.10,156.38,152.97,143.67,128.51,109.90,109.02,108.81,98.18,40.15.
3、7-二甲基氨基-3-醛基香豆素(荧光分子1)的合成
0℃下将1.6mmol的POCl3缓慢滴加到无水DMF中，搅拌30分钟，将事先溶解在干燥DMF中的7-二甲基氨基香豆素1.06mmol缓慢滴加到该溶液中，升温至60℃。反应12小时后，将反应液倒入冰水中，用氢氧化钠溶液调至中性，过滤得固体，乙醇重结晶得产品7-二甲基氨基-3-醛基香豆素。
该产品的氢谱和碳谱数据如下：
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ10.14(s,1H),8.26(s,1H),7.43(d,J＝8.8Hz,1H,),6.66(dd,J＝8.8Hz,2.4Hz,1H),6.49(d,J＝2.4Hz,1H),3.15(s,6H).
13C-NMR(CDCl3,100MHz)δ187.90,161.71,158.57,155.30,145.51,132.20,114.97,110.29,108.50,97.59,40.30.
实施例2
荧光分子1在氯仿溶液中不同浓度下归一化的紫外可见吸收：
称取7-二甲基氨基-3-醛基香豆素(荧光分子1)1.086mg，溶于5ml二氯甲烷中，配成浓度c＝1mmol/L的母液，取4个5ml的离心管，在离心管中分别加入8μL、16μL、32μL、80μL的母液，待管中的二氯甲烷挥发干后，分别向4个离心管中加入4ml的氯仿配成浓度为2μM、4μM、8μM、20μM的待测液，混合均匀后测其紫外吸收光谱。
所用的紫外测定仪器为Cary60UV-Vis紫外分光光度计。从图6归一化后可以看出，不同浓度的紫外吸收光谱重合性很好，可见分子聚集在氯仿中是很微小的。
实施例3
荧光分子1在氯仿溶液中二维的吸收-发射谱图：
称取7-二甲基氨基-3-醛基香豆素(荧光分子1)1.086mg，溶于5ml二氯甲烷中，配成浓度c＝1mmol/L的母液，在5ml的离心管中加入8μL母液，待管中的二氯甲烷挥发干后，向离心管中加入4ml的氯仿配成浓度为2μM的待测液，混合均匀后测其二维的吸收-发射谱图。所用的荧光测定仪器为CaryEclipseFluorescenceSpectrophotometer荧光分光光度计。从图7氯仿溶液中二维的吸收-发射谱图可以看出，只能看见一个主要的峰，由此表明该溶液中只有一个物种。
实施例4
荧光分子1在氯仿溶液中不同激发波长下的荧光发射光谱：
称取7-二甲基氨基-3-醛基香豆素(荧光分子1)1.086mg，溶于5ml二氯甲烷中，配成浓度c＝1mmol/L的母液，在5ml的离心管中加入8μL母液，待管中的二氯甲烷挥发干后，向离心管中加入4ml的氯仿配成浓度为2μM的待测液，混合均匀后测其在350nm、380nm、400nm、420nm、440nm的激发波长下的荧光。所用的荧光测定仪器为CaryEclipseFluorescenceSpectrophotometer荧光分光光度计。从图8氯仿溶液中不同激发波长下的荧光发射光谱可以看出，在用350nm激发时，除了470nm处出现的主要发射峰，在406nm和436nm处也出现了两个发射峰，而当激发波长增加时，470nm处的峰变的更强，其他的两个峰变的更弱，直到检测不到，证明了分子聚集的存在。
实施例5
荧光分子1在氯仿溶液中发射波长分别为406nm、436nm、470nm不同温度下的荧光吸收光谱：
称取7-二甲基氨基-3-醛基香豆素(荧光分子1)1.086mg，溶于5ml二氯甲烷中，配成浓度c＝1mmol/L的母液，在5ml的离心管中加入16μL母液，待管中的二氯甲烷挥发干后，向离心管中加入4ml的氯仿配成浓度为4μM的待测液，混合均匀后测其在发射波长分别为406nm，温度变化为5℃、15℃、25℃、35℃、45℃、50℃下的荧光吸收光谱。同理，测发射波长分别为436nm和发射波长分别为470nm的不同温度的荧光吸收光谱。所用的荧光测定仪器为CaryEclipseFluorescenceSpectrophotometer荧光分光光度计。从图9、10、11中可以看出，在370nm、395nm和445nm处有三个不同的吸收峰，说明了在溶液中同时存在着三个物种。
实施例6
荧光分子1在氯仿溶液中激发波长为395nm不同温度下的荧光发射光谱：
称取7-二甲基氨基-3-醛基香豆素(荧光分子1)1.086mg，溶于5ml二氯甲烷中，配成浓度c＝1mmol/L的母液，在5ml的离心管中加入8μL母液，待管中的二氯甲烷挥发干后，向离心管中加入4ml的氯仿配成浓度为2μM的待测液，混合均匀后测其在395nm激发下的不同温度的荧光。所用的荧光测定仪器为CaryEclipseFluorescenceSpectrophotometer荧光分光光度计。从图12可以看出，由于二聚体的强吸收，所以温度升高时，荧光强度会发生很明显的增强。
实施例7
荧光分子1在氯仿溶液中激发波长为415nm不同温度下的的荧光发射光谱：
称取7-二甲基氨基-3-醛基香豆素(荧光分子1)1.086mg，溶于5ml二氯甲烷中，配成浓度c＝1mmol/L的母液，在5ml的离心管中加入8μL母液，待管中的二氯甲烷挥发干后，向离心管中加入4ml的氯仿配成浓度为2μM的待测液，混合均匀后测其在波长为415nm光激发下的不同温度的荧光。所用的荧光测定仪器为CaryEclipseFluorescenceSpectrophotometer荧光分光光度计。从图13可以看出，在温度变化从5℃到50℃时，系统的总体荧光强度几乎不发生变化，实现了到目前为止报道的最低的荧光与温度相关系数-0.05％/℃。
实施例8
荧光分子1在氯仿溶液中激发波长为440nm不同温度下的的荧光发射光谱：
称取7-二甲基氨基-3-醛基香豆素(荧光分子1)1.086mg，溶于5ml二氯甲烷中，配成浓度c＝1mmol/L的母液，在5ml的离心管中加8μL母液，待管中的二氯甲烷挥发干后，向离心管中加入4ml的氯仿配成浓度为2μM的待测液，混合均匀后测其在波长为440nm光激发下的不同温度的荧光。所用的荧光测定仪器为CaryEclipseFluorescenceSpectrophotometer荧光分光光度计。从图14可以看出，由于单体的低补偿能力，使得系统温度升高时荧光强度会下降。
实施例9
荧光分子1在氯仿溶液中不同温度下归一化的紫外可见吸收光谱：
称取7-二甲基氨基-3-醛基香豆素(荧光分子1)1.086mg，溶于5ml二氯甲烷中，配成浓度c＝1mmol/L的母液，在5ml的离心管中加入16μL母液，待管中的二氯甲烷挥发干后，向离心管中加入4ml的氯仿配成浓度为4μM的待测液，混合均匀后测其在不同温度下的紫外可见吸收光谱。所用的紫外测定仪器为Cary60UV-Vis紫外分光光度计。从图15可以看出，温度由5℃增加到50℃时，吸收光谱蓝移了3nm左右，这是由于温度升高二聚体的数量增加。
实施例10
荧光分子1在乙酸乙酯溶液中激发波长分别为380nm、415nm、435nm不同温度下的荧光光谱：
称取7-二甲基氨基-3-醛基香豆素(荧光分子1)1.086mg，溶于5ml二氯甲烷中，配成浓度c＝1mmol/L的母液，在5ml的离心管中加入16μL母液，待管中的二氯甲烷挥发干后，向离心管中加入4ml的乙酸乙酯配成浓度为4μM的待测液，混合均匀后测其在激发波长分别为380nm、415nm、435nm不同温度下的荧光光谱。所用的荧光测定仪器为CaryEclipseFluorescenceSpectrophotometer荧光分光光度计。从图16可以看出，由于二聚体荧光的增强抵消了单体荧光的降低，从而使得在特定的激发波长下，荧光随温度变化很小，可以达到0.05％/℃。
实施例11
荧光分子1在四氢呋喃溶液中激发波长分别为380nm、410nm、435nm不同温度下的的荧光光谱：
称取7-二甲基氨基-3-醛基香豆素(荧光分子1)1.086mg，溶于5ml二氯甲烷中，配成浓度c＝1mmol/L的母液，在5ml的离心管中加入16μL母液，待管中的二氯甲烷挥发干后，向离心管中加入4ml的四氢呋喃配成浓度为4μM的待测液，混合均匀后测其在激发波长分别为380nm、410nm、435nm不同温度下的荧光光谱。所用的荧光测定仪器为CaryEclipseFluorescenceSpectrophotometer荧光分光光度计。从图17可以看出，由于二聚体荧光的增强抵消了单体荧光的降低，从而使得在特定的激发波长下，荧光随温度变化很小，可以达到0.07％/℃。
实施例12
用荧光分子1和罗丹明6G组成混合体系，通过研究混合体系温度的变化而导致的两种分子荧光强度的不同变化，来建立一种用内标法精确矫正体系温度的方法：
在相同浓度相同溶剂条件下，测量特定激发波长下，该香豆素分子荧光强度随温度的变化以及罗丹明6G荧光强度随温度的变化，通过对温度变化表现敏感的罗丹明6G的荧光强度与对温度变化不敏感的香豆素分子的荧光强度进行比值处理，得出一种荧光强度比值随温度变化的线性方程，进而可用该方程来检测未知体系的准确温度，或用于排除了温度变化对于测试体系荧光强度的影响。具体过程为：
图18：荧光分子1在氯仿溶液中激发波长为415nm时不同温度下的荧光发射光谱：
称取7-二甲基氨基-3-醛基香豆素(荧光分子1)1.086mg，溶于5ml二氯甲烷中，配成浓度c＝1mmol/L的母液，在5ml的离心管中加入8μL母液，待管中的二氯甲烷挥发干后，向离心管中加入4ml的氯仿配成浓度为2μM的待测液，混合均匀后测其在波长为415nm光激发下的不同温度的荧光。所用的荧光测定仪器为CaryEclipseFluorescenceSpectrophotometer荧光分光光度计。从图13可以看出，在温度变化从5℃到50℃时，系统的总体荧光强度几乎不发生变化，实现了到目前为止报道的最低的荧光与温度相关系数-0.05％/℃。
图19：罗丹明6G在氯仿溶液中激发波长为520nm时不同温度下的荧光发射光谱：
称取罗丹明6G4.79mg，溶于5ml二氯甲烷中，配成浓度c＝2mmol/L的母液，在5ml的离心管中加入4μL母液，待管中的二氯甲烷挥发干后，向离心管中加入4ml的氯仿配成浓度为2μM的待测液，混合均匀后测其在波长为520nm光激发下的不同温度的荧光。所用的荧光测定仪器为CaryEclipseFluorescenceSpectrophotometer荧光分光光度计。从图19可以看出，在温度变化从5℃到50℃时，系统的荧光强度随温度升高而下降。
图20：罗丹明6G和香豆素分子混合体系在氯仿溶液中激发波长为415nm和520nm时不同温度下的荧光发射光谱：
称取7-二甲基氨基-3-醛基香豆素(荧光分子1)1.086mg，溶于5ml二氯甲烷中，配成浓度c＝1mmol/L的母液，在5ml的离心管中加入8μL母液，将管中的二氯甲烷挥发干。称取罗丹明6G4.79mg，溶于5ml二氯甲烷中，配成浓度c＝2mmol/L的母液，在5ml的离心管中加入4μL母液，待管中的二氯甲烷挥发干后，向离心管中加入4ml的氯仿配成浓度均为2μM的混合物质待测液，混合均匀后测其在波长为415nm和520nm光激发下的不同温度的荧光。所用的荧光测定仪器为CaryEclipseFluorescenceSpectrophotometer荧光分光光度计。从图3可以看出，在温度变化从5℃到50℃时，香豆素分子的荧光强度依然对温度的变化不敏感，而罗丹明分子的荧光强度随温度升高依然明显下降，说明混合体系中两种物质的发射光谱不会产生相互干扰，可用其不同温度下的荧光强度比值来建立相应的方程进而实现用内标法来检测体系温度。
图21：2μm的罗丹明6G溶液荧光强度和2μm的香豆素分子荧光强度的比值随温度变化的线性拟合图
图22：2μm的罗丹明6G和2μm的香豆素分子混合溶液的荧光强度的比值随温度变化的线性拟合图
用图19得到的罗丹明分子在不同温度下的荧光强度峰值分别与图18得到的香豆素分子在不同温度下的荧光强度峰值进行比值，得到的数据对相应的温度进行线性拟合，得到一直线方程(图21)。
用图20得到的罗丹明6G分子和香豆素分子的混合溶液的荧光强度峰值，进行比值处理，得到的数据对相应的温度进行线性拟合，同样得到一直线方程(图22)，并且与香豆素分子1和罗丹明6G单独测量时得到的线性方程(图21)吻合的很好，这也说明香豆素分子1不干扰罗丹明化合物的荧光性能。通过该方程可以用于测量该范围内检测体系的准确温度，或者来建立一种用内标法精确矫正体系温度的方法。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
参考文献
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Claims (8)
1.一种荧光强度对温度变化不敏感的香豆素类荧光分子，其特征在于，所述荧光分子为7-二甲基氨基-3-醛基香豆素，其结构式如下：
2.一种按照权利要求1所述荧光强度对温度变化不敏感的香豆素类荧光分子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)中间体4-二甲基氨基-2-羟基苯甲醛的合成
0℃-5℃下将30mmol的POCl3滴加到无水DMF中，搅拌30-40分钟后，将事先溶解在无水DMF中的3-二甲基氨基苯酚20mmol缓慢滴加到该溶液中，升温至80℃-90℃；反应过夜后，将反应液倒入冰水中，用氢氧化钠溶液调至中性，过滤得固体；将所得固体放在真空干燥箱中干燥6-12小时，柱层析分离得黄色固体4-(二甲基氨基)-2-羟基苯甲醛，柱层析分条件为石油醚：乙酸乙酯＝3：1；
(2)7-二甲基氨基香豆素的合成
在圆底烧瓶中加入1.5mmol的4-二甲基氨基-2-羟基苯甲醛和3mmol丙二酸二甲酯，哌啶，以乙醇为溶剂回流反应6-12小时；反应后减压蒸出乙醇，加入浓盐酸和冰醋酸搅拌6-12小时，反应液倒入冰水中，用氢氧化钠溶液调节pH到5-6，抽滤得黄色固体，真空干燥箱干燥6-12小时，柱层析分离得到中间体7-二甲基氨基香豆素，柱层析分条件为石油醚：乙酸乙酯＝3：1，浓盐酸与冰醋酸的体积比为1:1-3:1；
(3)7-二甲基氨基-3-醛基香豆素的合成
0℃-5℃下将1.6mmol的POCl3滴加到无水DMF中，搅拌30-40分钟，将事先溶解在干燥DMF中的7-二甲基氨基香豆素1.06mmol滴加到该溶液中，升温至60℃-70℃；反应12-16小时后，将反应液倒入冰水中，用氢氧化钠溶液调至中性，过滤得固体，乙醇重结晶得产品7-二甲基氨基-3-醛基香豆素。
3.按照权利要求2所述荧光强度对温度变化不敏感的香豆素类荧光分子的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所用氢氧化钠溶液的物质的量浓度为2摩尔每升。
4.按照权利要求2所述荧光强度对温度变化不敏感的香豆素类荧光分子的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所用的溶剂乙醇是预先进行蒸馏处理过的不含水或含有极少量水的乙醇。
5.按照权利要求2所述荧光强度对温度变化不敏感的香豆素类荧光分子的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所用氢氧化钠溶液的物质的量浓度为2摩尔每升。
6.一种按照权利要求1所述荧光分子作为荧光探针的应用，其特征在于：所述荧光分子作为排除温度因素干扰的荧光探针。
7.按照权利要求6所述荧光分子作为荧光探针的应用，其特征在于：采用所述荧光分子和罗丹明6G组成混合体系，通过研究混合体系温度的变化而导致的两种分子荧光强度的不同变化，来建立一种用内标法精确矫正体系温度的方法。
8.按照权利要求6或7所述荧光分子作为荧光探针的应用，其特征在于：所述荧光分子与罗丹明6G组成混合体系，在温度变化从5℃到50℃时，测其在波长为415nm和520nm的光激发下不同温度的荧光，用其不同温度下的荧光强度比值来建立相应的方程进而实现用内标法来检测体系温度。
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