CN109593087A - 一种多通道同时区分检测Cys/Hcy，GSH和H2S的荧光探针的设计、合成及应用 - Google Patents

一种多通道同时区分检测Cys/Hcy，GSH和H2S的荧光探针的设计、合成及应用 Download PDF

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CN109593087A CN201811090573.2A CN201811090573A CN109593087A CN 109593087 A CN109593087 A CN 109593087A CN 201811090573 A CN201811090573 A CN 201811090573A CN 109593087 A CN109593087 A CN 109593087A
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宋相志
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张赟
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6486—Measuring fluorescence of biological material, e.g. DNA, RNA, cells

Abstract

本发明涉及一种多通道同时区分检测Cys/Hcy，GSH和H2S的荧光探针的制备方法以及该荧光探针在体外和活细胞内检测Cys/Hcy，GSH和H2S方面的应用。该探针化合物的结构式如式(I)所示。我们将两种识别基团通过染料的桥连构建到一个分子上，通过不同的生物硫醇亲核性的差异来获得不同的荧光信号组合，从而达到区分生物硫醇的目的。此外该系列化合物有望在生物医药，光电以及环境保护领域有着较好的应用前景。

Description

一种多通道同时区分检测Cys/Hcy，GSH和H2S的荧光探针的设 计、合成及应用
技术领域
本发明涉及的是化学分析检测技术领域，具体涉及一种多通道同时区分检测Cys/Hcy， GSH和H2S的荧光探针的制备方法以及该荧光探针在体外和活细胞内检测Cys/Hcy，GSH和 H2S方面的应用。
背景技术
生物硫醇研究发现这些生物硫醇在人体生理系统中发挥着重要的作用，与各种疾病的 发生，监测和治疗密切相关。谷胱甘肽(GSH)是目前已知的最丰富的细胞内生物硫醇，可以 保护蛋白质硫醇免受氧化，减轻肝脏损伤，增强癌症患者的抗氧化能力，协同治疗糖尿病及 并发症等。半胱氨酸(Cys)和同型半胱氨酸(Hcy)的异常含量是多种疾病的危险因素，包括 神经退行性疾病，心脑血管疾病，癌症，糖尿病和并发症，先兆子痫和眼部疾病。硫化氢(H2S) 作为继一氧化碳(CO)和一氧化氮(NO)之后的第三种气体信号传递分子，在松弛平滑肌， 调节神经传递和调节胰岛素释放中起重要作用。并且研究人员发现这些生物硫醇之间具有非 常紧密的联系。在胱硫醚-β-合成酶(CBS)的催化作用下，Hcy与丝氨酸缩合形成胱硫醚，胱 硫醚进一步被胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)催化形成Cys。在γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)和 谷胱甘肽合成酶的连续作用下，GSH通过Cys与谷氨酸和甘氨酸的结合产生。而H2S可以通 过胱硫醚-β-合成酶和胱硫醚-γ-裂解酶催化Cys和Hcy产生。所以，一种硫醇的含量变化直接 影响到其它硫醇的含量。因此，开发一种方法能够同时区分检测Cys,Hcy,GSH和H2S变的 非常重要。
近年来，荧光探针由于其实时成像，高灵敏度，高选择性和操作简单等特点，广泛用于检测生物分子。虽然已经开发了许多荧光探针来检测生物硫醇，但由于其相似的结构和反应 活性，它们中的大多数不能同时区分Cys/Hcy，GSH和H2S。林伟英课题组报道了一种设计荧光探针分子的策略，通过多种荧光信号的组合来实现对多种生物硫醇的区分检测。受到这 一策略的启发，我们在课题组前期研究的基础上，我们将两种识别基团通过染料的桥连构建 到一个分子上，通过不同的生物硫醇亲核性的差异来获得不同的荧光信号组合，从而达到区 分生物硫醇的目的。
发明内容
本发明目的之一是提供一种合成路线简单、反应条件温和、成本较低的荧光探针合成 方法；目的之二是提供一种灵敏度高、选择性好，抗干扰能力强，斯托克斯位移大，发射波 长在近红外，能够对体外或者活细胞内的Cys/Hcy，GSH和H2S进行监测或者细胞成像的荧 光探针。
本发明解决问题采取的技术方案为，一种可以特异性识别半胱氨酸的新型荧光探针， 其分子结构式如下：合成路线如下：
具体合成方法如下：(1)将间苯二酚(2.2g，20mmol)，4-氯乙酰乙酸乙酯(3.3g，20mmol)置于100mL圆底烧瓶中，加入对甲苯磺酸(0.35g，2mmol)和30mL甲苯，120℃下搅拌反 应5h，TLC监测反应完成后，停止反应，减压蒸馏除去溶剂，得到棕色粘稠状固体2。向反 应瓶中加入50mL蒸馏水，100℃搅拌回流反应48h，停止反应，趁热抽滤，滤液冷却析出 固体，待析出充分后，抽滤干燥得米白色固体。
(2)将化合物3(500mg,2.6mmol)，氰基乙酸(440mg,5.2mmol)置于50mL圆底烧瓶 中，加入对甲苯磺酸(45mg,0.26mmol)和15mL甲苯，120℃下搅拌反应6h。TLC监测反 应完成后，停止反应，冷却到室温，倒出溶剂甲苯，剩余固体用乙醚洗涤(15mL×3)，抽滤， 干燥得灰白色固体490mg，产率73％。
(3)将化合物1，4-二乙基-7-羟基-1，2，3，4-四氢喹喔啉-6-甲醛和化合物1-叠氮 基-4-(溴甲基)苯溶于干燥的丙酮，置于圆底烧瓶中，加入碳酸钾，反应液搅拌加热回流8h，TLC监测反应完成，停止反应。反应液冷却至室温，减压蒸馏除去溶剂，剩余物通过硅胶柱层析纯化，真空干燥得棕红色固体，即为化合物5。
(4)将化合物4(170mg,0.66mmol)置于25mL圆底烧瓶中，加入7.5mL无水乙醇。将 化合物5(200mg,0.55mmol)和20μL哌啶溶于7.5mL干燥二氯甲烷中，加入到上述反应瓶 中，45℃氩气保护下搅拌回流反应5h。TLC监测反应完成后，停止反应，减压蒸馏除去溶剂， 剩余物用柱层析分离纯化，先后用二氯甲烷/乙酸乙酯(v:v＝20:1)和二氯甲烷/甲醇(v:v＝ 30:1)为洗脱剂，干燥得到红色固体73mg，产率为22％。
(5)将化合物6(60.6mg,0.1mmol)，NBD-Cl(40mg,0.2mmol)置于25mL圆底烧瓶中，加 入碳酸钾(55mg,0.4mmol)和10mL丙酮。氩气保护下室温搅拌反应2h，TLC监测反应完 成后，停止反应，减压蒸馏除去溶剂，剩余物用柱层析分离纯化，二氯甲烷/乙酸乙酯(v:v＝ 20:1)作为洗脱剂。干燥得到深红色固体61.5mg，产率为80％。
本发明的荧光探针测试方法如下，将探针分子溶于二甲基亚砜(DMSO)中，配制成1.0×10-3mol/L的溶液，室温下进行测试。并且对低浓度的Cys/Hcy，GSH和H2S可以进行定量检测，具体实施方法在实施实例中详细介绍。
本发明的荧光探针的作用机理如下，在探针分子中，叠氮基被用来作为H2S的识别基 团，是因为H2S的还原能力强于Cys/Hcy/GSH，可以有效避免彼此之间的干扰NBD通常作为识别基团和潜在荧光团来区分Cys/Hcy和GSH。在这里，我们将NBD和叠氮基团通过两 个染料的桥连构建到一个分子上，利用不同的荧光信号组合，来实现单分子区分检测Cys/Hcy, GSH和H2S的目的。如下所示，由于叠氮基团很强的分子内电荷转移效应(ICT)和NBD的光诱导电子转移效应(PET)，探针1没有荧光。探针1分子中有两个反应位点。当探针1与Cys/Hcy反应时，位点1的醚键被切断，释放出发蓝色荧光的化合物6和没有荧光的 NBD-S-Cys/Hcy，随后NBD-S-Cys/Hcy会经过快速的分子内重排形成发绿色荧光的 NBD-N-Cys/Hcy。类似的是，GSH同样可以切断位点1的醚键得到发蓝色荧光的化合物6和 没有荧光的NBD-S-GSH，但是NBD-S-GSH不能发生分子内重排得到NBD-N-GSH，因为重 排过程中需要经过动力学不稳定的十元环过渡态，使得重排反应难以发生。对于H2S而言， 位点1和2的醚键都能被切断，经过快速的分子内合环反应得到发蓝色荧光的香豆素3和发 红色荧光的四氢喹喔啉香豆素衍生物(TQC)。因此，通过三组荧光信号可以区分检测这四种 生物硫醇：Cys/Hcy(蓝光+绿光)，GSH(蓝光)，H2S(蓝光+红光)。
探针分子的响应过程：
本发明的荧光探针研究了探针在PBS缓冲液(10mM,pH＝7.4,含30％乙腈)中与Cys, Hcy,GSH和H2S响应的荧光情况。探针1自身不发荧光。当探针1的溶液中加入Cys/Hcy时， 在490nm(激发波长为325nm)和559nm(激发波长为475nm)处有明显的蓝色荧光和绿色荧光产生。对于GSH，探针1的溶液只在490nm(激发波长为325nm)处产生了蓝色荧光。 而当探针1与H2S响应时，反应体系在490nm(激发波长为325nm)和618nm(激发波长为 470nm)处观察到了逐渐增强的蓝色荧光和红色荧光。荧光滴定实验显示，当500μM的Cys, Hcy,GSH和H2S加入时，响应后的荧光信号强度达到最大。另外，从490nm处的荧光强度 与Cys,Hcy,GSH和H2S的浓度关系可以看出，荧光强度与硫醇浓度在0-100μM范围内有很 好的线性关系，线性相关系数分别为RCys＝0.9946,RHcy＝0.9944,RGSH＝0.9943,RH2S＝0.9940。同 样地，在559nm和618nm处的荧光强度与硫醇的浓度在0-100μM范围内也表现出很好的线 性关系。根据信噪比S/N＝3，计算出探针1对Cys,Hcy,GSH和H2S的检测限分别为0.063, 0.055,0.057和0.052μM。随后，我们还测定了探针1与四种生物硫醇响应前后的紫外光谱变 化情况
本发明所述的探针分子合成路线简单，成本较低，对Cys,Hcy,GSH和H2S的选择性好、抗干扰能力强，斯托克位移大，该荧光探针在生物化学，环境科学等领域具有实际的应用价值。
附图说明
图1为本发明荧光探针(10.0μM)在PBS缓冲液(10mM,pH＝7.4,含30％乙腈)中与500μM Cys,Hcy,GSH和H2S响应前后的紫外吸收光谱。
图2为本发明荧光探针探针(10.0μM)在PBS缓冲液(10mM,pH＝7.4,含30％乙腈)中随Cys(A),Hcy(B),GSH(C),H2S(D)浓度增加的荧光光谱变化。激发波长：第一列325nm；第二列475nm；第三列470nm。激发和发射狭缝宽度为5nm/5nm。
图3为本发明的荧光探针(10.0μM)在490nm处荧光强度与Cys(a),Hcy(b),GSH(c),H2S(d)的浓度关系图，响应体系为PBS缓冲液(10mM,pH＝7.4,含30％乙腈)。插图为490nm处荧光强度与生物硫醇在0.0-100μM浓度范围之间的线性关系。
图4为本发明的荧光探针(10.0μM)在559nm和618nm处荧光强度与Cys(a),Hcy(b),H2S(c)的浓度关系图，响应体系为PBS缓冲液(10mM,pH＝7.4,含30％乙腈)。插图为559nm和618nm处荧光强度与(a)Cys(20.0-100μM),(b)Hcy(20.0-100μM),(c)H2S(0.0-100μM) 浓度范围之间的线性关系。
图5为本发明的荧光探针(10.0μM)在PBS缓冲液(10mM,pH＝7.4,含30％乙腈)中与Cys,Hcy,GSH和H2S响应时，490nm，559nm和618nm处的荧光强度随时间的变化。激 发波长：(a)325nm,(b)475nm,(c)470nm。
图6为本发明的荧光探针(10.0μM)在PBS缓冲液(10mM,pH＝7.4,含30％乙腈)中与500μM相关分析物响应后，490nm，559nm和618nm处的荧光强度。分析物包括：(1)His, (2)Ala,(3)Asp,(4)Thr,(5)Leu,(6)Ser,(7)Tyr,(8)Glu,(9)Pro,(10)Arg,(11)Lys,(12)Ile,(13) Gly,(14)Val,(15)Phe,(16)Try,(17)SO4 2-,(18)NO3 -,(19)SCN-,(20)Cl-,(21)CO3 2-,(22)SO3 2-, (23)N3 -,(24)AcO-,(25)Ca2+,(26)K+,(27)Mg2+,(28)Na+,(29)ClO-,(30)H2O2,(31)Cys,(32) Hcy,(33)GSH,(34)H2S。激发波长：(a)325nm,(b)475nm,(c)470nm。
图7为本发明的荧光探针的高效液相色谱图：(a)探针(50.0μM)；(b,c,d)探针(50.0μM) 分别与10.0,25.0和50.0equiv.的Cys在PBS缓冲液(10mM,pH＝7.4,含30％乙腈)中响应 60分钟；(e)化合物(7-羟基-2-氧代-2H-色烯-4-基)甲基(E)-3-(7-((4-叠氮苯基)氧基) -1，4-二乙基-1，2，3，4-四氢喹喔啉-6-基)-2-氰基丙烯酸酯(50.0μM)；(f)NBD-N-Cys(50.0 μM).流动相：H2O/CH3CN(v/v,2/8)；流速：0.5mL/min；温度：25℃；检测波长：350nm。
图8为本发明荧光探针的高效液相色谱图：(a)探针(50.0μM)；(b,c,d)探针(50.0μM) 分别与10.0,25.0和50.0equiv.的Hcy在PBS缓冲液(10mM,pH＝7.4,含30％乙腈)中响应60分钟；(e)化合物(7-羟基-2-氧代-2H-色烯-4-基)甲基(E)-3-(7-((4-叠氮苯基)氧基) -1，4-二乙基-1，2，3，4-四氢喹喔啉-6-基)-2-氰基丙烯酸酯(50.0μM)；(f)NBD-N-Hcy(50.0μM).流动相：H2O/CH3CN(v/v,2/8)；流速：0.5mL/min；温度：25℃；检测波长：350nm。
图9为本发明荧光探针的高效液相色谱图：(a)探针(50.0μM)；(b,c,d)探针(50.0μM) 分别与10.0,25.0和50.0equiv.的GSH在PBS缓冲液(10mM,pH＝7.4,含30％乙腈)中响应60分钟；(e)化合物(7-羟基-2-氧代-2H-色烯-4-基)甲基(E)-3-(7-((4-叠氮苯基)氧基) -1，4-二乙基-1，2，3，4-四氢喹喔啉-6-基)-2-氰基丙烯酸酯(50.0μM)；(f)NBD-S-GSH(50.0μM).流动相：H2O/CH3CN(v/v,2/8)；流速：0.5mL/min；温度：25℃；检测波长：350nm。
图10为本发明荧光探针的高效液相色谱图：(a)探针(50.0μM)；(b,c,d)探针(50.0μM) 分别与10.0,25.0和50.0equiv.的H2S在PBS缓冲液(10mM,pH＝7.4,含30％乙腈)中响应 60分钟；(e)化合物(7-羟基-2-氧代-2H-色烯-4-基)甲基(E)-3-(7-((4-叠氮苯基)氧基)- 1，4-二乙基-1，2，3，4-四氢喹喔啉-6-基)-2-氰基丙烯酸酯(50.0μM)；(f)TQC(50.0μM)； (g)化合物3(50.0μM)；(h)NBD-SH(50.0μM).流动相：H2O/CH3CN(v/v,2/8)；流速：0.5mL/min；温度：25℃；检测波长：350nm。
图11探针与Cys反应产物的高分辨质谱。
图12探针与Hcy反应产物的高分辨质谱。
图13探针与GSH反应产物的高分辨质谱。
图14探针与H2S反应产物的高分辨质谱。
图15不同浓度的探针对HeLa细胞毒性的分析。
图16探针在HeLa细胞内区分检测Cys/Hcy，GSH和H2S的共聚焦荧光成像。(A-D)细胞先与1.0mM NEM孵育30分钟，再与500μM Cys/Hcy/GSH/H2S孵育30分钟，最后与10μM 探针1孵育30分钟。(E)细胞先与1.0mM NEM孵育30分钟，再与10μM探针1孵育30 分钟。(F)细胞与10μM探针1孵育30分钟。第一行：蓝光通道，激发波长405nm，收集 范围470-510nm；第二行：绿光通道，激发波长488nm，收集范围540-580nm；第三行： 红光通道，激发波长488nm，收集范围600-640nm；第四行：合并蓝光，绿光和红光通道。
具体实施实例
本发明的探针分子结构式如下：
本发明的探针合成路线如下所示；
实施例1：中间产物3的合成；
英文名称：7-hydroxy-4-(hydroxymethyl)-2H-chromen-2-one
中文名称：7-羟基-4-(羟甲基)-2H-色烯-2-酮
结构式：
合成方法：将间苯二酚(2.2g，20mmol)，4-氯乙酰乙酸乙酯(3.3g，20mmol)置于100mL圆底烧瓶中，加入对甲苯磺酸(0.35g，2mmol)和30mL甲苯，120℃下搅拌反应5h， TLC监测反应完成后，停止反应，减压蒸馏除去溶剂，得到棕色粘稠状固体2。向反应瓶中 加入50mL蒸馏水，100℃搅拌回流反应48h，停止反应，趁热抽滤，滤液冷却析出固体， 待析出充分后，抽滤干燥得米白色固体。
实施例2：中间产物4的合成；
英文名称：(7-hydroxy-2-oxo-2H-chromen-4-yl)methyl 2-cyanoacetate
中文名称：(7-羟基-2-氧代-2H-色烯-4-基)2-氰基乙酸甲酯
结构式：
合成方法：将化合物3(500mg,2.6mmol)，氰基乙酸(440mg,5.2mmol)置于50mL 圆底烧瓶中，加入对甲苯磺酸(45mg,0.26mmol)和15mL甲苯，120℃下搅拌反应6h。TLC 监测反应完成后，停止反应，冷却到室温，倒出溶剂甲苯，剩余固体用乙醚洗涤(15mL×3)， 抽滤，干燥得灰白色固体490mg，产率73％。
HRMS(ESI)m/z:[M-H]calcd for C13H8NO5,258.0408；found,258.0420.1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ7.59(d,J＝8.7Hz,1H),6.81(dd,J＝8.7,2.1Hz,1H),6.76(d,J＝2.1Hz,1H), 6.31(s,1H),5.44(s,2H),4.23(s,2H),3.86(s,1H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6):δ166.2,164.5,161.9,160.6,155.5,150.1,126.5,113.6,109.4,108.6,102.9,63.2,25.0。
实施例3：中间产物6的合成；
英文名称：(7-hydroxy-2-oxo-2H-chromen-4-yl)methyl
(E)-3-(7-((4-azidobenzyl)oxy)-1,4-diethyl-1,2,3,4-tetrahydroquinoxalin-6-yl)-2-cyanoacrylate
中文名称：(7-羟基-2-氧代-2H-色烯-4-基)甲基(E)-3-(7-((4-叠氮苯基)氧基)-1，4-二乙基-1，2，3，4-四氢喹喔啉-6-基)-2-氰基丙烯酸酯
结构式：
合成方法：将化合物4(170mg,0.66mmol)置于25mL圆底烧瓶中，加入7.5mL无 水乙醇。将化合物5(200mg,0.55mmol)和20μL哌啶溶于7.5mL干燥二氯甲烷中，加入到 上述反应瓶中，45℃氩气保护下搅拌回流反应5h。TLC监测反应完成后，停止反应，减压蒸 馏除去溶剂，剩余物用柱层析分离纯化，先后用二氯甲烷/乙酸乙酯(v:v＝20:1)和二氯甲烷/ 甲醇(v:v＝30:1)为洗脱剂，干燥得到红色固体73mg，产率为22％。
HRMS(ESI)m/z:[M-H]-calcd for C33H29N6O6,605.2149；found,605.2164.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.65(s,1H),8.49(s,1H),7.58(d,J＝8.7Hz,1H),7.51–7.43(m,3H),7.12(d,J＝8.4Hz,2H),6.81(dt,J＝9.3,4.6Hz,1H),6.76(d,J＝2.3Hz,1H),6.25(s,1H),6.19 (s,1H),5.46(s,2H),5.21(s,2H),3.58–3.53(m,2H),3.52–3.45(m,2H),3.25(dd,J＝13.7,6.7 Hz,2H),3.19–3.11(m,2H),1.10(q,J＝7.1Hz,6H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ164.5, 161.9,160.5,157.1,155.5,151.1,146.0,145.5,139.6,134.1,129.8,129.3,126.4,119.7,119.2, 113.6,109.5,108.8,108.2,107.4,102.9,94.4,85.8,70.2,62.4,48.1,45.8,45.2,44.5,11.2,9.9。
实施例4：探针1的合成；
英文名称：(7-((7-nitrobenzo[c][1,2,5]oxadiazol-4-yl)oxy)-2-oxo-2H-chromen-4-yl)methyl (E)-3-(7-((4-azidobenzyl)oxy)-1,4-diethyl-1,2,3,4-tetrahydroquinoxalin-6-yl)-2-cyanoacrylate
中文名称：(7-((7-硝基苯并[c)[1，2，5]噁二唑-4-基)氧基)-2-氧代-2H-色烯-4-基)甲基(E)-3-(7-((4-叠氮苯甲酰)氧基)-1，4-二乙基-1，2，3，4-四氢喹喔啉-6- 基)-2-氰基丙烯酸酯
结构式：
合成方法：将化合物6(60.6mg,0.1mmol)，NBD-Cl(40mg,0.2mmol)置于25mL 圆底烧瓶中，加入碳酸钾(55mg,0.4mmol)和10mL丙酮。氩气保护下室温搅拌反应2h， TLC监测反应完成后，停止反应，减压蒸馏除去溶剂，剩余物用柱层析分离纯化，二氯甲烷/ 乙酸乙酯(v:v＝20:1)作为洗脱剂。干燥得到深红色固体61.5mg，产率为80％。
HRMS(ESI)m/z:[M]calcd for C39H31N9O9,769.2245；found,769.2209.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.66(d,J＝8.3Hz,1H),8.50(s,1H),7.98(d,J＝8.8Hz,1H),7.61(d,J＝2.4Hz,1H),7.49(d,J＝3.3Hz,2H),7.47–7.42(m,2H),7.12(d,J＝8.4Hz,2H),7.03(d,J＝8.3Hz, 1H),6.49(s,1H),6.25(s,1H),5.58(s,2H),5.22(s,2H),3.56(t,J＝4.7Hz,2H),3.52–3.45(m, 2H),3.27–3.21(m,2H),3.16(t,J＝4.7Hz,2H),1.10(dd,J＝15.7,7.1Hz,6H).13C NMR(100 MHz,DMSO-d6)δ164.5,159.7,157.1,156.5,154.9,152.0,150.5,146.0,145.6,145.0,139.6, 135.6,134.1,131.8,129.8,129.4,127.6,119.7,119.3,117.3,115.7,112.7,112.4,109.4,108.8, 107.3,94.5,85.6,70.2,62.4,48.1,45.9,45.1,44.5,11.2,9.9。
实施例5：细胞培养和荧光成像；
HeLa细胞(人宫颈癌细胞)来源于湖南大学化学生物传感与计量学国家重点实验室。 HeLa细胞培养在含10％的胎牛血清和1％的盘尼西林的DMEM培养液中，在37℃和5％二氧化碳条件下培养24h。然后接种到激光共聚焦培养皿中，继续孵育12h，待细胞贴壁后可进行荧光成像实验。
内源性生物硫醇的检测，首先移除培养基，PBS缓冲液漂洗细胞三次，将探针1(10μM) 加入到培养皿中，在37℃和5％二氧化碳条件下与细胞孵育30分钟，PBS漂洗后进行荧光成像。外源性生物硫醇的检测，首先移除培养基，PBS缓冲液漂洗细胞三次，将N-乙基马来酰亚胺(NEM，1.0mM)加入到培养皿中，在37℃下与细胞孵育30分钟，用PBS缓冲液漂 洗细胞三次，随后分组与Cys/Hcy/GSH/H2S(500μM)孵育30分钟，用PBS缓冲液漂洗细胞 三次，将探针1(10μM)加入到培养基中孵育30分钟，PBS漂洗后进行荧光成像。对照组中， 将NEM(1.0mM)加入到培养皿中，在37℃下与细胞孵育30分钟，用PBS缓冲液漂洗细胞 三次，将探针1(10μM)加入到培养基中孵育30分钟，PBS漂洗后进行荧光成像。

Claims (1)

1.一种多通道同时区分检测Cys/Hcy，GSH和H2S的荧光探针，其结构如式(I)所示；
其特征在于该荧光探针用于环境或生物样品中的Cys/Hcy，GSH和H2S的荧光检测和分析。
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