KR101686886B1 - 플루오레세인을 기반으로 한 시스테인/호모시스테인에 선택적으로 반응하는 화합물 및 형광 프로브 - Google Patents

플루오레세인을 기반으로 한 시스테인/호모시스테인에 선택적으로 반응하는 화합물 및 형광 프로브 Download PDF

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Abstract

본 발명은 플루오레세인 구조를 기반으로 하는 화합물, 형광 프로브 및 이를 이용하여 시스테인, 포타슘 슈퍼옥사이드 또는 시스테인과 호모시스테인을 검출하는 방법을 제공한다. 본 발명은 수용액 및 세포 내의 상기 물질을 선택적으로 형광 검출할 수 있다.

Description

플루오레세인을 기반으로 한 시스테인/호모시스테인에 선택적으로 반응하는 화합물 및 형광 프로브{Compounds and fluorescent probes for selectively detecting cysteine/homocysteine based on fluorescein structure}
본 발명은 플루오레세인을 기반으로 한 화합물, 형광 프로브 및 이의 시스테인, 포타슘 슈퍼옥사이드 혹은 시스테인과 호모시스테인을 검출하기 위한 용도에 관한 것이다.
시스테인, 호모시스테인 및 글루타티온은 생명시스템의 여러 과정들에 필요한 낮은 몰질량의 바이오티올이다. 이 아미노산들은 단백질 합성, 물질대사, 해독과정, 신호전달 및 유전자 조절과정과 같은 생리학적인 프로세스에 관여하며, 또한 산화상태 조절과 단백질 구조를 형성하는데 쓰인다(1-6).
이 중에서 시스테인과 호모시스테인은 매우 중요한 생체 물질인데, 특히 세포와 조직의 성장에 중요한 역할을 하며, 만일 체내 불균형이 일어난다면 머리탈색, 더딘 성장, 부종의 생성, 간 손상, 근육약화, 피부병변 및 근육과 지방의 손실과 같은 많은 심각한 질병의 원인이 된다(7). 또한, 알츠하이머 질병을 일으키는 주요 원인 중 하나이다. 이러한 이유로 생체 내 시스테인과 호모시스테인을 감지하기 위한 형광 프로브의 개발이 요구된다.
이런 바이오티올의 감지를 위한 형광분자 프로브들은 간단성과 세포 내 감지의 가능성, 선택성 그리고 민감성과 같은 좋은 장점을 갖고 있다. 시스테인과 호모시스테인을 감지할 수 있는 프로브들이 많이 개발되어져 왔으나, 그 둘의 구조적 유사성으로 인해 구별이 쉽지 않다(8-15). 이러한 이유로 이 둘을 구별할 수 있는 프로브는 많이 개발되어있지 않다.
최근에 meso-aryl BODIPY를 기초로 하는 프로브(16)나 시아닌-베이스로 된 프로브(17)나 반나프탈로플루오레세인을 기반으로 한 프로브(18) 시스템 등이 보고된바 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
J. B. Schulz, J. Lindenau, J. Seyfried, J. Dichgans, Eur. J. Biochem., 2000, 267, 4904. S. Seshadri, A. Beiser, J. Selhub, P. F. Jacques, I. H. Rosenberg, R. B. D'Agostino, P. W. F. Wilson, P. A. Wolf, N. Engl. J. Med., 2002, 346, 476. R. O. Ball, G. Courtney-Martin, P. B. Pencharz, J. Nutr., 2006, 136, 1682S. R. Hong, G. Han, J. M. Fernandez, B. J. Kim, N. S. Forbes, V. M. Rotello, J. Am. Chem. Soc., 2006, 128, 1078. X. Chem, Y. Zhou, X. J. Peng, J. Yoon, Chem. Soc. Rev., 2010, 39, 2120. Z. A. Wood, E. Schroder, J. R. Harris, L. B. Poole, Trends. Biochem. Sci., 2003, 28, 32.) S. Shahrokhian, Anal. Chem. 2001, 73, 5972-5978 W. H. Wang, J. O. Escobedo, C. M. Lawrence, R. M. Strongin, J. Am Chem. Soc., 2004, 126, 3400. X. F. Yang, Y. X. Guo, R. M. Strongin, Angew. Chem., Int. Ed., 2011, 50, 10690. H. L. Li, J. L. Fan, J. Y. Wang, M. Z. Tian, J. J. Du, S. G. Sun, P. P. Sun, X. J. Peng, Chem. Commun., 2009. 48. 5904. H. L. Chen, Q. Zhao, Y. B. Wu, F. Y. Li, H. Yang, T. Yi, C. H. Huang, Inorg. Chem., 2007, 46, 11075. H. P. Wu, C. C. Huang, T. L. Cheng, W. L. Tseng, Talanta., 2008, 76, 347. J. Mei, Y. J. Wang, J. Q. Tong, J. Wang, A. J. Qin, J. Z. Sun, B. Z. Tang, Chem. Eur. J., 2013, 19, 612. H. L. Wang, G. D. Zhou, H. W. Gai, X. Q. Chen, Chem. Commun., 2012, 48, 8341. L. G. Wang, Q. Zhou, B. C. Zhu, L. G. Yan, Z. M.　Ma, B. Du, X. L. Zhang, Dyes Pigm., 2012, 95, 275 O. G. Tsay, K. M. Lee, and D. G. Churchill, New. J. Chem., 2012, 36, 1949-1952 Z. Guo, S. W. Nam, S. Park, and J. Yoon, Chem. Sci., 2012, 3, 2760-2765 X. Yang, Y. Guo, and R. M. Strongin, Org. Biomol. Chem., 2012, 10, 2739-2741
본 발명자들은 바이오티올과 활성산소종을 선택적으로 검출할 수 있는 분자 프로브를 개발하기 위하여 연구 노력하였다. 그 결과, 수용액 내 또는 신경세포 내에서 시스테인, 포타슘 슈퍼옥사이드, 또는 시스테인과 호모시스테인을 고특이도 및 고민감도로 검출할 수 있는 플루오레세인 구조에 기반 한 형광 프로브 화합물을 합성함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 화학식 1의 화합물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 시스테인 검출용 형광 프로브를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 시스테인과 호모시스테인 검출용 형광 프로브를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 포타슘 슈퍼옥사이드 검출용 형광 프로브를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 시험관 내에서(in vitro) 시스테인을 선택적으로 검출 또는 정량하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 시험관 내에서(in vitro) 시스테인과 호모시스테인을 검출하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 시험관 내에서(in vitro) 포타슘 슈퍼옥사이드를 선택적으로 검출 또는 정량하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 하기 화학식 1의 화합물을 제공한다:
화학식 1
Figure 112014009951047-pat00001
상기 화학식에서, X1은 O, S, Se 또는 Te이고; X2는 -CH2- 또는
Figure 112014009951047-pat00002
이며; 상기 두 개의 R1은 모두
Figure 112014009951047-pat00003
[A는 CnH2n(n=1-10)이고, B는 할로겐이다)이거나, 1 내지 5개의 NO2로 치환된 페닐이거나, 또는 C3 -12 알케닐이다.
본 발명자들은 바이오티올과 활성산소종을 선택적으로 검출할 수 있는 분자 프로브를 개발하기 위하여 연구 노력하였다. 그 결과, 수용액 내 또는 신경세포 내에서 시스테인, 포타슘 슈퍼옥사이드, 또는 시스테인과 호모시스테인을 고특이도 및 고민감도로 검출할 수 있는 플루오레세인 구조에 기반 한 형광 프로브 화합물을 합성하였다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명의 화합물은 상기 화학식 1 중, X1은 O, S, Se 또는 Te이고; X2는 -CH2- 또는
Figure 112014009951047-pat00004
이며; 상기 두 개의 R1은 모두
Figure 112014009951047-pat00005
[A는 CnH2n(n=1-10)이고, B는 할로겐이다)인 화합물이다.
상기 할로겐은 할로겐족 원소를 나타내며, 예컨대, 플루오로, 클로로, 브로모 및 요오도를 포함한다.
하나의 특정예에서, 상기 A 중 n=1-7이고, 다른 특정예에서는 n=1-5이다.
본 발명의 다른 일구현예에 따르면, 본 발명의 화합물은 상기 화학식 1 중, X1은 O, S, Se 또는 Te이고; X2는 -CH2- 또는
Figure 112014009951047-pat00006
이며; 상기 두 개의 R1은 모두 1 내지 5개의 NO2로 치환된 페닐인 화합물이다.
하나의 특정예에서, 상기 페닐의 NO2기는 1-4개이고, 다른 특정예에서는 1-3개이며, 또 다른 특정예에서는 1-2개이다.
본 발명의 또 다른 일구현예에 따르면, 본 발명의 화합물은 상기 화학식 1 중, X1은 O, S, Se 또는 Te이고; X2는 -CH2- 또는
Figure 112014009951047-pat00007
이며; 상기 두 개의 R1은 모두 C3 -12 알케닐이다.
하나의 특정예에서, 상기 알케닐은 C3-10 알케닐이고, 다른 특정에에서는 C3-8 알케닐이며, 또 다른 특정예에서는 C3-5 알케닐이다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 X1은 산소이다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 X2는
Figure 112014009951047-pat00008
이다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 화합물은 하기 화학식 2, 3 또는 4로 표현되는 화합물인 것을 특징으로 하는 화합물이다.
화학식 2 [프로브 1]
Figure 112014009951047-pat00009
화학식 3 [프로브 2]
Figure 112014009951047-pat00010
화학식 4 [프로브 3]
Figure 112014009951047-pat00011

본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 화합물은 세포 투과성이다. 하기 실시예에서 확인된 바와 같이, 본 발명의 화합물은 (신경)세포 투과성이므로 (신경)세포 내 시스테인 또는 시스테인과 호모시스테인의 검출에 유용하게 활용될 수 있다(도 5, 14 및 21 참조). 또한, 본 발명의 화합물은 미토콘드리아 내로 들어갈 수 있다(도 15 참조).
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 화학식 1의 화합물 중, X1은 O, S, Se 또는 Te이고; X2는 -CH2- 또는
Figure 112014009951047-pat00012
이며; 상기 두 개의 R1은 모두
Figure 112014009951047-pat00013
[A는 CnH2n(n=1-10)이고, B는 할로겐이다)이거나, 또는 C3 -12 알케닐인 것을 특징으로 하는 시스테인 검출용 형광 프로브를 제공한다.
상기 용어 "검출"은 시료 내에 시스테인이 존재하는지 여부를 확인하는 것뿐만 아니라(정성적 분석), 이의 양을 알아내는 것(정량적 분석)도 포함한다.
도 1의 메커니즘에 나타난 바와 같이, 상기 형광 프로브(두 개의 R1이 모두
Figure 112014009951047-pat00014
인 화합물)는 시스테인과 반응 후에 사이드 프로덕트로서 7-원환(7-membered ring)을 형성시키는데, 이는 호모시스테인과 함께 형성되는 8-원환보다 속도론적으로 선호되므로 시스테인과 호모시스테인의 식별이 가능하다. 이러한 형광 프로브의 예로는 하기에 기재된 프로브 1을 들 수 있다.
또한, 도 16의 메커니즘에 나타난 바와 같이, 상기 형광 프로브(두 개의 R1이 모두 C3-12 알케닐인 화합물)는 플루오레세인의 비닐(vinylic) 위치에서 일어나는 친핵성 첨가-제거반응을 통해 시스테인의 선택적 검출이 가능하다. 이러한 형광 프로브의 예로는 하기에 기재된 프로브 3을 들 수 있다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 형광 프로브는 호모시스테인의 존재 하에서 시스테인을 선택적으로 검출할 수 있다.
상기 형광 프로브는 이를 포함하는 조성물, 키트 또는 케모도시미터(chemodosimeter) 등의 형태로 제공될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 형광 프로브를 이용하여 시험관 내에서(in vitro) 시스테인을 선택적으로 검출 또는 정량하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 시스테인을 선택적으로 검출 또는 정량하는 방법은, (a) 상기 형광 프로브에 검출 시료를 혼합하는 단계; (b) 상기 혼합물에 여기 파장의 광을 조사하는 단계; 및 (c) 상기 여기 파장의 광에 의한 형광 증폭 신호를 검출하여 시스테인을 검출하거나, 또는 시스테인의 양을 정량하는 단계를 포함한다.
상기 정량은 단계 (c)에서 얻은 형광 증폭 신호 값을 형광 프로브와 시스테인의 표준곡선에 대입하여 시료 내 시스테인의 농도를 알아냄으로써 이루어질 수 있다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 검출 시료는 수용액, 유기용액, 세포, 세포 용해물(cell lysate), 혈액, 혈장, 혈청, 림프, 타액, 뇨, 정액 및 복수로 구성된 군으로부터 선택된다. 하나의 특정예에서 상기 시료는 (신경)세포이며, 이에 따라 본 발명에 의하여 세포 내 시스테인의 정성 및 정량분석이 가능하다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 화학식 1의 화합물 중, X1은 O, S, Se 또는 Te이고; X2는 -CH2- 또는
Figure 112014009951047-pat00015
이며; 상기 두 개의 R1은 모두 1 내지 5개의 NO2로 치환된 페닐인 것을 특징으로 하는 시스테인과 호모시스테인, 또는 포타슘 슈퍼옥사이드(KO2) 검출용 형광 프로브를 제공한다.
도 6의 메커니즘에 나타난 바와 같이, 상기 형광 프로브는 선택적으로 바이오티올과 슈퍼옥사이드를 검출할 수 있는데, 이는 벤질 위치에서의 친핵성 첨가-제거 반응을 이용하는 것이다. 이러한 형광 프로브의 예로는 하기에 기재된 프로브 2를 들 수 있다.
상기 형광 프로브는 이를 포함하는 조성물, 키트 또는 케모도시미터(chemodosimeter) 등의 형태로 제공될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 형광 프로브를 이용하여 시험관 내에서(in vitro) 시스테인과 호모시스테인을 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 시스테인과 호모시스테인을 검출하는 방법은, (a) 상기 형광 프로브에 검출 시료를 혼합하는 단계; (b) 상기 혼합물에 여기 파장의 광을 조사하는 단계; 및 (c) 상기 여기 파장의 광에 의한 형광 증폭 신호를 검출하여 시스테인과 호모시스테인을 검출하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 검출 시료는 수용액, 유기용액, 세포, 세포 용해물(cell lysate), 혈액, 혈장, 혈청, 림프, 타액, 뇨, 정액 및 복수로 구성된 군으로부터 선택된다. 하나의 특정예에서, 상기 시료는 (신경)세포이며, 이에 따라 본 발명에 의하여 세포 내 시스테인과 호모시스테인의 검출이 가능하다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 형광 프로브를 이용하여 시험관 내에서(in vitro) 포타슘 슈퍼옥사이드를 선택적으로 검출 또는 정량하는 방법을 제공한다.
상기 포타슘 슈퍼옥사이드의 선택적 검출 또는 정량방법은 상기에서 설명한 검출 및 정량방법과 같으므로, 이에 대한 설명은 생략한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(i) 본 발명은 플루오레세인 구조를 기반으로 하는 화합물, 형광 프로브 및 이를 이용하여 시스테인, 포타슘 슈퍼옥사이드 또는 시스테인과 호모시스테인을 검출하는 방법을 제공한다.
(ii) 본 발명은 수용액 및 세포 내의 상기 물질을 선택적으로 형광 검출할 수 있다.
도 1은 프로브 1과 시스테인의 제안된 화학 및 광물리학적 메커니즘을 보여준다.
도 2는 프로브 1(4.0 X 10-6 M, buffered H2O: DMSO 80:20; pH 7.4 PBS)과 아미노산(L-Cys, Hcy, N-acetyl-L-Cys, Met, GSH, Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val; 물에 용해된 ~10 당량)을 상온에서 10분간 인큐베이션 한 후의 발광 스펙트럼을 보여준다.
도 3은 프로브 1(4.0 X 10-6 M, buffered H2O: DMSO 80:20; pH 7.4 PBS)을 L-Cys(물에 용해된 16.6 내지 166.5 μM)과 함께 상온에서 10분간 인큐베이션 한 후의 발광 스펙트럼(A), 및 프로브 1(2.0 X 10-6 M, buffered H2O: DMSO 80:20; pH 7.4 PBS)을 Cys(물에 용해된 ~10 당량)과 함께 인큐베이션 한 후의 시간 의존적 발광 스펙트럼(B)을 보여준다. λexci = 490 nm.
도 4는 프로브 1(4.0 X 10-6 M, buffered H2O:DMSO 80:20; pH 7.4 PBS)을 처리한 시스테인(5 μM, 10 μM, 15 μM 및 20 μM)의 상대적 형광 세기(A), 프로브 1(4.0 X 10-6 M, buffered H2O:DMSO 80:20; pH 7.4 PBS)을 처리한 인간 혈장(10 ㎕, 20 ㎕)의 상대적 형광 세기(B), 및 시스테인 농도(5 μM, 10 μM, 15 μM 및 20 μM)와 발광 강도의 표준 편차 그래프(C)를 보여준다.
도 5는 살아있는 SH-SY5Y 세포의 형광 현미경 이미지이다. (A) SH-SY5Y 세포를 DMSO(vehicle)와 함께 인큐베이션 하였다. (B) 프로브 1(1 μM)과 함께 10분간 인큐베이션 하였다. (C) SH-SY5Y 세포를 NEM(1 mM)과 함께 30분간 전-인큐베이션 하였다. (D) 프로브 1(1 μM)과 함께 10분간 인큐베이션 하였다. λexc = 490 nm, 스케일 바 = 50 μm.
도 6은 프로브 2의 합성과 메커니즘을 보여준다.
도 7은 프로브 2(4.0 X 10-6 M, buffered H2O/DMSO 80:20; pH 7.2; 10 mM HEPES)를 아미노산(L-Cys, Hcy, N-acetyl-L-Cys, Met, GSH, Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val; 물에 용해된 3.3 X 10-3 M)과 상온에서 20분간 인큐베이션 한 후의 발광 스펙트럼(왼쪽) 및 프로브 2(4.0 X 10-6 M, buffered H2O/DMSO 80:20; pH 7.2; 10 mM HEPES)를 시스테인과 호모시스테인(물에 용해된 ~10 equiv)과 함께 반응시킨 후의 시간 의존적 발광 스펙트럼(오른쪽)을 보여준다.
도 8은 프로브 2(4.0 X 10-6 M, buffered H2O/DMSO 80:20; pH 7.2; 10 mM HEPES)를 시스테인(~10 equiv) 및 다른 아미노산(왼쪽부터 순서대로 N-acetyl-L-Cys, Met, GSH, Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val; ~10 equiv)과 반응시킨 후의 상대적인 형광 세기를 보여준다.
도 9는 프로브 2(4.0 X 10-6 M, buffered H2O/DMSO 80:20; pH 7.2; 10 mM HEPES)를 호모시스테인(~10 equiv) 및 다른 아미노산(왼쪽부터 순서대로 N-acetyl-L-Cys, Met, GSH, Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val; ~10 equiv)과 반응시킨 후의 상대적인 형광 세기를 보여준다.
도 10의 좌측 도는 프로브 2(4.0 X 10-6 M, buffered H2O/DMSO 80:20; pH 7.2; 10 mM HEPES)를 ROS(KO2, H2O2, NaOCl, tBuOOH, ㆍOH, ㆍOtBu, m-CPBA; 물에 용해된 3.3 X 10-3 M)와 함께 상온에서 20분간 인큐베이션 한 후의 발광 스펙트럼을 보여준다. λexci = 490 nm, slit width Ex, Em = 1.5.
도 10의 우측 도는 프로브 2(2.0 X 10-6 M, buffered H2O/DMSO 80:20; pH 7.2; 10 mM HEPES)와 KO2(물에 용해된 ~10 equiv)의 시간 의존적 발광 스펙트럼을 보여준다.
도 11은 프로브 2(4 X 10-6 M, buffered H2O/DMSO 80:20; pH 7.2; 10 mM HEPES)를 KO2와 다른 ROS와 함께 상온에서 10분간 인큐베이션 한 후의 상대적인 형광 세기를 보여준다. (A) 프로브 2, (B) KO2, (C) KO2 + m-CPBA, (D) KO2 +NaOCl, (E) KO2 + ㆍOH, (F) KO2 + tBuOOH, (G) KO2 + ㆍOtBu, (H) KO2 + H2O2(~10 equiv). λ exci = 310 nm.
도 12는 기질과 프로브 2에 대한 진리표와 함께 바이오티올과 수퍼옥사이드를 갖는 "OR" 논리 게이트를 보여준다.
도 13은 프로브 2 + L-cys의 ESI-질량 스펙트럼을 보여준다.
도 14는 SH-SY5Y 세포의 형광 현미경 이미지를 보여준다. (A) SH-SY5Y 세포를 프로브 2(10 μM)와 함께 30분간 인큐베이션하고, Mitotracker Red(100 nM)와 함께 10분간 인큐베이션 하였다. (B) SH-SY5Y 세포를 NEM(1.0 mM)과 함께 30분 동안 전-인큐베이션한 후, 프로브 2(10 μM)와 함께 10분간 인큐베이션 한 다음, Mitotracker Red(100 nM)와 함께 10분간 인큐베이션 하였다. (C) SH-SY5Y 세포를 DMSO(vesicle)과 함께 30분간 인큐베이션 하였다. 1, 명시 야상; 2, 형광 이미지(490 nm); 3, 형광 이미지(590 nm). 스케일 바 길이 = 10 μm. 여기 레이저원은 수은 램프이다.
도 15는 프로브 2(왼쪽) 또는 Mitotracker Red(오른쪽)와 함께 인큐베이션 한 SH-SY5Y 세포의 확대 이미지를 보여준다. 스케일 바 = 10 μm.
도 16은 프로브 3의 시스테인 검출 메커니즘을 보여준다.
도 17은 프로브 3(4.0 X 10-6 M, buffered H2O: DMSO 80:20; pH 7.4 PBS)을 아미노산(L-cys, Hcy, N-acetyl-L-Cys, Met, GSH, Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val; 물 내 66 μM)과 함께 상온에서 20분간 인큐베이션 한 후의 발광 스펙트럼을 보여준다. slit width Ex. & Em. = 1.5 nm.
도 18은 프로브 3(4.0 X 10-6 M, buffered H2O: DMSO 80:20; pH 7.4 PBS)을 L-Cys(물에 용해된 33.3 내지 266 μM)과 함께 상온에서 20분간 인큐베이션 한 후의 발광 스펙트럼(왼쪽), 및 프로브 3(2.0 X 10-6 M, buffered H2O: DMSO 80:20; pH 7.4 PBS)을 Cys(물에 용해된 200 μM)과 함께 인큐베이션 한 후의 시간 의존적 발광 스펙트럼(오른쪽)을 보여준다. λexci = 490 nm, slit width Ex. & Em. = 1.5 nm.
도 19는 혼합 용액에서 시스테인(33.3-266 μM)이 기능하는 동안 프로브 3의 발광 스펙트럼의 변화를 보여준다. 시스테인을 프로브 3에 첨가한 후 20분에 각 스펙트럼을 기록하였다.
도 20은 프로브 3(4 X 10-6 M, buffered H2O/DMSO 80:20; pH 7.4 PBS)을 시스테인(~10 당량)과 다른 아미노산(A - 프로브 3, B - 프로브 3 + cys, C - 프로브 3 + cys + GSH, D - 프로브 3 + cys + Hcy, E - 프로브 3 + cys + N-acetyl-L-Cys(~10 equiv)과 함께 인큐베이션 한 후의 상대적인 형광 세기를 보여준다. λexci = 490 nm. Slit width = 1.5.
도 21은 살아있는 SH-SY5Y 세포와 DMSO 또는 프로브 3(1-20 μM)의 형광 현미경 이미지(왼쪽), 및 NEM으로 전처리된 세포의 형광 현미경 이미지(오른쪽)이다. 스케일 바 = 10 μm.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1. 프로브 1의 합성 및 기능 확인
1-1. 실험방법
실험재료
모든 시약은 공급업체(Aldrich, Acros 및 Junsei companies)에서 구입하였다. 1H 및 13C NMR 스펙트럼은 Bruker Avance 400 MHz 분광기를 사용하여 얻었다. TMS를 내부 표준으로 사용하였다. 1H 및 13C NMR 스펙트럼 신호는 각각의 프로티오(protio) 불순물 또는 NMR 분광 용매(예컨대, CDCl3)로 캘리브레이션 하였다. ESI-질량분석을 VG AUTOSPEC ULTIMA로 실시하였다. JASCO V-530 UV/Vis 분광 광도계를 사용하여 흡수 스펙트럼을 측정하였다. Shimadzu RF-5301pc 분광형광 광도계를 사용하여 형광을 측정하였다. slit width Ex, Em = 1.5.
프로브 1의 합성
[반응식 1]
Figure 112014009951047-pat00016
CHCl3(10 ㎖)에 녹인 염화 3-클로로프로피오닐(3-Chloropropionyl chloride; 0.65 ㎖, 3 당량)을, 차갑게 교반 중인 플루오레세인(0.50 g)과 1N NaOH(4 ㎖)를 녹인 클로로포름(20 ㎖) 용액에 5분에 걸쳐 조금씩 첨가하였다. 혼합물은 실온에서 24시간 동안 교반한 후 용매를 제거하고, 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 흰색의 고체물질로서 프로브를 수득하였다(0.208 gm, 수득률 : 27%).
1 H NMR spectroscopy: (400 MHz, CDCl3) : 8.01 (d, 3J(H,H) = 7.12Hz, 1H), 7.68-7.59(2H, m), 7.15(d,3J(H,H) = 7.12Hz, 1H)7.10 6.81 (S, 4H), 3.84 (t, 3J(H,H) = 6.48Hz, 4H), 3.04(t, 3J(H,H) = 6.48Hz, 4H).
13 C NMR spectroscopy: (100 MHz, CDCl3): 169.05, 168.30, 152.87, 151.75, 151.53, 135.31, 130.10, 129.02, 126.04, 125.26, 123.01, 117.65, 116.77, 110.34, 81.48, 38.66, 37.65.
ESI-MS: probe-1 [M+Na]+ = 535.0327(calc.), 535.0327(exp.) probe 1 + L-cys [M+H]+ = 333.076 (calc.), 333.073 (exp.) [Fluorescein]
[프로브 1: 화합물 2]
Figure 112014009951047-pat00017

살아있는 세포 내 시스테인 분석
인간 신경모세포종 세포주인 SH-SY5Y를 10% FBS, 100 U/㎖ 페니실린 및 100 ug/㎖ 스트렙토마이신이 첨가된 DMEM(Eagles's Minimum Essential Medium)과 Ham's F12 배지의 혼합 배지(1:1)에서 5% CO2 인큐베이터에서 37℃의 온도로 인큐베이션 하였다. 실험 하루 전, 세포를 ~80%의 컨플루언시로 24-웰 플레이트에 분주하였다. 세포를 프로브 1(1 μM) 또는 DMSO(vesicle)와 함께 10분간 인큐베이션하고, PBS로 세척하였다. NEM(N-ethyl maleimide) 처리 샘플을 위하여, 세포를 NEM(1 mM)과 함께 30분간 전-인큐베이션 하였다. 형광 이미징 전에 세포를 PBS로 세 번 세척하였다. 세포의 형광 이미지는 epifluorescence 현미경(Olympus, JP IX-71)과 디스크 스캐닝 공초점 현미경(Olympus, JP IX2-DSU)을 사용하여 얻었다. 여기 원(excitation source)은 490 nm 레이저였으며, 모든 이미지는 동일한 실험 조건 하에서 수득하였다.
1-2. 실험결과
프로브 1은 지방족 클로라이드 치환(aliphatic chloride substitution)을 기초로 디자인되었다. 이것은 플루오레세인과 고리화된 물질을 생성함으로써 클로로프로피오네이트와 시스테인의 티올과 함께 분자 내 고리화 반응을 허락한다(반응식 1 및 도 1). 시스테인과 프로브 1의 반응 후에 독립적으로 형성되어진 사이드 프로덕트는 7-원환(7-membered ring)으로서 호모시스테인과 함께 형성되는 8-원환보다 속도론적으로 선호되므로, 이 고리형성 과정을 통해 시스테인과 호모시스테인의 식별이 가능하다.
반응 시간적으로 볼 때 또한 시스테인과 호모시스테인 사이의 구분이 가능하다. 8-원환의 형성은 더 긴 시간이 걸리므로 호모시스테인의 감지가 더 느리다. 그 이유는 7-원환을 형성하기 위한 분자 내 고리화 반응이 8-원환과 대조적으로 더 빠르고 선호되기 때문이다. 그러므로 클로로프로피오네이트 그룹은 호모시스테인에 대한 시스테인 검출의 좋은 모이어티(moiety)가 된다. 본 발명의 프로브 1은 더 선택적이고, 살아있는 신경 세포와 인간 혈장에서의 검출 시간이 매우 빠르다. 또한, 클로로프로피오네이트는 호모시스테인이 아닌 오직 시스테인만 검출한다. 나아가, 본 발명의 프로브의 검출 한계는 12.8 μM로 확인되었다.
프로브 1의 광물리적 특성을 생리학적 조건(buffered H2O: DMSO 80:20; pH 7.4 PBS)에서 조사하였다. 프로브를 먼저 DMSO에 용해시키고, 80% PBS 버퍼(pH 7.4)로 희석하였다. 프로브의 검출 특성을 UV-vis 흡수 및 방출 분광법(UV-vis absorption and emission spectroscopy)으로 평가하였다.
황을 갖는 아미노산(L- cys, Hcy, N-acetyl-L-Cys, Met, GSH) 및 황을 갖지 않는 아미노산(Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val)과 프로브 1을 반응시켰다. 약 66 μM의 수용액으로 분석물질들을 준비하였다. 여기에, 3.0 ㎖의 4.0 X 10-6 M PBS 버퍼, pH 7.4 프로브 용액을 ~10 당량의 아미노산과 함께 인큐베이션 하였다. ≤10분 후, 프로브 용액의 상당한 색변화가 시스테인에서 확인되었다. 상당한 형광 세기의 증가가 발광 분석을 통하여 확인되었다(도 2). 초기 프로브의 형광 세기에 비하여 시스테인에 대하여 250배 형광 세기가 증가하였고, 호모시스테인과 비교하여 4배 증가하였다(도 2). 시스테인의 농도 증가에 따라 꾸준한 형광 세기의 증가가 확인되었다(도 3의 a). 이를 근거로, 검출 한계(http://www.fda.gov/downloads/Drugs/Guidance ComplianceRegulatoryInformation/Guidances/ucm073384.pdf 참조)(3.3 X standard deviation (SD) of y/slope)가 12.8 μM로 추정되었으며, 이러한 결과는 생물학적 시스템에서 시스테인의 검출을 위한 프로브의 실용성을 보여주는 것이다. 또한, 프로브에 의한 강도의 변화를 1시간 동안 측정한 경우, 25분 후에 안정기에 접어든 형광 세기의 매우 부드러운 증가가 기록되었다(도 3의 b).
프로브의 생물학적 물질에서 시스테인을 검출할 수 있는 용도로의 이용가능성을 평가하기 위하여, 인간 혈장(Sigma-Aldrich)을 이용하여 실험을 수행하였다. 시스테인이 포함된 프로브 1의 표준 용액을 각 농도(5 μM, 10 μM, 15 μM 및 20 μM)로 제조하였다. 시스테인 혈장의 정확한 농도를 측정하기 위하여, 프로브 1을 10 ㎕ 및 20 ㎕의 인간 혈장과 함께 10분간 인큐베이션 하였다. 시스테인이 함유된 프로브 1의 표준 용액을 이용한 표준편차 곡선을 사용하여, 혈장 내 시스테인의 정확인 농도를 계산하였다(11.7 μM; 도 4). 인간 혈장에서의 검출 한계는 위에서 언급한 검출 한계와 비교하여 낮았다. 첨가된 시스테인의 양은 매우 높았다(10 ㎕의 농도). 20 ㎕는 더 낮은 검출 한계의 원인이 될 수 있다.
끝으로, 살아있는 신경 세포를 이용하여 프로브 1을 테스트하였다. 그 결과, 1 μM 프로브 1의 세포 내 시스테인에 대한 빠른 반응이 10분 안에 확인되었다. 이러한 결과는 NEM 실험을 통하여 추가 검증되었다(도 5). 이상의 결과로부터, 프로브 1을 살아있는 신경 세포에서 10분 내 시스테인을 검출하기 위하여 사용할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 2. 프로브 2의 합성 및 기능 확인
2-1. 실험방법
실험재료
모든 시약은 공급업체(Aldrich, Acros 및 Junsei companies)에서 구입하였다. 1H 및 13C NMR 스펙트럼은 Bruker Avance 400 MHz 분광기를 사용하여 얻었다. TMS를 내부 표준으로 사용하였다. 1H 및 13C NMR 스펙트럼 신호는 각각의 프로티오(protio) 불순물 또는 NMR 분광 용매(예컨대, DMSO-d6)로 캘리브레이션 하였다. ESI-질량분석을 VG AUTOSPEC ULTIMA로 실시하였다. JASCO V-530 UV/Vis 분광 광도계를 사용하여 흡수 스펙트럼을 측정하였다. Shimadzu RF-5301pc 분광형광 광도계를 사용하여 형광을 측정하였다. slit width Ex, Em = 1.5.
프로브 2의 합성
[반응식 2]
Figure 112014009951047-pat00018
100 ㎖의 둥근바닥플라스크에 플루오레세인(1 gm, 3.012 mmol)과 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane(1.34 gm, 6.024 mmol)을 30 ㎖의 무수디메틸포름아미드(anhydrous Dimethylformamide)에 녹여 넣고, 아르곤을 주입한 비활성 대기하에서 반응을 진행시켰다. 15분 후에 3, 5-디니트로벤조일 클로라이드(3, 5-dinitrobenzoyl chloride; 2.7 gms. 6.024 mmol)를 첨가하고, 실온에서 18시간 동안 반응을 진행하였다. 이후, 150 ㎖의 물을 넣어 반응을 중단시키고 냉장고에 생성혼합물을 4시간 동안 보관하였다. 필터로 거른 후에 물을 이용하여 반복적으로 씻어내고 말려서 노란색 파우더의 프로브 2를 수득하였다(1.38 g. 수득률: 64 %).
1 H NMR spectroscopy: (400 MHz, DMSO-d6): 9.13-9.08 (6H, m), 8.10 (dd, 4J(H,H)/3J(H,H) = 1.08, 7.60 Hz, 1H), 7.87-7.80 (2H, m), 7.62-7.61 (2H, m), 7.48 (dd, 4J(H,H)/3J(H,H) = 1.20, 7.56 Hz, 1H), 7.24 (dd, 4J(H,H)/3J(H,H) = 2.72, 8.6 Hz, 2H), 7.04 (dd, 4J(H,H)/3J(H,H) = 2.72, 8.64 Hz, 2H),
13 C NMR spectroscopy: (100 MHz, DMSO-d6): 168.88, 161.67, 152.74, 152.07, 151.25, 148.86, 136.57, 132.43, 131.11, 129.91, 129.34, 125.81, 125.59, 124.60, 123.63, 118.96, 117.40, 111.06 and 81.26.
ESI-MS: probe-1 [M+H]+ = 721.069 (cal.), 721.076(exp.), probe 1 + L-cys [M+H]+ = 333.068 (cal.), 333.079 (exp.) [Fluorescein]
[프로브 2: 화합물 3]
Figure 112014009951047-pat00019

살아있는 세포 내 시스테인 분석
인간 신경모세포종 세포주인 SH-SY5Y를 10% FBS, 100 U/㎖ 페니실린 및 100 ug/㎖ 스트렙토마이신이 첨가된 DMEM(Eagles's Minimum Essential Medium)과 Ham's F12 배지의 혼합 배지(1:1)에서 5% CO2 인큐베이터에서 37℃의 온도로 인큐베이션 하였다. 실험 하루 전, 세포를 ~80%의 컨플루언시로 24-웰 플레이트에 분주하였다. 세포를 프로브 2(10 μM) 또는 DMSO(vesicle)와 함께 30분간 인큐베이션하고, PBS로 세척하고, Mitotracker Red(100 nM)와 함께 10분간 인큐베이션 하였다. NEM(N-ethyl maleimide) 처리 샘플을 위하여, 세포를 NEM(1.0 mM)과 함께 30분간 전-인큐베이션 하였다. 형광 이미징 전에 세포를 PBS로 세 번 세척하였다. 세포의 형광 이미지는 epifluorescence 현미경(Olympus, JP IX-71)과 디스크 스캐닝 공초점 현미경(Olympus, JP IX2-DSU)을 사용하여 얻었다. 여기 원은 490 nm 및 590 nm 레이저였으며, 모든 이미지는 동일한 실험 조건 하에서 현상하였다.
2-2. 실험결과
플루오레세인의 하이드록시기를 벤조일로 보호하여 3,5-디니트로벤조일 클로라이드(3,5-dinirobenzoyl chloride)와의 간단한 1-스텝 반응으로 수득률이 좋은 순물질을 프로브 2로서 합성하였다(도 6). 1H 및 13C NMR 분광분석과 질량 분석(ESI)을 통하여 프로브 2를 분석하였다. 프로브 2는 선택적으로 바이오티올과 슈퍼옥사이드를 검출할 수 있는데, 이는 벤질 위치에서의 친핵성 첨가-제거 반응을 이용하는 것이다(도 6).
프로브 2의 스펙트럼 특성을 생리적 조건(20 mM HEPES, pH 7.4)에서 분석하였다. 먼저, 프로브 2를 DMSO에 용해시킨 다음, 80% 10 mM HEPES, pH 7.2에서 희석시켰다. 프로브의 검출 특성을 UV-vis 흡수 및 방출 분광법으로 평가하였다.
벤조일 그룹이 존재하므로 다양한 아미노산과의 반응을 시도하였다. 황을 갖는 아미노산(L-Cys, Hcy, N-acetyl-L-Cys, Met, GSH)과 황을 갖지 않는 아미노산(Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val)을 구분해서 10 당량까지 프로브를 반응시킨 결과, 프로브 용액 색 변화가 오직 시스테인과 호모시스테인에서 확인되었다. 본 분석에서는, 3 ㎖의 프로브 용액(4 X 106 M, buffered H2O/DMSO 80:20; pH 7.2; 10 mM HEPES)을 10 당량의 아미노산과 함께 인큐베이션 하였다. 또한, 이 두 분석물질은 상당한 형광 강도의 증가를 보여주었다(310배 및 290배; 도 7). 또한, 시스테인과 호모시스테인을 각각 다른 아미노산과 경쟁반응 시킨 결과, 방출 강도의 변화가 확인되지 않았는데, 이러한 결과는 에스터 가수분해에 다른 아미노산이 참여하지 않음을 보여준다(도 8 및 9).
슈퍼옥사이드가 슈퍼 친핵체(Afanas'ev, I. B. Med. Hypotheses 2005, 64, 127.)임을 고려하여, 프로브 2를 슈퍼옥사이드와 반응시켜 보았다. 그 중 KO2가 바이오티올과 마찬가지로 에스터 분해 반응을 일으키며 동일한 반응을 나타내었다(도 10). 다른 활성산소종(ROS)을 첨가한 경우에는 특별한 반응이 일어나지 않았으며, 또한 경쟁반응에서도 다른 ROS에 의해 영향 받지 않았다(도 11). 이러한 결과를 통하여 2개의 인풋(input)으로 바이오티올과 슈퍼옥사이드를 검출할 수 있었으며, 이때 논리 게이트는 OR 게이트로 나타났다(도 12).
위의 발광 분석으로부터, 두 개의 인풋 논리 게이트 "OR" 시스템이 도출되었다. 여기서 상기 프로브 2는 두 개의 생물학적으로 중요한 인풋(바이오티올 및 슈퍼옥사이드)에 기반한 조합 논리 게이트 특성을 나타내는 분자 시스템으로서 기능한다. 시각적인 아웃풋은 OR 논리 게이트로 결론이 났으며, 우리는 세기의 "변화 있음"을 1로 "변화 없음"을 0으로 두었다(도 12). 그 이유는 선택성과 반응은 중간 반응이 없고, 오직 반응이 있음과 없음으로만 나타났기 때문이다.
제안된 검출 메커니즘을 뒷받침하기 위하여, 2 당량의 L-Cys과 프로브 1의 작은 규모의 반응을 수행하였다. L-Cys(3.0 mg)을 DMSO:D2O(9:1), 트리에틸 아민(100 ㎕)에 용해된 프로브 2(20 mg) 용액에 첨가하고, 상온에서 45분간 방치하였다. 이후, 혼합물을 여과하고, 여과물을 ESI 질량분석하였다. 상기 여과물은 플루오레세인처럼 보였으며, 형광 세기가 증가하였다(도 13).
세포 내 바이오티올 검출용 생물학적 센서로서 프로브 2의 실현 가능성을 알아보기 위하여, SH-SY6Y 세포를 사용하여 프로브 2에 대한 실험을 수행하였다(도 14). PBS 버퍼로 세척하기 전에 세포에 프로브 2(10 μM)를 30분간 처리하였다. 이후, Mitotracker Red(100 nM)와 함께 10분간 배양하고, 이미징(probe 2, λ exci = 490 nm; Mitotracker, λ exci = 590) 전에 세척하였다. "NEM 실험"을 위하여, 세포에 NEM(1.0 mM)을 30분간 전-처리하였다(이것은 세포 내 모든 시스테인 잔기를 소모시킨다). PBS 버퍼로 세척하고, 프로브 2(10 μM)와 함께 30분간 인큐베이션 하였다. 세포를 세척하고, Mitotracker Red(100 nM)와 함께 10분간 배양하고, 이미지를 얻기 전 다시 한 번 세척하였다. Mitotracker Red는 세포 생존율과 프로브 2의 세포 내 형광을 확인시켜 주었다.
SH-SY6Y 세포 어세이 결과를 통하여, 프로브 2가 세포에 잘 들어갈 수 있으며, 선택적으로 세포 내 시스테인을 검출할 수 있음을 알 수 있었다. Mitotracker red 실험은 프로브 2가 미토콘드리아(도 15)와 세포 내로 잘 들어갈 수 있으며, 시스테인의 신경적 검출이 가능하다는 것을 보여준다.
결과적으로, 새로운 플루오레세인 기반의 프로브는 생물학적으로 중요한 바이오티올(시스테인과 호모시스테인)의 검출을 위한 형광 화학도시미터(chemodosimeter)로서 작용하였다. 동시에 슈퍼옥사이드에 대해서도 반응하였다. 플루오레세인의 세기와 522 nm에서의 turn-on 반응은 자유 플루오레세인의 유리와 일치하며, 두 개의 인풋으로서 바이오티올과 슈퍼옥사이드를 갖는 새로운 "OR" 논리 게이트로 해석될 수 있다. 이것은 바이오티올과 슈퍼옥사이드를 에스터 가수분해를 통해 검출하는 첫 번째 프로브이다. 미래에 이 프로브의 변화는 부위-특이적 약물 전달에 유용하게 사용될 수 있을 것이다.
실시예 3. 프로브 3의 합성 및 기능 확인
3-1. 실험재료 및 실험방법
실험재료
모든 시약은 공급업체(Aldrich, Acros 및 Junsei companies)에서 구입하였다. 1H 및 13C NMR 스펙트럼은 Bruker Avance 400 MHz 분광기를 사용하여 얻었다. TMS를 내부 표준으로 사용하였다. 1H 및 13C NMR 스펙트럼 신호는 각각의 프로티오(protio) 불순물 또는 NMR 분광 용매(예컨대, CDCl3(1H: δ 7.24; 13C: δ 77.0))로 캘리브레이션 하였다. ESI-질량분석을 VG AUTOSPEC ULTIMA로 실시하였다. JASCO V-530 UV/Vis 분광 광도계를 사용하여 흡수 스펙트럼을 측정하였다. Shimadzu RF-5301pc 분광형광 광도계를 사용하여 형광을 측정하였다. slit width Ex, Em = 1.5.
프로브 3의 합성
[반응식 3]
Figure 112014009951047-pat00020
100 ㎖의 둥근 바닥 플라스크에 플루오레세인(0.50 gm, 1.5 mmol)과 비닐아세트산(0.25 ㎖, 3.0 mmol)을 30 ㎖의 테트라하이드로퓨란(tetrahydrofuran)에 녹여 넣고, EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide; 0.69 gm, 3.61 mmol)와 DMAP(4-dimethylaminopyridine; 0.367 gm, 3.01 mmol)를 첨가하여 하룻밤동안 실온에 두었다. 이후, 용매를 제거하고, 생성 혼합물을 대상으로 컬럼 크로마토그래피를 실시하고, 헥산:에틸 아세테이트(8:2)를 이용하여 정제하여, 흰색 고체상태의 프로브 3을 수득하였다(0.47 g. 수득률: 67 %).
1 H NMR spectroscopy: (400 MHz, CDCl3) : 8.10 (d, 3J(H,H)=7.24Hz, 1H), 7.69-7.60 (2H, m), 7.22-7.12 (5H, m), 6.84(d, 3J(H,H)=1.52Hz, 4H), 6.03 (d, 3J(H,H) = 15.6Hz, 2H), 1.95(dd, 4J(H,H)/3J(H,H) = 1.64, 6.92Hz, 6H).
13 C NMR spectroscopy: (100 MHz, CDCl3): 169.11, 164.10, 152.87, 152.20, 151.57, 147.93, 135.30, 130.06, 128.86, 126.13, 125.15, 124.07, 121.59, 117.83, 116.30, 110.41, 81.76, 18.27.
ESI-MS: probe-1 [M+Na]+ = 491.1107(calc.), 491.1101(exp.) probe 1 + L-cys [M+H]+ = 333.068 (calc.), 333.075 (exp.) [ Fluorescein ]
[프로브 3: 화합물 4]
Figure 112014009951047-pat00021

살아있는 세포 내 시스테인 분석
인간 신경모세포종 세포주인 SH-SY5Y를 10% FBS, 100 U/㎖ 페니실린 및 100 ug/㎖ 스트렙토마이신이 첨가된 DMEM(Eagles's Minimum Essential Medium)과 Ham's F12 배지의 혼합 배지(1:1)에서 5% CO2 인큐베이터에서 37℃의 온도로 인큐베이션 하였다. 실험 하루 전, 세포를 ~80%의 컨플루언시로 24-웰 플레이트에 분주하였다. 세포를 프로브 3(1-20 μM) 또는 DMSO(vehicle)와 함께 1시간 동안 인큐베이션하고, PBS로 세척하였다. NEM(N-ethyl maleimide) 처리 샘플을 위하여, 세포를 NEM(0.25 mM)과 함께 30분간 전-인큐베이션 하였다. 형광 이미징 전에 세포를 PBS로 세 번 세척하였다. 세포의 형광 이미지는 epifluorescence 현미경(Olympus, JP IX-71)과 디스크 스캐닝 공초점 현미경(Olympus, JP IX2-DSU)을 사용하여 얻었다. 여기 원은 490 nm 레이저였으며, 모든 이미지는 동일한 실험 조건 하에서 수득하였다.
2-2. 실험결과
플루오레세인과 비닐아세트산의 간단한 에스터화 반응을 원리로 프로브 3을 디자인 하였다. 굉장히 쉬운 단계를 통해 두 개의 에스터 그룹을 갖는 프로브 3을 얻었으며(반응식 3 및 도 16), 프로브 3을 더 많이 얻기 위하여 2 eq의 DMAP를 사용하였다. 열역학적으로 시스테인의 경우, 8-원환의 형성이 예측되었고, 9-원환이 호모시스테인에는 선호되지 않았으나, 이 반응에서는 시스테인이 7-원환이, 호모시스테인에서는 8-원환이 생겨났다. 이는 우리 물질이 이 링사이즈를 허락하는 역할을 하는 입체적 메틸그룹을 가졌기 때문이다. 작은 링사이즈에도 불구하고, 입체적 메틸그룹을 기초로 한 시스테인/호모시스테인의 움직임의 선택성은 효과적으로 보인다. 우리는 이 메커니즘을 통해 플루오레세인의 비닐(vinylic) 위치에서 일어나는 친핵성 첨가-제거반응을 통해 시스테인과 호모시스테인, 글루타티온을 위한 선택적인 센서를 얻었다.
프로브 3의 스펙트럼 특성을 생리적 조건(buffered H2O:DMSO 80:20; pH 7.4 PBS)에서 분석하였다. 먼저, 프로브를 DMSO에 용해시킨 다음, 80% PBS 버퍼, pH 7.4에서 희석시켰다. 프로브 3의 검출 특성을 UV-VIS 흡수 및 방출 분광법으로 평가하였다.
비닐 그룹이 존재하므로 다양한 아미노산과의 반응을 시도하였다. 황을 갖는 아미노산(L-Cys, Hcy, N-acetyl-L-Cys, Met, GSH)과 황을 갖지 않는 아미노산(Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val)을 구분해서 10 당량까지 프로브를 반응시킨 결과, 30분 후 프로브 용액 색 변화가 시스테인에서 확인되었다. 본 분석에서는, 3 ㎖의 프로브 용액(4 X 10-6 M, 1X PBS 버퍼, pH 7.4)을 10 당량의 아미노산과 함께 인큐베이션 하였다. 또한, 이 분석물질은 상당한 형광 강도의 증가를 보여주었다(도 17). 시작 프로브와 비교하여 형광 세기의 1390배 증가가 시스테인에 대하여 정량되었으며, 호모시스테인에 대한 신호보다 8배 높은 신호가 확인되었다(도 17).
일정한 형광 세기의 증가가 시스테인 농도 증가에 따라 관찰되었다(도 18의 a). 검출 한계는 11.3 μM로 추정되었는데, 이러한 결과는 상기 프로브를 생물학적 시스템 내에서 시스테인을 검출하는데 사용할 수 있음을 보여준다(도 19). 또한, 프로브를 시스테인과 1시간 이상 반응시킨 결과, 시간 의존적으로 형광 세기의 일정한 증가가 확인되었다(도 18의 b). 프로브의 선택성과 실제 적용가능성을 알아보기 위하여, 다른 티올-함유 종(Hcy, N-acetyl-L-Cys, Met 및 GSH)의 존재 하에서 프로브 3 + Cys 용액의 경쟁 분석을 실시하였다. 흥미롭게도, 모든 경우에서 형광 세기의 방해가 없었다(도 20).
제안된 메커니즘을 뒷받침하기 위하여, 30 ㎖의 MeOH : H2O(90 : 10, v/v) 용액에 용해된 프로브 3(1.0 당량)과 시스테인(2.5 당량)을 사용하여 분리 반응을 실시하였다. 반응 혼합물을 상온에서 1시간 동안 교반하였다. 이후, Et3N(100 ㎕)을 첨가하고, 용액을 1시간 동안 교반하였다. 그런 다음 용매를 제거하고, 조 생성물을 ESI-MS로 직접 확인하여 주 생성물로서 플루오레세인에 상응하는 값을 확인하였다. 마지막으로, 생성물을 1H-NMR 분광법으로 확인하였다. 주 생성물이 플루오레세인이기 때문에 높은 발광 강도(520 nm)가 야기되었다.
세포 내 바이오티올 검출용 센서로서 프로브 3의 유용성을 추가 평가하기 위하여, SH-SY5Y 세포를 사용한 실험을 실시하였다. 실험 결과, NEM 실험을 통하여 프로브가 세포 침투성이며, 세포 내 시스테인 검출에 선택성이 있음을 확인하였다(도 21).
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (14)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 하기 화학식 1의 형광 프로브를 포함하는 시스테인 검출용 조성물:
    화학식 1
    Figure 112015094810103-pat00029

    상기 화학식에서, X1은 O, S, Se 또는 Te이고; X2는 -CH2- 또는
    Figure 112015094810103-pat00030
    이며; 상기 두 개의 R1은 모두 C3-12 알케닐이다.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 형광 프로브는 호모시스테인의 존재 하에서 시스테인을 선택적으로 검출할 수 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 하기 화학식 1의 형광 프로브를 포함하는 시스테인과 호모시스테인 검출용 조성물:
    화학식 1
    Figure 112015094810103-pat00032

    상기 화학식에서, X1은 O, S, Se 또는 Te이고; X2는 -CH2- 또는
    Figure 112015094810103-pat00033
    이며; 상기 두 개의 R1은 모두 1 내지 5개의 NO2로 치환된 페닐이다.
  9. 하기 화학식 1의 형광 프로브를 포함하는 포타슘 슈퍼옥사이드 검출용 조성물:
    화학식 1
    Figure 112015094810103-pat00034

    상기 화학식에서, X1은 O, S, Se 또는 Te이고; X2는 -CH2- 또는
    Figure 112015094810103-pat00035
    이며; 상기 두 개의 R1은 모두 1 내지 5개의 NO2로 치환된 페닐이다.
  10. 하기 화학식 1의 형광 프로브를 이용하여 시험관 내에서(in vitro) 시스테인을 선택적으로 검출 또는 정량하는 방법:
    화학식 1
    Figure 112015094810103-pat00057

    상기 화학식에서, X1은 O, S, Se 또는 Te이고; X2는 -CH2- 또는
    Figure 112015094810103-pat00058
    이며; 상기 두 개의 R1은 모두 C3-12 알케닐이다.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 방법은
    (a) 상기 화학식 1의 형광 프로브에 검출 시료를 혼합하는 단계;
    (b) 상기 혼합물에 여기 파장의 광을 조사하는 단계; 및
    (c) 상기 여기 파장의 광에 의한 형광 증폭 신호를 검출하여 시스테인을 검출하거나, 또는 시스테인의 양을 정량하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 하기 화학식 1의 형광 프로브를 이용하여 시험관 내에서(in vitro) 시스테인과 호모시스테인을 검출하는 방법:
    화학식 1
    Figure 112015094810103-pat00059

    상기 화학식에서, X1은 O, S, Se 또는 Te이고; X2는 -CH2- 또는
    Figure 112015094810103-pat00060
    이며; 상기 두 개의 R1은 모두 1 내지 5개의 NO2로 치환된 페닐이다.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 방법은
    (a) 상기 화학식 1의 형광 프로브에 검출 시료를 혼합하는 단계;
    (b) 상기 혼합물에 여기 파장의 광을 조사하는 단계; 및
    (c) 상기 여기 파장의 광에 의한 형광 증폭 신호를 검출하여 시스테인과 호모시스테인을 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 하기 화학식 1의 형광 프로브를 이용하여 시험관 내에서(in vitro) 포타슘 슈퍼옥사이드를 선택적으로 검출 또는 정량하는 방법:
    화학식 1
    Figure 112015094810103-pat00061

    상기 화학식에서, X1은 O, S, Se 또는 Te이고; X2는 -CH2- 또는
    Figure 112015094810103-pat00062
    이며; 상기 두 개의 R1은 모두 1 내지 5개의 NO2로 치환된 페닐이다.
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