CN109836394A

CN109836394A - 一种用于识别硫化氢的近红外荧光探针及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN109836394A
Application number: CN201910146358.8A
Authority: CN
Inventors: 谭英; 张洁雯; 黄小婷; 谭春燕
Original assignee: Shenzhen Graduate School Tsinghua University
Current assignee: Shenzhen Graduate School Tsinghua University
Priority date: 2019-02-27
Filing date: 2019-02-27
Publication date: 2019-06-04
Anticipated expiration: 2039-02-27
Also published as: CN109836394B

Abstract

本发明属于有机小分子荧光探针领域，涉及一种用于识别硫化氢的近红外荧光探针及其制备方法和应用。该荧光探针具有式I所示的结构。本发明的探针为近红外探针，具有良好的生物组织渗透性、高灵敏度、高选择性、低细胞毒性，能够避免来自生物大分子背景荧光的干扰，可以用于活细胞的内源性硫化氢检测，具有广阔的应用前景。

Description

一种用于识别硫化氢的近红外荧光探针及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于有机小分子荧光探针领域，更具体地，涉及一种用于识别硫化氢的近红外荧光探针及其制备方法和应用。

背景技术

硫化氢是一种闻起来像臭鸡蛋的天然气体。继一氧化碳和一氧化氮之后，硫化氢是第三个被确定为具有信号传递功能的气体分子。作为一种重要的信号传递分子，内源性的硫化氢在许多生理和病理过程中扮演着重要的角色，如神经调节、抗炎、血管生成、血管舒张、动脉粥样硬化等。内源性的硫化氢可以通过半胱氨酸及其衍生物通过酶促反应产生，也可以在含硫化合物或多硫化合物在体内的代谢过程中通过非酶促途径产生。目前，已有四种酶被报道可以催化半胱氨酸及其衍生物生成硫化氢，分别是胱硫醚γ-裂解酶(CSE)，胱硫醚β-合成酶(CBS)，3-巯基丙酰胺硫转移酶(3-MST)和氨基转移酶(CAT)。最近的研究表明，多种肿瘤细胞会过度表达这些酶，因此这些肿瘤细胞中的硫化氢含量会高于普通细胞，而硫化氢可以促进肿瘤细胞的生长和增殖。然而，关于细胞内硫化氢的分子作用机制的研究和硫化氢含量与不同肿瘤细胞类型的关系研究还非常有限。因此，研发出一种可用于可视化定量检测活细胞内硫化氢分布的分子探针工具是非常有必要性的。

虽然已有文献报道了一些可用于细胞内硫化氢检测的荧光探针，但大多数的荧光探针发射波长都位于紫外可见光区域(400-600nm)，而许多生物体系内的小分子在紫外可见光波长范围内常会有自发荧光，会对荧光分析的灵敏度和准确度造成很大的影响。

因此，开发一种能够灵敏地对细胞内的硫化氢进行可视化检测的非紫外可见光区域的探针，对于理解硫化氢的生物学功能具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测硫化氢的荧光探针。本发明的探针为近红外探针，具有良好的生物组织渗透性、高灵敏度、高选择性、低细胞毒性，能够避免来自生物大分子背景荧光的干扰，可以用于活细胞的内源性硫化氢检测，具有广阔的应用前景。

为了实现上述目的，本发明的第一方面提供一种用于识别硫化氢的近红外荧光探针，该荧光探针具有式I所示的结构：

本发明在二氰基异氟尔酮母体上连接了一个NBD基团，合成了一种新型的特异性检测硫化氢的小分子荧光探针，简称NIR-NP。

本发明中，术语“探针”、“NIR-NP”均指代式I所示结构的化合物。

NIR-NP的结构及其检测硫化氢的原理如图1所示。该探针本身不发出荧光，当硫化氢存在时，NBD基团会通过硫解反应从二氰基异佛尔酮母体上被切除，母体部分则会重新恢复荧光，从而实现对硫化氢的特异性检测。

本发明第二发明提供上述用于识别硫化氢的近红外荧光探针的制备方法，该方法包括以下步骤：

1)将式II所示结构化合物(2-(3,5,5-三甲基环己-2-烯基)丙二腈)和式III所示结构化合物(4-(哌嗪-1-基)苯甲醛)溶于第一有机溶剂中，然后，在惰性气体的保护下向溶液中加入哌啶，加热回流进行反应，得到式IV所示结构化合物(REDCP)；

2)在惰性气体的保护下，将N,N-二异丙基-乙基胺(DIPEA)加入至含有式IV所示化合物和第二有机溶剂的溶液中，搅拌混匀后，在0-4℃下滴加NBD-Cl与第二有机溶剂的溶液，20-30℃下搅拌8-20h，得到具有式I所示结构的化合物。

所述NBD-Cl的结构如式V所示。

根据本发明，所述第一有机溶剂和第二有机溶剂均可以选自本领域可适用于上述反应的有机溶剂。

具体地，所述第一有机溶剂优选为无水乙醇。

具体地，所述第二有机溶剂优选为无水二氯甲烷(DCM)。

本发明的制备方法中，所述惰性气体优选为氮气和/或氩气。

根据本发明，在上述原料已经确定的情况下，原料用量均可以根据反应方程式和本领域常规用量确认，在此不作具体限定。每个反应步骤进行后，可选地对中间产物或最终产物进行纯化，所述纯化也可以为本领域常规的纯化方法，例如硅胶柱色谱法，所用洗脱剂亦可以为常规选择。

根据本发明一种具体的实施方式，所述制备方法包括以下步骤：

1)REDCP的制备：将2-(3,5,5-三甲基环己-2-烯基)丙二腈和4-(哌嗪-1-基)苯甲醛溶于无水乙醇中。然后，在氩气的保护下向溶液中加入哌啶。加热回流5小时后，将混合物溶液冷却至室温，减压除去溶剂。将粗产物通过硅胶柱色谱法纯化，用二氯甲烷/甲醇作为洗脱剂，得到红色固体REDCP。

2)NIR-NP的制备：在氩气的保护下，将N,N-二异丙基-乙基胺(DIPEA)加入到REDCP的无水二氯甲烷溶液中。搅拌均匀后，滴加NBD-Cl的无水二氯甲烷溶液。将反应在室温下搅拌过夜。减压除去溶剂并通过硅胶柱色谱法纯化，得到产物为红色固体NIR-NP。

本发明的第三方面提供上述近红外荧光探针在制备用于检测硫化氢的试剂中的应用。

其中，所述检测可以为体内检测或体外检测。

例如，本发明的探针可以用于不同肿瘤细胞和组织内硫化氢的检测，具体通以下步骤实现：

将细胞培养在激光共聚焦实验专用的培养皿中。在内源性硫化氢检测实验中，用NIR-NP(如10μM)孵育不同的肿瘤细胞，一定时间后用PBS缓冲液洗涤细胞，并通过共聚焦显微镜直接成像。在外源性硫化氢检测实验中，将探针(如10μM)与肿瘤细胞(如HepG2细胞)一起孵育，然后用PBS缓冲液洗涤，再用Na₂S溶液孵育一定时间，最后用PBS缓冲液洗涤后通过激光共聚焦显微镜成像。

在进一步的验证实验中，使用DL-炔丙基甘氨酸(PAG)来抑制胱硫醚γ-裂解酶(细胞内催化硫化氢生成的一种酶)的活性，从而降低内源性硫化氢的含量。用DL-PAG预处理肿瘤细胞(如HepG2细胞)，用PBS缓冲液洗涤后，用NIR-NP(如10μM)孵育，最后通过激光共聚焦显微镜成像。

本发明的荧光探针具有如下优点：

(1)该探针的斯托克斯位移超过180nm(激发波长为484nm，发射波长为670nm)，为近红外探针，具有良好的生物组织渗透性，能够避免来自生物大分子背景荧光的干扰；

(2)该探针对硫化氢有很高的灵敏度，检出限为0.03μM，低于其他同类型探针；

(3)该探针对硫化氢的选择性非常高，生物硫醇(如GSH，Hcy和Cys)的存在不会对检测结果造成影响，因此可用于复杂生物样品中的硫化氢检测；

(5)该探针对细胞的毒性非常小，可以用于活细胞的内源性硫化氢检测。

本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述，本发明的上述以及其它目的、特征和优势将变得更加明显。

图1示出了NIR-NP的结构及其检测硫化氢的原理图。

图2(a)-2(b)示出了NIR-NP的荧光随Na₂S当量增加而增加的荧光谱图。

图3示出了NIR-NP和Na₂S反应后荧光强度随时间变化的谱图。

图4示出了pH对NIR-NP响应的影响。

图5(a)-5(b)示出了NIR-NP对硫化氢的选择性。

图6示出了NIR-NP对细胞毒性的检测结果。

图7(a)-7(e)示出了NIR-NP对细胞内源性硫化氢的荧光成像图。

图8(a)-8(e)示出了NIR-NP对细胞外源性硫化氢的荧光成像图。

图9A-9B示出了PAG预处理细胞的荧光强度与未处理组的差异。

图10(a)-10(d)示出了肝组织中硫化氢的成像结果。

具体实施方式

下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。

实施例1

本实施例用于说明本发明荧光探针的制备。

反应式如下：

制备步骤如下：

1)REDCP的制备：将2-(3,5,5-三甲基环己-2-烯基)丙二腈(100mg，0.54mmol)和4-(哌嗪-1-基)苯甲醛(102mg，0.54mmol)溶于无水乙醇(15ml)中。然后，在氩气的保护下向溶液中加入五滴哌啶。加热回流5小时后，将混合物溶液冷却至室温，减压除去溶剂。将粗产物通过硅胶柱色谱法纯化，用二氯甲烷/甲醇(200：1)作为洗脱剂，得到红色固体REDCP(119mg，0.33mmol)，产率为61％。

2)NIR-NP的制备：在氩气的保护下，将0.1mL N,N-二异丙基-乙基胺(DIPEA)加入到15ml的REDCP的无水二氯甲烷溶液(90mg，0.25mmol)中。搅拌15分钟后，在0℃下滴加5mlNBD-Cl的无水二氯甲烷溶液(60mg，0.3mmol)。将反应在室温下搅拌过夜。减压除去溶剂并通过硅胶柱色谱法纯化(用二氯甲烷：石油醚＝3/1洗脱)，得到产物为红色固体NIR-NP(110mg，0.21mmol)，产率为84％。

3)探针分子NIR-NP的氢谱：1H NMR(600MHz，CDCl₃)：δ8.47(d，J＝8.4Hz，1H)，7.48(d，J＝8.2Hz，2H)，7.01(m，J＝14.6Hz，1H)，6.92(d，J＝8.2Hz，2H)，6.87(d，J＝14.6Hz，1H)，6.81(s，1H)，6.34(d，J＝8.2Hz，1H)，4.29(t，J＝4.8Hz，4H)，3.63(t，J＝4.8)Hz，4H)，2.59(s，2H)，2.46(s，2H)，1.08(s，6H)。

实施例2

本实施例用于说明NIR-NP的荧光随Na₂S当量的正关联性变化。

将不同当量的Na₂S加入到探针NIR-NP溶液中并在37℃下孵育1小时，用440nm激光激发，记录其发射光谱。如图2(a)和图2(b)所示，在不存在Na₂S的情况下几乎观察不到荧光，因为NBD的强拉电子效应猝灭了荧光。加入了不同浓度的Na₂S后，在670nm处可以观察到明显的荧光，并且荧光强度随着Na₂S的增加而增加。图2(a)和图2(b)中显示了0-100μM范围内Na₂S浓度与荧光强度之间良好的线性关系。通过计算，可以得到该探针的检测限为0.03μM，远低于哺乳动物血清(10-100μM)和脑中(50-160μM)的H₂S浓度，也远低于已被报道的同类型探针。该实验结果表明本发明的探针对硫化氢具有较高的检测灵敏度，可用于生物系统中低水平硫化氢的定量分析。此外，该探针的大斯托克斯位移使其在活体成像应用中具有良好的应用潜力。

实施例3

本实施例用于说明NIR-NP和Na₂S反应后荧光强度随时间的变化。

在10μM的NIR-NP溶液中加入100μM的Na₂S，用荧光仪记录探针的荧光强度随时间的变化。如图3所示，荧光强度显著增加，并在孵育15分钟内达到最大值。该结果表明探针可以在短时间内与硫化氢快速反应，从而定量测量硫化氢，并动态监测内源性硫化氢的实时产生。

实施例4

本实施例用于说明pH对NIR-NP响应的影响。

在不同pH条件下进行NIR-NP和Na₂S的反应。结果如图4所示，加入Na₂S之前，NIR-NP(10μM)在pH2-10之间几乎没有荧光，表明探针可以在较宽pH范围内稳定存在。加入Na₂S(100μM)并孵育1小时后，探针NIR-NP在pH2-4之间没有出现荧光，表明在强酸环境中，硫化氢不会与探针发生反应。在pH6-10的条件下可以观察到探针发出明显的荧光，这表明NIR-NP可以在较宽的范围内检测硫化氢。另外，可以观察到最强的荧光信号发生在pH＝7.4时，这是生理条件下的pH值，这个结果意味着该探针在生物学研究中具有良好的应用价值。

实施例5

本实施例用于说明NIR-NP对硫化氢的选择性。

为了测试NIR-NP对硫化氢的选择性，本发明研究了其他离子和小分子对NIR-NP的影响。这些离子和小分子包括Na₂S₂O₄，KNO₃，Na₂S₂O₃，NaOCN，Na₂S₂S₅，KBr，NaNO₂，NaN₃，K₂P₂O₇，NaI，Na₂SO₄，CH₃COONa，KF，Na₂SO₃，KSCN，NaCl，NaH₂PO₄，NaHSO₃和生物硫醇(Cys，GSH和Hcy)。如图5(a)-5(b)所示，NIR-NP仅在Na₂S(10μM)存在时才能检测到荧光，而其他离子和小分子的加入只能引起非常微弱的荧光变化。为了进一步探究NIR-NP的响应特异性，还进行了竞争性实验。将这些干扰性的离子和小分子与Na₂S混合后加入到探针中，结果显示探针的荧光依然得到了显著的恢复，这说明干扰性离子和小分子不会对Na₂S和NIR-NP的反应造成影响(如图5(b)所示，其中，分析项的数字1-20分别代表：1.NaHSO₃；2.KSCN；3.Na₂SO₃；4.Cys；5.GSH；6.Hcy；7.KF；8.Na₂SO₄；9.NaI；10.NaN₃；11.K₂P₂O₇；12.NaNO₂；13.CH₃COONa；14.KBr；15.Na₂S₂S₅；16.NaOCN；17.Na₂S₂O₃；18.KNO₃；19.Na₂S₂O₄；20.Na₂S)。这个实验证明了该探针在复杂体系中对硫化氢具有高选择性和抗干扰能力，并且在生物学应用中具有很大潜力。

实施例6

本实施例用于说明NIR-NP对细胞内源性和外源性硫化氢的荧光成像。

基于NIR-NP良好的光学特性，高选择性和生物相容性，本发明探索了NIR-NP对活细胞中硫化氢的成像能力。首先，在进行细胞成像实验之前先测试了NIR-NP对细胞的毒性。图6显示当探针浓度范围为0-25μM时，细胞存活率大于90％，并且浓度为50μM时细胞存活率约为80％。这些结果说明NIR-NP具有低毒性和良好的生物相容性，适合用于活细胞成像实验。

在内源性硫化氢检测实验中，在37℃条件下，用10μM的NIR-NP孵育四种不同的肿瘤细胞30分钟，然后用PBS缓冲液洗涤三次后，在相同的参数下通过激光共聚焦显微镜对细胞成像。四种肿瘤细胞分别为人卵巢腺癌(SKOV-3)，人乳腺癌(MDA-MB-231)，人宫颈癌(HeLa)和人肝癌细胞(HepG2)。如图7(a)-7(e)所示，这些肿瘤细胞的荧光差异十分明显。与其他三种细胞相比，MDA-MB-231细胞显示出最强的荧光，而HeLa和HepG2细胞中的荧光强度则较弱。这可能是不同细胞中与硫化氢合成相关的酶的含量不同所导致的。

在外源性硫化氢检测实验中，首先将HepG2细胞与NIR-NP(10μM)一起在37℃条件下孵育30分钟，然后用PBS缓冲液洗涤三次后，再分别用浓度为0μM、50μM、100μM的Na₂S溶液孵育30分钟，最后用PBS缓冲液洗涤后，通过激光共聚焦显微镜成像。如图8(a)-8(e)所示，其中，图8(a)-8(d)分别代表未与Na₂S溶液孵育，以及与浓度为0μM、50μM、100μM的Na₂S溶液孵育的结果，图8(e)为定量统计数据。可见，随着Na₂S浓度的增加，荧光强度也逐渐增加。

在进一步的验证实验中，使用DL-炔丙基甘氨酸(DL-PAG)来抑制胱硫醚γ-裂解酶的活性，从而降低内源性硫化氢的含量。用1mM DL-PAG预处理HepG2细胞1小时，用PBS缓冲液洗涤后用NIR-NP(10μM)孵育30分钟，然后向每个培养皿中加入另外的100μM的Na₂S，最后通过激光共聚焦显微镜成像。结果如图9A-9B所示，用DL-PAG预处理的细胞的荧光强度(图9A)远低于未处理组(图9B)，这表明NIR-NP可用于外源性硫化氢成像。

基于上述内源性和外源性硫化氢成像的结果，可以得知探针荧光强度的差异是由细胞中硫化氢的含量差异引起的。

基于细胞成像的结果，本发明利用激光共聚焦显微镜观察肝组织中的硫化氢。制备新鲜冷冻肝组织切片(10μm)，并进行组织成像。如图10(a)-10(d)所示，对照组中，组织切片不经过任何处理直接成像(图10(a)-10(b))；在实验组中，用50μM的NIR-NP孵育组织切片40分钟，可以在600-700nm的波段范围内观察到明显的荧光(图10(c))；随后再用500μM的Na₂S孵育40分钟，可以发现荧光强度明显增加(图10(d))。该结果表明NIR-NP具有在组织中进行荧光成像的能力。

以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。

Claims

1.一种用于识别硫化氢的近红外荧光探针，其特征在于，该荧光探针具有式I所示的结构：

2.一种权利要求1中所述用于识别硫化氢的近红外荧光探针的制备方法，该方法包括以下步骤：

1)将式II所示结构化合物和式III所示结构化合物溶于第一有机溶剂中，然后，在惰性气体的保护下向溶液中加入哌啶，加热回流进行反应，得到式IV所示结构化合物；

2)在惰性气体的保护下，将N,N-二异丙基-乙基胺加入至含有式IV所示化合物和第二有机溶剂的溶液中，搅拌混匀后，在0-4℃下滴加NBD-Cl与第二有机溶剂的溶液，20-30℃下搅拌8-20h，得到具有式I所示结构的化合物。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其中，所述第一有机溶剂为无水乙醇。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其中，所述第二有机溶剂为无水二氯甲烷。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其中，所述惰性气体为氮气和/或氩气。

6.权利要求1所述的近红外荧光探针在制备用于检测硫化氢的试剂中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其中，所述检测为体内检测或体外检测。