CN110055055A

CN110055055A - 一种区分Cys和GSH/H2S的近红外发射荧光探针及其应用

Info

Publication number: CN110055055A
Application number: CN201910400806.2A
Authority: CN
Inventors: 林伟英; 朱琳琳; 张天歌
Original assignee: University of Jinan
Current assignee: University of Jinan
Priority date: 2019-05-15
Filing date: 2019-05-15
Publication date: 2019-07-26

Abstract

一种区分Cys和GSH/H₂S的近红外发射荧光探针，其结构式为：。本发明的探针能够利用不同的荧光发射模式来区分Cys和GSH/H₂S，并将其应用在细胞、斑马鱼和裸鼠的硫醇检测成像中。本发明的探针合成步骤简单、成本低。本发明的探针能够在Cys和GSH/H₂S的检测中发挥重要作用。

Description

一种区分Cys和GSH/H2S的近红外发射荧光探针及其应用

技术领域

本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一种区分Cys和GSH/ H₂S的荧光探针及其应用。

背景技术

生物硫醇如硫化氢(H₂S)和半胱氨酸(Cys)、谷胱甘肽(GSH)都属于不可或缺的存在于生命系统的活性硫物种(RSS)，因为他们在人类各种各样的生理和病理过程中扮演重要的角色。例如：细胞内氧化应激的规则，信号的传输，以及维持细胞的正常生长和新陈代谢。这些生物硫醇的异常值可能导致许多健康障碍。硫化氢(H₂S)作为最简单的生物硫醇，也被认为是活体动物体内的第三种气体信号分子。许多疾病如唐氏综合症、阿尔茨海默氏症、肝硬化、高血压和糖尿病都与生活系统中异常水平的H₂S密切相关。半胱氨酸(Cys)异常可导致生长缓慢、肝损伤、水肿、皮肤损伤、嗜睡、肌肉和脂肪减少。谷胱甘肽(GSH)是心血管疾病、阿尔茨海默病和癌症的危险因素。因此，对这些生物硫醇的鉴别具有重要意义和应用价值。

对于传统的生物硫醇检测方法如高效液相色谱法、电化学检测法、质谱法、毛细管电泳法等已有报道，但它们也同时由于存在着成本高、复杂难懂、破坏组织或细胞、操作繁琐等众多缺点的原因而限制了这些方法的实际应用。荧光检测技术是各种检测技术中重要的一种检测方法，这主要是由于荧光探针具有操作简单、选择性和灵敏度高、检测限低、实时、无损、细胞内检测等特点。在许多检测生物硫醇的光学探针中，有的只用于检测一种生物硫醇(Cys、H₂S或GSH)，而没有对它们进行区分，然而，有些探针可以达到区分的目的，但由于其发射波长较短，不能在生物体内应用。因此，设计荧光探针对长发射波长生物硫醇的鉴别具有重要意义。

发明内容

针对目前检测生物硫醇探针不能用于生物体的问题，本发明提供一种区分Cys和GSH/ H₂S的近红外发射荧光探针，能够检测细胞、斑马鱼以及裸鼠内源性及外源性硫醇。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一种区分Cys和GSH/ H₂S的近红外发射荧光探针，其化学名称为9-（二乙基氨基）-3-（（7-硝基苯并[c][1,2,5]恶二唑-4-基）氧基）-5H-苯并[a]吩恶嗪-5-酮，简称为NN，其化学结构式如式（I）所示：

式（I）。

上述荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

（1）在0-5℃下，3-(二乙基氨基)苯酚与NaNO₂在浓硫酸存在下反应，产物以4mol/L的HCl溶液洗涤，抽滤干燥后获得黄色粉末状化合物1：；

（2）N₂气保护下，化合物1和1,7-二羟基萘在DMF中回流反应，反应结束后旋干溶液，得到粗产物，再用乙醚和甲醇冲洗粗产物，提纯得化合物2：，即Nile-OH；

（3）4-氯-7-硝基苯并[c][1,2,5]恶二唑加入化合物2和三乙胺的二氯甲烷溶液，在N₂气保护下室温反应，反应结束后旋干溶液并提纯得到探针。

步骤（2）中，提纯步骤为粗产物以体积比为50:1:5的二氯甲烷：甲醇：冰醋酸为淋洗液过硅胶柱。

步骤（3）中，提纯步骤为粗产物以二氯甲烷为淋洗液过硅胶柱。

一种上述荧光探针在制备检测溶液、细胞或生物体中Cys和GSH/ H₂S试剂中的应用。所述生物体包括斑马鱼和裸鼠。

本发明的机理如下：

本发明通过醚键将NBD(7-硝基-2,1,3-苯并恶二唑)基团连接到近红外发射的Nile-OH基团上得到探针NN，根据光诱导电子转移(PET)原理可知探针NN是没有荧光的，Nile-OH和NBD(7-硝基-2,1,3-苯并恶二唑)片段分别被选择为识别单元和荧光猝灭基团。检测时，探针结构将被生物硫醇切断，生成Nile-OH和硫醇-NBD。当非荧光探针NN被Cys切断时，由于顺序亲核取代反应，反应系统首先会生成近红外发射的Nile-OH和无荧光的硫醇-NBD，然后硫醇-NBD会迅速发生分子内Smiles重排，产生强黄绿色发射的氨基-NBD (NBD-Cys)。然而，在GSH/H₂S与探针反应的时，非荧光体系可以产生近红外发射的Nile-OH以及无荧光的硫醇-NBD(NBD-GSH或NBD-H₂S)，由于动力学中大环过渡态的形成失败导致Smiles重排无法进行，因此NBD-GSH或NBD-H₂S不会发出荧光。综上所述，可以利用这种不同的荧光发射模式来区分Cys和GSH/H₂S。

本发明所述荧光探针的水溶液，在Cys存在下，所发射的荧光由655 nm的弱荧光发射（近红外）变成了559nm和655 nm的强荧光发射，该现象说明探针对Cys有响应，当与GSH/H₂S反应时，则只有655nm这一荧光发射峰强度增加明显。这一现象表明该探针能够在水溶液中区分和检测Cys和GSH/H₂S：

。

本发明具有以下优点：

本发明的探针能够利用不同的荧光发射模式来区分Cys和GSH/H₂S，并将其应用在细胞、斑马鱼和裸鼠的硫醇检测成像中。本发明的探针合成步骤简单、成本低。本发明的探针能够在Cys和GSH/H₂S的检测中发挥重要作用。

附图说明

图1：探针的¹H NMR谱；

图2：探针的高分辨质谱；

图3：探针在磷酸缓冲液中的吸收光谱图，探针浓度：10 µM；

图4：探针所检测不同浓度的不同硫醇的滴定实验；其中激发波长为575 nm 或510 nm；探针的浓度：10 µM；

图5：探针在磷酸缓冲液中的选择性，其中激发波长为575 nm；探针的浓度：10 µM，选择性离子的浓度为2.5 mM；

图6：探针在细胞中的成像应用。激发波长：405 nm，561 nm，647 nm发射波段：425 -475 nm和663-738 nm；

图7：探针在斑马鱼中的成像应用，激发波长：405 nm, 561 nm，647 nm发射波段：425 -475 nm和663-738 nm；

图8：探针在裸鼠中的成像应用，激发波长：580 nm发射波段：660 nm。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。

实施例1 荧光探针的合成

（1）化合物1的合成

0℃下，将H₂O：浓HCl=1:1.75(4 mL: 7 mL)倒入到100mL圆底反应瓶中，称取3-(二乙基氨基)苯酚（6.8 g，0.05 mmol）加入到圆底烧瓶中，待溶解后，称取NaNO₂(3.4 g，0.05mmol)溶解到10 mL H₂O中，逐滴滴入到装有3-(二乙基氨基)苯酚的圆底烧瓶中，2小时加完，将棕色浆液反应体系保持在0-5℃的条件下，搅拌3.5 h，抽滤，并用4 mol/L的HCl水溶液洗涤，将产物干燥，用乙醇重结晶，得到棕黄色粉末，产率67%；

（2）化合物Nile-OH（化合物2）的合成

称取化合物1（230 mg，1 mmol）和1,7-二羟基萘（160 mg，1 mmol）溶于干燥的DMF溶液中，N₂气保护下140℃回流反应4小时，旋干溶剂，用适量乙醚和甲醇洗涤产物，过柱纯化(二氯甲烷：甲醇：冰醋酸=50:1:5)后得到蓝色固体，即化合物2：Nile-OH，产率59%；

（3）探针NN的合成

称取Nile-OH（33.4 mg，0.1 mmol）溶于适量的干燥二氯甲烷溶液中，加入Et₃N（15 μL，0.11 mmol），N₂气保护下室温搅拌5分钟，然后加入（23.9 mg，0.12 mmol），继续室温反应，待反应完成后，旋干溶剂，用二氯甲烷过柱纯化产物，得到蓝紫色固体，产率35%；其¹H NMR图谱如图1，高分辨质谱如图2。

实施例2 荧光探针对不同硫醇的响应

配制浓度为1 mM的本发明所述检测Cys和GSH/H₂S的近红外荧光探针NN的乙腈(CH₃CN)的测试母液溶液待用。由于S^2-在水中解离后可以提供H₂S来源，所以用Na₂S作为H₂S的的储备液。

测试液中，量取适量的本发明所述检测Cys和GSH/H₂S的近红外荧光探针NN于4个5mL容量瓶中，并加适量CH₃CN，使用磷酸缓冲（PBS，pH = 7.4）定容，其中3个分别加入适量Cys、GSH、H₂S。使得测试液中，探针的浓度为10 μM，测试使用的Cys、GSH、H₂S的浓度分别为600 μM、700 μM、50 μM其中含体积分数为30 %的CH₃CN。进行吸收光谱测试，结果如图3所示。

实施例3 不同浓度的Cys、GSH、H₂S对探针的滴定检测

配制浓度为1 mM的本发明所述检测Cys和GSH/H₂S的近红外荧光探针NN的乙腈(CH₃CN)的测试母液溶液待用。

配制探针终浓度为10 μM，含30 % CH₃CN溶液的PBS溶液，分别与不同浓度的Cys（0-600 μM）、GSH（0-700 μM）、H₂S（0-50 μM）充分作用，进行荧光检测Cys（λ_ex= 510 nm、575nm，λ_em= 559 nm、655 nm，655 nm），GSH/H₂S（λ_ex= 575 nm，λ_em= 655 nm）。得各体系中荧光强度，建立荧光强度与硫醇浓度标准曲线。如图4所示，随着Cys浓度的增加，559 nm、655 nm处的荧光强度逐渐增加，当Cys浓度达到600 μM时，反应体系荧光强度达到饱和状态，当与GSH/H₂S反应时，随着GSH/H₂S浓度的逐渐增加，655 nm处的荧光强度逐渐增加，当GSH/H₂S浓度分别达到600 μM/50 μM时，反应体系荧光强度达到饱和状态。

实施例4 荧光探针对不同离子的选择性

配制浓度为1 mM的本发明所述检测Cys和GSH/H₂S的近红外荧光探针NN的乙腈(CH₃CN)的测试母液溶液待用。配制浓度为100 mM的各种不同离子，氨基酸和活性氧/活性氮溶液作为备用。

在2 mL的Ep管里加入20μL探针母液、580 μL CH₃CN和250当量的各离子溶液或氨基酸溶液，用磷酸缓冲液定容，摇匀后进行荧光检测（λ_ex= 510 nm、575 nm，λ_em= 559 nm、655 nm，655 nm），建立荧光强度与各离子的柱状图(结果见图5)，测试离子和氨基酸的浓度为2.5 mM，其中，（a）Cys浓度为（0-500 μM），激发波长为575 nm，发射波长为655 nm；（b）Cys浓度为（0-500 μM），激发波长为510 nm，发射波长为559 nm 和655 nm；（c）GSH浓度为（0-600 μM）激发波长为575 nm，发射波长为655 nm；（d）H₂S浓度为（0-50 μM）激发波长为575nm，发射波长为655 nm。图中1-23号加入的离子分别是：乙酸铵，硫酸亚铁，磷酸铵，氯化钾，亚硝酸钠，溴化钠，氯化钙，氯化铜，氯化锌，硝酸钾，碘化钾，氯化镁，氰化钠，三氯化铝，氟化钠，氯化钡，过氧化氢，次氯酸钠，同型半胱胺酸，探针NN，半胱氨酸500μM，谷胱甘肽600μM，硫化氢50μM。测试溶液的荧光发射光谱，由图5可以发现，其他离子(或氨基酸)对探针NN的荧光几乎没有影响。

实施例5 荧光探针在细胞中的荧光成像

将适当密度的HeLa细胞接种到两个灭菌的35 mm成像培养皿中，在CO₂培养箱（温度为37 ℃，5 % CO₂）中培养，待细胞贴壁后，向培养皿中加入本发明所述检测生物硫醇的近红外荧光探针NN，使其终浓度均为10 μM。继续培养30分钟后，弃掉培养基，用PBS缓冲液冲洗细胞3次，进行成像实验，作为对照组。向另一培养皿中加入适量NEM溶液，终浓度为10μM，孵育15分钟后，加入本发明所述检测生物硫醇的近红外荧光探针NN，使其终浓度均为10 μM，继续孵育15分钟后，弃掉培养基，用PBS缓冲液冲洗细胞3次，进行成像实验，继续加入适量的Cys，终浓度为500μM，继续孵育15分钟后，进行成像实验。向另一培养皿中加入适量NEM溶液，终浓度为10μM，孵育15分钟后，加入本发明所述检测生物硫醇的近红外荧光探针NN，使其终浓度均为10 μM，继续孵育15分钟后，弃掉培养基，用PBS缓冲液冲洗细胞3次，进行成像实验，继续加入适量的GSH，终浓度为600μM，继续孵育15分钟后，进行成像实验。向另一培养皿中加入适量NEM溶液，终浓度为10μM，孵育15分钟后，加入本发明所述检测生物硫醇的近红外荧光探针NN，使其终浓度均为10 μM，继续孵育15分钟后，弃掉培养基，用PBS缓冲液冲洗细胞3次，进行成像实验，继续加入适量的H₂S，终浓度为50μM，继续孵育15分钟后，进行成像实验。只加入探针时，细胞具有强的红色荧光和较弱的绿色荧光，当细胞中首先加入NEM，再加探针孵育后，可以观察到细胞中几乎没有红色和绿色荧光，再加入Cys之后，细胞中红色荧光和绿色荧光均有非常明显的增强，用NEM抑制后加探针，再加GSH/H₂S，可以观察到明显的红色荧光信号。结果如图7所示，其中，a1)-a4)为HeLa与探针NN共同孵育15分钟的细胞的成像照片；b1)-b4)为HeLa细胞与NEM共同孵育15分钟后再与探针NN共同孵育10分钟后的成像照片；c1)-c4)为在b1)-b4)基础上再与Cys共同孵育15分钟后的细胞成像照片；d1)-d4)为在b1)-b4)基础上再与GSH共同孵育15分钟后的细胞成像照片；e1)-e4)为在b1)-b4)基础上再与H₂S共同孵育15分钟后的细胞成像照片。激发波长：405 nm，561 nm，647 nm发射波段：425 - 475 nm和663-738 nm。

实施例6 荧光探针在斑马鱼中的成像应用

将脱卵3天的斑马鱼分为四组，分别放入35 mm培养皿中。其中一组加入10 μM本发明的探针NN，在28 ℃下培养30 min，PBS缓冲液冲洗3次，共聚焦显微镜下成像。第二组先加入10μM NEM，28 ℃下孵育15分钟后，加入10 μM本发明的探针NN，PBS缓冲液冲洗3次，共聚焦显微镜下成像，再在此基础上加入500μM Cys，在28 ℃下继续培养15分钟，PBS缓冲液冲洗，共聚焦显微镜下成像。第三组先加入10 μM NEM，28 ℃下孵育15分钟后，加入10 μM本发明的探针NN，PBS缓冲液冲洗3次，共聚焦显微镜下成像，再在此基础上加入600μM GSH，在28 ℃下继续培养15分钟，PBS缓冲液冲洗，共聚焦显微镜下成像。第四组先加入10 μM NEM，28 ℃下孵育15分钟后，加入10 μM本发明的探针NN，PBS缓冲液冲洗3次，共聚焦显微镜下成像，再在此基础上加入50μM H₂S，在28 ℃下继续培养15分钟，PBS缓冲液冲洗，共聚焦显微镜下成像。结果如图7所示，其中，a1)-a3) 斑马鱼与探针NN共同孵育15分钟的细胞的成像照片;b1)-b3) 斑马鱼与NEM共同孵育15分钟后再与探针NN共同孵育10分钟后的斑马鱼成像照片; c1)-c3) 在b1)-b3)基础上再与Cys共同孵育15分钟后的斑马鱼成像照片；d1)-d3) 在b1)-b3)基础上再与GSH共同孵育15分钟后的斑马鱼成像照片；e1)-e3) 在b1)-b3)基础上再与H₂S共同孵育15分钟后的斑马鱼成像照片。激发波长：405 nm，561 nm，647 nm发射波段：425 - 475 nm和663-738 nm。根据图7可知，第一组中只加入探针时，斑马鱼具有红色荧光和微弱的绿色荧光；第二组中先加入NEM之后，再加入探针NN，斑马鱼红色荧光和绿色荧光消失，在此基础上加入Cys之后，斑马鱼体内的红色荧光和绿色荧光均增强；第三组和第四组中先加入NEM之后，再加入探针NN，斑马鱼红色荧光和绿色荧光消失，在此基础上加入GSH/H₂S之后，斑马鱼体内的红色荧光增强明显，绿色荧光并未有明显变化。

实施例7 荧光探针在裸鼠中的成像应用

将4周大小的裸鼠注射一定量麻醉剂后，在其腹腔注射1mM，50 μL本发明的探针NN，30分钟后，利用活体成像仪成像，注射位置显示有强荧光。取另一只裸鼠注射一定量麻醉剂后，在其腹腔注射1mM，50 μL NEM溶液，30分钟后，在原位置注射1mM，50 μL本发明的探针NN，30分钟之后利用活体成像仪成像，注射位置荧光区域明显变小，荧光强度也随之变弱，当在此基础上分别加入2mM的Cys、GSH、H₂S后，均观察到荧光区域变大，荧光强度也随之变强。结果如图7所示，a1)-b1)为裸鼠与探针NN共同孵育30分钟的细胞的成像照片；a2)-b2)为裸鼠与NEM共同孵育20分钟后再与探针NN共同孵育20分钟后的斑马鱼成像照片；a3)-b3)为在a2)-b2)基础上再与Cys或GSH共同孵育20分钟后的裸鼠成像照片。激发波长：580 nm发射波长：660nm。

Claims

1.一种区分Cys和GSH/ H₂S的近红外发射荧光探针，其化学结构式如式（I）所示：

式（I）。

2.一种如权利要求1所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（2）N₂气保护下，化合物1和1,7-二羟基萘在DMF中回流反应，反应结束后旋干溶液，得到粗产物，再用乙醚和甲醇冲洗粗产物，提纯得化合物2：；

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，提纯步骤为粗产物以体积比为50:1:5的二氯甲烷：甲醇：冰醋酸为淋洗液过硅胶柱。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，提纯步骤为粗产物以二氯甲烷为淋洗液过硅胶柱。

5. 一种如权利要求1所述的荧光探针在制备检测溶液、细胞或生物体中Cys和GSH/ H₂S试剂中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述生物体包括斑马鱼和裸鼠。