CN112457360B - 一种肝靶向的过氧亚硝酸根荧光探针及制备方法和应用 - Google Patents

一种肝靶向的过氧亚硝酸根荧光探针及制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本申请公开了一种肝靶向的过氧亚硝酸根荧光探针及制备方法和应用，属于化学生物材料技术领域。针对大多数的探针缺乏组织或器官靶向性，导致无法深入研究ONOO‑与某一特定疾病的关系并研究其致病机理的问题。本申请肝靶向的过氧亚硝酸根荧光探针含有肝靶向单元熊去氧胆酸；该荧光探针的制备方法是通过将化合物4‑溴‑1,8‑萘二甲酸酐溶解于二氧六环中，加入正丙胺，反应液浓缩，柱层析分离得化合物NA‑1；然后溶解在2‑甲氧基乙醇中，加入水合肼和碳酸氢钠，柱层析分离得化合物NA‑2；然后再与熊去氧胆酸溶解在N,N‑二甲基甲酰胺中，再加入1‑羟基苯并三氮唑，1‑乙基‑(3‑二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，N,N‑二异丙基乙胺，粗品经柱层析得到目标化合物NA‑3。

Description

一种肝靶向的过氧亚硝酸根荧光探针及制备方法和应用
技术领域
本发明属于化学生物材料技术领域，具体涉及一种肝靶向的过氧亚硝酸根荧光探针及制备方法和应用。
背景技术
过氧亚硝酸根(ONOO-)作为生物体内重要的活性氧分子，参与着生物体内重要的生理和病理过程，主要由一氧化氮(NO)和超氧自由基(O2 .-)合成。高反应活性的ONOO-一方面可以与许多生物分子诸如蛋白质、脂质和NDA发生反应，另一方面对细胞产生氧化应激毒性。然而，浓度异常的ONOO-成为许多疾病的关键致病因素，如神经退行性疾病、缺血-再灌注疾病、炎症和癌症等。因此，建立一种有效的、高选择性的ONOO-检测技术是非常重要的。
ONOO-是一种在细胞和组织中易扩散、半衰期很短的分子，很多研究只能通过其代谢产物进行间接推测，这给其中的研究结果带来干扰或不确定性。荧光探针法具有取样量少、灵敏度高、选择性强、操作简便等优点，已经被广泛应用于各种离子及生物活性分子的检测当中。
目前，用于检测ONOO-的荧光探针已应用到细胞水平或活体动物中。但绝大多数的探针缺乏组织或器官靶向性，导致无法深入研究ONOO-与某一特定疾病的关系并研究其致病机理。其中肝癌由于其发病前症状不明显，造成患者早期诊断困难，再加之其死亡率较高，称为目前亟需解决的临床问题之一。而ONOO-作为重要的生物分子其生物体内浓度的变化与肝癌的发生和发展密切相关。因此，研究一种能够靶向检测肝脏中ONOO-浓度的荧光探针，不仅能够深入研究ONOO-在肝癌发生发展过程的作用，而且有望为肝癌的早期诊断提供新的方法和技术。
发明内容
针对上述问题本发明提供了一种肝靶向的过氧亚硝酸根荧光探针及制备方法和应用。
为了达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：
一种肝靶向的过氧亚硝酸根荧光探针，含有肝靶向单元熊去氧胆酸，化学结构式为：
Figure GDA0003140496490000021
一种肝靶向的过氧亚硝酸根荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，化合物4-溴-1,8-萘二甲酸酐溶解于二氧六环中，搅拌至澄清，加入正丙胺，氮气置换，进行第一次反应；将反应液浓缩，经柱层析分离得到化合物NA-1；
步骤2，化合物NA-1溶解在2-甲氧基乙醇中，加入水合肼和碳酸氢钠，进行第二次反应；除去溶剂，加入水，有不溶固体析出，过滤，得到固体混合物，经柱层析分离得到化合物NA-2；
步骤3，化合物NA-2和熊去氧胆酸溶解在N,N-二甲基甲酰胺中，再加入1-羟基苯并三氮唑，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，N,N-二异丙基乙胺，室温搅拌12h；倒入水中，搅拌过滤，粗品经柱层析得到目标化合物NA-3。
进一步，所述步骤1中4-溴-1,8-萘二甲酸酐与正丙胺的质量比为5:1.12。
进一步，所述步骤2中NA-1、水合肼与碳酸氢钠的质量比为2:1:0.63。
进一步，所述步骤3，中化合物NA-2、熊去氧胆酸、1-羟基苯并三氮唑、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N,N-二异丙基乙胺的质量比为0.50:0.88:1.1:0.75:0.002。
进一步，所述柱层析用洗脱剂是体积比为50～10:1的二氯甲烷与甲醇的混合物。
进一步，所述步骤1中第一次反应的反应温度为100-120℃，反应时间为5-12h。
进一步，所述步骤2中第二次反应的反应温度为80-120℃，反应时间为1-4h。
一种肝靶向的过氧亚硝酸根荧光探针的应用，利用荧光检测分析法测定ONOO-。
一种肝靶向的过氧亚硝酸根荧光探针的应用方法，将荧光探针溶于二甲基亚砜中制备荧光探针5mM母液，在测定时，将荧光探针母液加入不同浓度的ONOO-作用2-30min后，用pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液稀释后，进行荧光光谱测定，观察其荧光强度变化。
与现有技术相比本发明具有以下优点：
本发明荧光探针对其他活性氧和活性氮都没有产生明显的荧光响应，而对ONOO-具有非常明显的响应，由此可知该荧光探针对ONOO-具有良好的特异性。
本发明荧光探针以1，8-萘二甲酸酐作为荧光发色团，熊去氧胆酸单元作为肝靶向单元合成。ONOO-通过氧化作用，导致熊去氧胆酸单元中的亚甲基的碳碳键断裂，从而表现出发色团荧光增强；本发明荧光探针的最大激发波长为450nm，最大发射波长为550nm。
本发明中，我们提供了肝靶向的过氧亚硝酸根荧光探针分子，其有益效果是：该探针能够特异性识别过氧亚硝酸根，而不受其他活性氧和活性氮的影响；不同pH环境(pH 4～9)对荧光探针测定ONOO-的影响很小；更重要的是，该探针分子中引入熊去氧胆酸单元，能够实现探针的肝靶向性，从而实现靶向检测肝癌细胞中的ONOO-浓度变化情况。该发明对于深入探究ONOO-在肝癌中的致病机理具有重要意义。
附图说明
图1为本发明所涉及的肝靶向的一氧化氮荧光探针分子的合成路线图；
图2为本发明所涉及的探针分子的1H NMR谱图；
图3为本发明所涉及的探针分子的13C NMR谱图；
图4为本发明所涉及的探针分子的ESI谱图；
图5为本发明荧光探针检测ONOO-的荧光发射光谱图；
图6为本发明荧光探针检测ONOO-的线性关系图；
图7为本发明荧光探针与ONOO-作用前后在不同pH环境下的荧光光谱图；
图8为本发明荧光探针与不同活性氧和活性氮作用后的荧光光谱图；
图9为本发明荧光探针对HepG2细胞靶向的荧光成像图；
图10为本发明荧光探针对HepG2细胞中内源性和外源性ONOO-检测的荧光成像图。
具体实施方式
实施例1
一种肝靶向的过氧亚硝酸根荧光探针
(1)化合物NA-1的合成：化合物4-溴-1,8-萘二甲酸酐(5g,18.05mmol)溶解在150mL的二氧六环中，搅拌至澄清，加入正丙胺(1.12g,19.85mmol)，氮气置换，110℃反应8小时。TLC显示反应完全，溶剂旋干，粗产品经柱层析(石油醚:乙酸乙酯＝40:1～10:1)分离，得到4g黄色固体。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.55-8.50(m,2H)，8.31(d,J＝8.0Hz,1H)，8.31(d,J＝8.0Hz,1H)，8.20(d,J＝8.0Hz,1H)，7.99(t,J＝12.0Hz,1H)，4.01(t,J＝16.0Hz,2H)，1.69-1.67(m,2H)，0.95(t,J＝12.0Hz,3H)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ163.1,132.9,131.9,131.7,131.2,130.0,129.5,128.5,123.0,122.2.HRMS:[M+H+]318.0131，Calculated:318.0124；
(2)化合物NA-1(2g,6.29mmol)溶解在50mL 2-甲氧基乙醇中，加入85％水合肼(1mL,12.57mmol)和碳酸氢钠(0.63g,7.5mmol)，氮气置换，110℃反应两小时。LCMS显示反应完全。溶剂旋干，加入水，有不溶固体析出，过滤，得到1.2g黄色固体。粗产物经柱层析(二氯甲烷：甲醇＝20:1)得到120mg纯品NA-2。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.12(s,1H)，8.63(d,J＝8.0Hz,1H),8.43(d,J＝4.0Hz,1H),8.31(d,J＝8.0Hz,1H)，7.66(t,J＝16.0Hz,1H)，7.27(d,J＝12.0Hz,1H)，4.68(s,2H)，4.00(t,J＝12.0Hz,2H)，1.66-1.64(m,2H)；0.93(t,J＝12.0Hz,3H)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ164.2,163.4,153.6,134.7,131.0,129.7,128.1,124.6,122.2,118.9,107.8,104.4,21.4,11.8.HRMS:[M+H+]270.1234,Calculated:270.1237。
(3)化合物NA-2(500mg,1.86mmol)，化合物熊去氧胆酸(880mg,2.24mmol)，溶解在30mL DMF中，再加入HOBt(750mg,5.73mmol)，EDCI(1.1g,5.73mmol)，DIEA(3mL,0.017mmol)，室温反应过夜。LCMS显示反应完全。倒入水中，搅拌过滤，得到1g粗品，经柱层析(DCM：MeOH＝50：1～10：1)，得到120mg黄色固体。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.18(s,1H)，9.60(s,1H),8.71(d,J＝12Hz,1H)，8.49(d,J＝8Hz,1H),8.31(d,J＝12Hz,1H),7.78(t,J＝16Hz,1H)，6.88(d,J＝8Hz,1H),4.51(d,J＝4Hz,1H),4.01(d,J＝16Hz,1H)，3.93(d,J＝8Hz,2H)，3.37-3.32(m,2H),2.35-2.24(m,2H)，2.09(s,1H)，2.01(d,J＝12Hz,1H)，1.84(d,J＝8Hz,3H),1.71-1.61(m,4H),1.48-0.71(m,27H),0.67(s,3H)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ173.1,164.0,163.9,151.1,133.8,131.2,129.3,128.7,125.3,122.3,119.2,111.0,105.1,70.2,69.9,56.3,55.1,43.5,42.6,39.7,39.5,39.3,39.1,35.4,35.3,34.2,31.8,30.8,30.7,28.7,27.2,23.7,21.4,18.8,12.4,11.9.HRMS:[M+H+]630.3909,Calculated:630.3901。
实施例2
荧光探针对不同浓度ONOO-的识别
将实施例1中得到的荧光探针用二甲基亚砜溶解，配制探针母液，分别加入不同当量的ONOO-溶液，在37℃下孵育30min后，用磷酸盐缓冲溶液稀释至待测浓度10μM，进行荧光光谱测定。如图6所示，探针能够对0-14μM的ONOO-响应，并在550nm处具有较好的线性关系，线性回归方程为y＝7.48x+0.24，R2＝0.9933。
实施例3
荧光探针受pH环境的影响
将实施例1中得到的荧光探针用二甲基亚砜溶解，配制探针母液，分别加入10当量的ONOO-，在37℃下孵育30min后，用不同pH值磷酸盐缓冲溶液稀释至待测浓度10μM，分别对其荧光光谱测定(λex＝450nm)；根据其荧光强度，评估不同pH环境对荧光探针荧光强度的影响，结果如图7所示。pH值分别为4、5、6、7、8、9。荧光探针在与ONOO-作用前后其荧光强度均不受pH环境的影响。
实施例4
荧光探针对不同活性氧和活性氮的选择性
将实施例1中得到的荧光探针用二甲基亚砜溶解，配制探针母液，分别加入100当量的1O2、AA、ClO-、DHA、GSH、H2O2、NO、NO2 -、O2 -、OH·和10当量的ONOO-，在37℃下孵育30min后，用磷酸盐缓冲溶液稀释至待测浓度10μM，分别对其荧光光谱测定(λex＝450nm)；根据其荧光强度，评估不同活性氧和活性氮对荧光探针荧光强度的影响，结果如图8所示。其中1-12分别为1.1O2；2.AA；3.ClO-；4.DHA；5.GSH；6.H2O2；7.NO；8.NO2 -；9.O2 -；10.OH·；11.ONOO-；12.Blank。由此说明，本发明的荧光探针仅对ONOO-有最大程度的响应，而对其他物质响应很小。
实施例5
荧光探针对HepG2细胞的靶向荧光成像应用
将实施例1中得到的荧光探针以及荧光团NA-2分别用二甲基亚砜溶解，配制探针母液；A549、KYSE-140和HepG2细胞分别用DMEM(含20％胎牛血清+1％双抗)孵育于37℃、5％CO2的培养箱中培养24h，待其贴壁。后在三种不同细胞中分别加入荧光探针(20μM)和荧光团NA-2(20μM)孵育30min,后进行荧光成像实验。可以看到加入荧光探针的三种细胞中，只有HepG2细胞显示相对较强的荧光，而A549、KYSE-140细胞几乎没有荧光(图9a)；相反，加入荧光团NA-2的三种细胞中，都显示出较强的荧光(图9b)。由此说明该荧光探针对HepG2细胞具有较好的靶向性。
实施例6
荧光探针在HepG2细胞中的荧光成像应用
将实施例1中得到的荧光探针用二甲基亚砜溶解，配制探针母液；将5份细胞(编号为1、2、3、4、5)分别用DMEM(含20％胎牛血清+1％双抗)孵育于37℃、5％CO2的培养箱中培养24h，然后在1号培养皿中加入600μM的ONOO-螯合剂UA孵育4h,然后加入20μM的荧光探针继续培养30min；2号培养皿中加入ONOO-供体SIN-1(1600μM)培养4h后，再加入20μM的荧光探针继续培养30min；3号培养皿中分别加入LPS(20μg/mL)和IFN-γ(300ng/mL)培养12h后，再加入20μM的荧光探针继续培养30min；4号培养皿中分别加入超氧自由基清除剂TMPEO(1080μM)、LPS(20μg/mL)和IFN-γ(300ng/mL)培养12h后，再加入20μM的荧光探针继续培养30min；5号培养皿中分别加入一氧化氮抑制剂L-NAME(3mM)、LPS(20μg/mL)和IFN-γ(300ng/mL)培养12h后，再加入20μM的荧光探针继续培养30min，之后弃去原液，用PBS冲洗细胞3次，用4％多聚甲醛固定细胞后，在共聚焦荧光显微镜下观察并进行荧光成像，结果如图10所示。其中加入ONOO-螯合剂UA孵育4h,然后加入荧光探针继续培养30min后细胞显示荧光非常弱(图a)；加入ONOO-供体SIN-1培养4h后，再加入20μM的荧光探针后细胞荧光明显增强,说明探针可以检测外源性的ONOO-(图b)；加入LPS和IFN-γ培养12h后，使细胞中产生内源性一氧化氮，进一步与超氧自由基反应生成ONOO-，再加入荧光探针继续培养4h后观察到细胞中的荧光强度也是明显增强的(图c)；然而，当细胞中加入超氧自由基清除剂TMPEO、LPS和IFN-γ培养12h后，再加入荧光探针继续培养30min，并没有观察到较强的荧光；此外，当细胞中加入一氧化氮抑制剂L-NAME、LPS和IFN-γ培养12h后，再加入荧光探针，同样观察到细胞中荧光很弱，说明探针对由此说明ONOO-具有很好的选择性。通过以上实验证明，该探针可以靶向检测HepG2细胞中外源性和内源性的ONOO-。
图9(a)加probe(20μM)培养30min；(b)+NA-2(20μM)培养30min；图10(a)加入UA(600μM)孵育4h，然后加入荧光探针(20μM)继续培养30min；(b)加入SIN-1(1600μM)培养4h后，再加入荧光探针(20μM)继续培养30min；(c)加入LPS(20μg/mL)和IFN-γ(300ng/mL)培养12h后，再加入荧光探针(20μM)继续培养30min；(d)加入TMPEO(1080μM)、LPS(20μg/mL)和IFN-γ(300ng/mL)培养12h后，再加入荧光探针(20μM)继续培养30min；(e)加入L-NAME(3mM)、LPS(20μg/mL)和IFN-γ(300ng/mL)培养12h后，再加入荧光探针(20μM)继续培养30min。
本发明说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。尽管上面对本发明说明性的具体实施方式进行了描述，以便于本技术领的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。

Claims (8)

1.一种肝靶向的过氧亚硝酸根荧光探针，其特征在于：含有肝靶向单元熊去氧胆酸，化学结构式为：
Figure FDA0003140496480000011
2.一种权利要求1所述的肝靶向的过氧亚硝酸根荧光探针的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1，化合物4-溴-1,8-萘二甲酸酐溶解于二氧六环中，搅拌至澄清，加入正丙胺，氮气置换，进行第一次反应；将反应液浓缩，经柱层析分离得到化合物NA-1；
所述NA-1的结构式为：
Figure FDA0003140496480000012
步骤2，化合物NA-1溶解在2-甲氧基乙醇中，加入水合肼和碳酸氢钠，进行第二次反应；除去溶剂，加入水，有不溶固体析出，过滤，得到固体混合物，经柱层析分离得到化合物NA-2；
所述NA-2的结构式为：
Figure FDA0003140496480000021
步骤3，化合物NA-2和熊去氧胆酸溶解在N,N-二甲基甲酰胺中，再加入1-羟基苯并三氮唑，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，N,N-二异丙基乙胺，室温搅拌12h；倒入水中，搅拌过滤，粗品经柱层析得到目标化合物NA-3。
3.根据权利要求2所述的一种肝靶向的过氧亚硝酸根荧光探针的制备方法，其特征在于：所述步骤1中4-溴-1,8-萘二甲酸酐与正丙胺的质量比为5:1.12。
4.根据权利要求3所述的一种肝靶向的过氧亚硝酸根荧光探针的制备方法，其特征在于：所述步骤2中NA-1、水合肼与碳酸氢钠的质量比为2:1:0.63。
5.根据权利要求4所述的一种肝靶向的过氧亚硝酸根荧光探针的制备方法，其特征在于：所述步骤3中化合物NA-2、熊去氧胆酸、1-羟基苯并三氮唑、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N,N-二异丙基乙胺的质量比为0.50:0.88:1.1:0.75:0.002。
6.根据权利要求2～5任意一项所述的一种肝靶向的过氧亚硝酸根荧光探针的制备方法，其特征在于：所述柱层析用洗脱剂是体积比为50～10:1的二氯甲烷与甲醇的混合物。
7.根据权利要求6所述的一种肝靶向的过氧亚硝酸根荧光探针的制备方法，其特征在于：所述步骤1中第一次反应的反应温度为100-120℃，反应时间为5-12h。
8.根据权利要求7所述的一种肝靶向的过氧亚硝酸根荧光探针的制备方法，其特征在于：所述步骤2中第二次反应的反应温度为80-120℃，反应时间为1-4h。
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