CN111072648A

CN111072648A - 一种检测溶酶体内生物硫醇的荧光探针及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN111072648A
Application number: CN201911280845.XA
Authority: CN
Inventors: 林伟英; 景新颖; 于法祺
Original assignee: University of Jinan
Current assignee: University of Jinan
Priority date: 2019-12-13
Filing date: 2019-12-13
Publication date: 2020-04-28

Abstract

本发明提供一种检测溶酶体内生物硫醇的荧光探针，其化学结构式为：

。该探针在Cys和Hcy存在的情况下，探针在两个独立波长的激发下分别在480nm和550nm处产生蓝色和绿色两种不同的荧光发射。然而，在探针中加入GSH和Na₂S时只会在480nm处产生蓝色荧光。这种差异可以合理地归因于NBD‑GSH/SH中间体与NBD Cys/Hcy不同，不能发生分子内环化重排反应。同时，由于吗啉具有溶酶体靶向性，可以将溶酶体和其他细胞器区分。该荧光探针具有溶酶体靶向性好、特异性强，响应快等优点，可用于活细胞溶酶体内生物硫醇的实时可视化测定，且可经化学合成获得，合成工艺简单易行，原料廉价易得，制备成本低，易于推广。

Description

一种检测溶酶体内生物硫醇的荧光探针及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一种检测细胞溶酶体内生物硫醇荧光探针及其应用。

背景技术

活性硫物质（RSS）包括小分子生物硫醇和硫化氢，是一类在人体中起重要生理作用的生物活性分子。半胱氨酸（Cys）、同型半胱氨酸（Hcy）和谷胱甘肽（GSH）是三种最常见的小分子生物硫醇。它们之间关系密切，在许多生物学过程中具有本质上的区别和药理作用。硫化氢是一种最简单的生物硫醇，是一种有毒气体，气味难闻，与一氧化碳、一氧化氮一起作为重要的信号传导小分子被发现。Cys是谷胱甘肽的前体，可与铁离子形成硫化铁络合物。然而，Cys的异常水平通常与生长缓慢、嗜睡、肝损伤、肥胖和其他疾病有关。此外，高Hcy浓度可诱发心血管疾病和阿尔茨海默病，血浆总Hcy浓度也与某些先天性疾病和老年认知障碍有关。GSH是以还原（GSH）和氧化（GSSG）的形式存在的，是细胞内含量最多的小分子生物硫醇。参与氧化还原反应、异物代谢、信号传导、基因调控等多种生理活动，在细胞生长和维持氧化还原平衡中起关键作用。然而，异常浓度的谷胱甘肽通常与癌症、阿尔茨海默病和心血管疾病有关。此外，生物硫醇异常水平与糖尿病、例唐氏综合征、例阿尔茨海默病、例肝硬化等多种疾病相关。因此，对生命体中生物硫醇的分析检测具有非常重要的生理和病理意义。

溶酶体（lysosome）是细胞内主要的代谢场所，参与细胞的代谢、胞内运输、细胞膜循环和细胞凋亡等多种生理功能。因此，对细胞溶酶体内生物硫醇的检测对理解生物硫醇生物生理和病理关系，乃至疾病早期诊断具有潜在的应用价值。

传统检测生物硫醇的方法有质谱分析法、毛细管电泳法、高效液相色谱法和电化学分析法等，但这些方法所需的检测设备复杂，成本较高，易损伤样品。近年来灵敏度高、选择性好的荧光探针备受关注，荧光探针检测成本低廉，操作简便；荧光成像技术实现了对分析物的可视化检测，几乎不损伤样品。相比于传统检测方法，荧光探针性质优良，目前已广泛应用于临床医学和诊断学等多个领域。然而大多数检测生物硫醇的探针主要针对于体外以及细胞质中的生物硫醇的检测，很难实现细胞器水平上的内源性生物硫醇的检测，尤其是溶酶体靶向的生物硫醇的检测。且现有的制备方法存在反应步骤多以及反应条件不温和等问题。

发明内容

针对目前缺少细胞器水平上检测内源性生物硫醇荧光探针的问题，本发明提供一种检测溶酶体内生物硫醇的荧光探针，响应速度快、抗干扰能力强。

本发明的另一目的是提供一种上述荧光探针的制备方法，合成简单。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一种检测溶酶体内生物硫醇的荧光探针，其化学结构式如式（I）所示：

式（I）。

上述荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

（1）在N,N-二异丙基乙胺催化下，化合物a1与化合物a2于1-羟基苯并三唑、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺和N,N-二甲基甲酰胺中反应，萃取，将有机相旋干得化合物（I）：

；

（2）化合物（I）与a3于DMF和碳酸钾溶液中搅拌反应5 h，分离提纯得荧光探针CM-NBD：

。

步骤（1）中，所述化合物a1与化合物a2的物质的量比为1:1。

步骤（1）中，所述反应时间为5 h。

步骤（1）中，所述反应萃取液为水和二氯甲烷。

步骤（2）中，所述化合物（I）和化合物a3的物质的量比为1:1。

步骤（2）中，所述反应时间为5 h。

步骤（2）中，所述分离提纯步骤为：将反应液过滤，通过减压蒸馏将滤液旋干，进行柱层析纯化；所述层析液为二氯甲烷:甲醇（v/v）=25:1。

一种上述荧光探针在检测溶液、细胞溶酶体内生物硫醇的应用。

本发明的机理如下：

本发明的荧光探针CM-NBD在生物硫醇存在的条件下，诱导7-硝基苯并-2-氧代-1,3-二唑基和吗啉香豆素之间的醚键断裂，此时荧光探针可以发射香豆素荧光团的蓝色荧光（峰值约为465 nm）和7-硝基苯并-2-氧代-1,3-二唑-4-硫醇的绿色荧光（峰值约为565 nm）。同时，由于吗啉具有溶酶体靶向性，可以将溶酶体和其他细胞器区分，因此该荧光探针可以用于检测细胞溶酶体内的生物硫醇。可采用荧光检测器实现产物的快速灵敏检测；检测条件为：激发波长为405 nm和470 nm，在415-650 nm和500 nm-750 nm之间进行荧光发射光谱的检测。

本发明具有以下优点：

本发明荧光探针具有溶酶体靶向性好、响应快等优点，在进行相应生物硫醇检测过程中不易受其他组分的干扰，可用于活细胞溶酶体内生物硫醇的实时可视化测定，且可经化学合成获得，合成工艺简单易行，原料廉价易得，制备成本低，易于推广。

附图说明

图1是荧光探针CM-NBD的¹H NMR图谱；

图2是荧光探针CM-NBD对不同生物硫醇的荧光响应图；

图3是荧光探针CM-NBD对生物硫醇的选择性分析图；

图4是荧光探针CM-NBD对HeLa细胞中生物硫醇的荧光成像图；

图5是荧光探针CM-NBD与溶酶体在HeLa细胞中共定位的荧光成像图，蓝色通道为探针CM-NBD（10 μM）在癌细胞HeLa细胞中的成像，绿色通道表示溶酶体定位试剂Lyso-Trackerred的细胞成像，叠加场为荧光探针CM-NBD和Lyso-Tracker red两者叠加的细胞成像。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。

实施例1 荧光探针CM-NBD的的合成

（1）将化合物a1（1 mmol）、a2（1 mmol）、1-羟基苯并三唑（0.5 mmol）、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺（3 mmol）加入到25 mL单口烧瓶中，用N,N-二甲基甲酰胺（5 mL）溶解，常温搅拌10 min后，将催化剂N,N-二异丙基乙胺（0.1 mL）缓慢滴加进烧瓶中，常温下搅拌5h。反应结束后，使用水-二氯甲烷进行萃取，将下层有机相旋干后得到的化合物（I）：

；

（2）化合物（I）（0.36 mmol）与a3（0.36 mmol）和碳酸钾（0.3 mmol）在N,N-二甲基甲酰胺（3 mL）条件下室温搅拌5 h，反应完全后，过滤，通过减压蒸馏将滤液旋干，以二氯甲烷:甲醇（v/v）= 25:1为层析液进行柱层析纯化，得到黄色产物，即为荧光探针CM-NBD，产率84%：

；

其¹H NMR图谱如图1。

实施例2 荧光探针CM-NBD在不同生物硫醇下的荧光光谱

制备1 mM实施例1所得荧光探针CM-NBD的DMSO母液备用。预先准备5份2 mL的PBS缓冲溶液（含20% DMSO，pH=5），均加入20 μL探针母液，分别向该体系中依次加入20 μL浓度为10mM的生物硫醇（Cys、Hcy、GSH、Na₂S）。然后进行荧光检测（λ_ex=405 nm和470 nm），计算各体系中荧光强度，结果如图2所示。由图2可知，在Cys和Hcy存在的情况下，探针在两个独立波长的激发下分别在465 nm和565 nm处产生两种不同的荧光发射。然而，在探针中加入Na₂S和GSH只会在465 nm处产生蓝色荧光。表明荧光探针CM-NBD可以用于检测生物硫醇。

实施例3 荧光探针CM-NBD的选择性

制备1 mM实施例1所得荧光探针CM-NBD的DMSO母液备用。预先准备28份2 mL实施例1所得荧光探针CM-NBD的缓冲溶液（含20% DMSO，pH=5），均加入20 μL探针母液，然后分别向该体系中依次加入20 μL浓度为10 mM AlCl₃、BaCl₂、CaCl₂、CuCl₂、CuSO₄、MgCl₂、FeCl₃、SnCl₂、FeCl₂、ZnCl₂、KCl₂、KNO₃、NaSCN、H₂O₂、HClO、Na₂SO₄、NaBr、NaCl₂、NaClO、NaF、NaI、NaNO₂、NaNO₃、Cys、Hcy、GSH、Na₂S 的PBS溶液。然后进行荧光检测（λ_ex=405 nm和470 nm）；计算各体系中荧光强度，如3所示。由图3可知，荧光探针对生物硫醇的选择性远高于其它物质，表明荧光探针具有专一检测生物硫醇的特性。

实施例4 荧光探针CM-NBD在活细胞中的成像

制备1 mM实施例1所得荧光探针CM-NBD的DMSO母液备用。将HeLa细胞放在培养基（DMEM培养液和10%胎牛血清）中，放置于条件为37 ℃、5% CO₂和20% O₂的培养箱中培养24 h。用微量进样器吸取10 μL荧光探针CM-NBD母液（探针终浓度为10 μM）注入含有HeLa细胞的培养基中，继续在培养箱中培养30 min，进行荧光成像（λ_ex=405 nm），如图4中的探针组所示，直接将荧光探针加入细胞中培养30 min后，能够观测到的蓝色荧光。这表明本发明的荧光探针能够直接检测细胞中内源性生物硫醇分子。为了验证细胞中的荧光信号确实来源于荧光探针对生物硫醇的响应，用生物硫醇的清除剂NEM预先处理细胞30 min，随后加入荧光探针再孵育30 min后进行荧光成像（λ_ex=405 nm），如图4中的NEM+探针组所示，在细胞中几乎观察不到荧光，表明细胞中的荧光信号确实来源于荧光探针对细胞内源性生物硫醇的响应。最后，预先用NEM处理后的细胞，分别加入100 μM 不同的生物硫醇溶液（Cys、Hcy、GSH）和Na₂S溶液，继续培养30 min，再加荧光探针进行培养30 min，进行荧光成像（λ_ex=405 nm）。如图4中的探针+Cys组所示，显示细胞中能观察到较明亮的蓝色荧光和绿色荧光，探针+Hcy组所示，显示细胞中能观察到较暗的蓝色荧光和绿色荧光，探针+GSH组所示，显示细胞中能观察到较明亮的蓝色荧光，探针+Na₂S组所示，显示细胞中能观察到明亮的蓝色荧光。因此，荧光探针CM-NBD能应用于检测细胞内生物硫醇。

实施例5 荧光探针CM-NBD在HeLa细胞中与溶酶体共定位

制备1 mM实施例1所得荧光探针CM-NBD的DMSO母液备用。将HeLa细胞放在培养基（DMEM培养液和10%胎牛血清）中，放置于条件为37℃、5% CO₂和20% O₂的培养箱中培养24 h。将实施例1所述的荧光探针CM-NBD（终浓度为10 μM）和商用溶酶体定位染料Lyso-Tracker red（终浓度为1 μM）加入到HeLa细胞中，培养30 min后，进行激光共聚焦成像。蓝色通道的激发波长是405 nm，收集的波长范围是425-475 nm；绿色通道的激发波长是405 nm，收集的波长范围是500-550 nm，成像结果如图5所示。由图5可知，荧光探针CM-NBD与商用溶酶体在细胞中的荧光信号具有很好的重叠效应，表明荧光探针CM-NBD能够特异性的检测细胞溶酶体中的生物硫醇。

Claims

1.一种检测溶酶体内生物硫醇的荧光探针，其化学结构式如式（I）所示：

式（I）。

2.一种如权利要求1所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

；

（2）化合物（I）与a3于DMF和碳酸钾溶液中搅拌反应，分离提纯得荧光探针：

。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述化合物a1与化合物a2的物质的量比为1:1；步骤（2）中，所述化合物（I）和化合物a3的物质的量比为1:1。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述反应时间为5 h；步骤（2）中，所述反应时间为5 h。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述萃取液为水和二氯甲烷。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述分离提纯步骤为：将反应液过滤，通过减压蒸馏将滤液旋干，进行柱层析纯化；所述层析液为体积比为25:1的二氯甲烷和甲醇。

7.一种如权利要求1所述的荧光探针在检测溶液、细胞溶酶体内生物硫醇的应用。