CN113025324B - 双激发双发射荧光探针CQDs-O-NBD及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了双激发双发射荧光探针CQDs‑O‑NBD及其应用。将对苯二酚和浓H2SO4溶解在超纯水中，然后在微波炉中加热溶液，自然冷却，加入超纯水溶解，透析，冻干；将所得碳量子点、4‑氯‑7‑硝基苯‑2‑氧代‑1,3‑二唑和反应溶剂混合均匀后，加入酸受体，常温下反应，加入乙酸乙酯，离心，倾出上层液。然后再加入乙酸乙酯，再超声分散、离心，重复上述步骤多次。最后将褐色固体于60℃干燥，得目标产物CQDs‑O‑NBD。将CQDs‑O‑NBD作为探针结合荧光方法检测生物硫醇以及区分Cys/Hcy和GSH/NaSH。本发明方法简单新颖，成本低，效率高，且可应用在胎牛血清中Cys的检测和生物细胞成像。

Description

双激发双发射荧光探针CQDs-O-NBD及其应用
技术领域
本发明属于分析化学领域，尤其涉及一种双激发双发射荧光探针的合成和在实际样品胎牛血清和生物细胞中检测生物硫醇中的应用。
背景技术
生物硫醇包括半胱氨酸(Cys)、同型半胱氨酸(Hcy)、谷胱甘肽(GSH)和硫化氢(H2S)，是一类含硫活性物质，广泛存在于生物体内。它们在人体生理过程中起着重要作用，如可逆氧化还原反应和金属离子螯合。Cys是GSH的前体，是蛋白质合成过程中必需的氨基酸。人体缺乏半胱氨酸可引起一些疾病，如儿童生长迟缓、肝损伤、头发变色、皮肤损伤和嗜睡。而同型半胱氨酸水平异常与阿尔茨海默病、心血管病和神经精神疾病密切相关。GSH是细胞中含量最丰富的非蛋白硫醇，主要以还原形式存在于体内。谷胱甘肽浓度失衡与癌症、心脏病、神经退行性疾病、糖尿病和艾滋病有关。H2S是一种最简单的生物硫醇和气体递质，但在细胞内氧化还原调节和信号转导中起着重要作用。H2S浓度异常与卵巢癌、糖尿病、乳腺癌、高血压和肝脏炎症有关。因此，识别和检测这些生物硫醇对某些疾病的早期诊断具有重要意义。
目前，生物硫醇的检测方法主要有毛细管电泳法、电化学法、高效液相色谱法、质谱法、拉曼光谱法和荧光光谱法。与其他方法相比，荧光探针具有操作简单、成本低、分辨率高、灵敏度高、无创性等优点，引起了研究人员的极大兴趣。基于巯基与某些官能团的化学反应是设计生物硫醇荧光探针的策略之一。最近，以7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑(NBD)为离去基团的生物硫醇荧光探针受到广泛关注。然而，大多数用于检测生物体的探针都是由有机荧光团构建的。一般来说，一些探针结构复杂，合成耗时，光稳定性差，长期成像困难。因此，寻找具有良好光学性能、低毒性和生物相容性的荧光团，构建新的荧光探针用于生物体的检测是一个迫切需要解决的问题。因此，设计一种基于碳量子点的方便、快速、有效的检测生物硫醇和区分Cys/GSH和GSH/NaSH的方法具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的之一是设计合成一种可用于有效检测胎牛血清中的Cys和区分检测生物细胞中Cys/Hcy和GSH/H2S的双激发双发射荧光探针CQDs-O-NBD。
本发明的目的之二是提供一种操作简单，成本低，且选择性好的检测和区分生物硫醇的方法。
本发明采用的技术方案是：双激发双发射荧光探针CQDs-O-NBD，所述双激发双发射荧光探针CQDs-O-NBD的制备方法包括如下步骤：
1)将对苯二酚(p-C6H6O2)和浓H2SO4溶解在超纯水中，然后在微波炉中加热1-5min，当溶液变成酒红色时，停止加热，自然冷却，加入超纯水溶解后，转移至透析袋中透析12h，冻干，得深绿色粉末碳量子点CQDs-OH；
2)将碳量子点(CQDs-OH)、4-氯-7-硝基苯-2-氧代-1,3-二唑(NBD-Cl)和反应溶剂混合均匀，加入酸受体，常温下反应24h后，加入乙酸乙酯超声分散，离心取固体，反复加入乙酸乙酯多次，直至离心所得上层液不显红色，将离心所得固体于60℃干燥，得双激发双发射荧光探针CQDs-O-NBD。
进一步的，上述的双激发双发射荧光探针CQDs-O-NBD，步骤1)中，按固液比，对苯二酚:浓H2SO4＝1g:100μL。
进一步的，上述的双激发双发射荧光探针CQDs-O-NBD，步骤2)中，所述反应溶剂选自乙醇、二氯甲烷、四氢呋喃、乙腈、二甲基亚砜或N,N-二甲基甲酰胺。
进一步的，上述的双激发双发射荧光探针CQDs-O-NBD，步骤2)中，所述酸受体选自三乙胺、K2CO3或N,N-二异丙基乙胺。
更进一步的，上述的双激发双发射荧光探针CQDs-O-NBD，所述反应溶剂为N,N-二甲基甲酰胺，所述酸受体为N,N-二异丙基乙胺。
进一步的，上述的双激发双发射荧光探针CQDs-O-NBD，步骤2)中，按固液比，碳量点:4-氯-7-硝基苯-2-氧代-1,3-二唑:N,N-二异丙基乙胺＝0.1mg:0.06mg:130μL。
本发明提供的双激发双发射荧光探针CQDs-O-NBD在定性和定量检测胎牛血清中Cys的应用。
进一步的，方法如下：于含有生物硫醇的胎牛血清中，加入双激发双发射荧光探针CQDs-O-NBD的乙醇/PBS水溶液，混合均匀，在470nm波长光的激发下进行荧光检测。
更进一步的，定性检测胎牛血清样中生物硫醇的方法：取含有生物硫醇的胎牛血清，加入双激发双发射荧光探针CQDs-O-NBD的乙醇/PBS溶液，充分混合，在470nm波长光的激发下进行荧光检测，观察荧光光谱的变化。可以发现，随着胎牛血清中生物硫醇含量增加，双激发双发射荧光探针的荧光强度明显增强。
更进一步的，定量检测实际胎牛血清中Cys的方法：在浓度为10μg·mL-1的双激发双发射荧光探针CQDs-O-NBD(2mL)的乙醇/PBS水溶液中(V乙醇/VPBS＝1/1，CPBS＝10mM，pH＝7.4)分别加入不同体积的Cys(浓度为0.001M)，使Cys的最终浓度分别为0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,5.0,7.5,10.0,12.5,15.0μM，在470nm波长光的激发下进行荧光检测，得出不同浓度的Cys与CQDs-O-NBD荧光强度标准曲线。根据标准曲线，CQDs-O-NBD作为双激发双发射荧光探针来检测胎牛血清中Cys的浓度。
本发明提供的双激发双发射荧光探针CQDs-O-NBD在定性检测生物细胞中生物硫醇或区分生物细胞中Cys/Hcy和GSH/NaSH中的应用。
进一步的，方法如下：于生物细胞中，加入双激发双发射荧光探针CQDs-O-NBD的PBS水溶液，混合均匀，分别于蓝色通道和绿色通道进行荧光成像，观察细胞形状和细胞成像的变化。
本发明的有益效果是：
1.本发明针对被检测物生物硫醇的结构特点，利用亲核取代反应将NBD作为识别基团对碳点进行修饰，然后通过亲核取代和分子内重排反应实现对生物硫醇的特异性检测以及对Cys/Hcy和GSH/NaHS的区分，并设计合成了一种新型的双激发双发射荧光探针。
2.通过本发明的方法，荧光探针CQDs-O-NBD可以对生物硫醇进行灵敏且特异性检测以及对Cys/Hcy和GSH/NaHS的区分。与其它检测生物硫醇的方法相比，具有新颖，简单，成本低，选择性好，不受外界干扰物影响等优点。
附图说明
图1是双激发双发射荧光探针CQDs-O-NBD的合成路线图和检测机理图。
图2是碳量子点CQDs-OH的透射电子显微镜和高分辨透射电子显微镜(插图)的图像(a)，粒度分布直方图(b)和X射线衍射图谱(c)。
图3a是CQDs-OH的X射线光电子全谱图(XPS)(a)，C 1s(b)和O1s(c)的高分辨XPS图谱。
图3b是CQDs-OH和CQDs-O-NBD的傅里叶变换红外光谱(FT-IR)图。
图4是CQDs-O-NBD的X射线光电子全谱图(XPS)(a)和N1s的高分辨XPS图谱(b)。
图5a是CDS-OH，CQDs-O-NBD和CQDs-O-NBD+Cys/Hcy/GSH/NaSH的紫外吸收光谱图。
图5b是在自然光(上)和紫外光条件(下)下，CQDs-O-NBD与Cys、GSH、Hcy和NaHS的照片。
图6是双激发双发射荧光探针CQDs-O-NBD(λex＝377nm)对生物硫醇检测的荧光光谱图。
图7是双激发双发射荧光探针CQDs-O-NBD(λex＝470nm)对生物硫醇检测的荧光光谱图。
图8是双激发双发射荧光探针CQDs-O-NBD(λex＝377nm)与生物硫醇和干扰物质荧光光谱强度的柱状图。
图9是双激发双发射荧光探针CQDs-O-NBD(λex＝470nm)与生物硫醇和干扰物质荧光光谱强度的柱状图。
图10是双激发荧光探针CQDs-O-NBD对Hela细胞的毒性测试。
图11是双激发荧光探针CQDs-O-NBD对HeLa细胞中生物硫醇检测的生物成像图，分别是探针(a-d)、马来酰亚胺+探针(e-h)、马来酰亚胺+探针+Cys(i-l)和马来酰亚胺+探针+GSH(m-p)。
其中，蓝色通道(λex＝405nm，λem＝420-550nm)(第1列)；
绿色通道(λex＝488nm，λem＝520-570nm)(第2列)；
亮场(第3列)；
叠加场(第4列)。
具体实施方式
实施例1双激发双发射荧光探针CQDs-O-NBD
合成路线如图1所示。
(一)制备方法
1、碳量子点(CQDs-OH)的制备
将1.000g对苯二酚(p-C6H6O2)和100μL浓H2SO4溶解在2mL超纯水中，然后在家用微波炉中加热混合溶液。随着加热时间的增加，溶液中水不断蒸发，溶液的体积不断减少。当溶液变成酒红色时，将产品在室温下自然冷却，加入20mL超纯水溶解，转移至透析袋中透析12.0h，冻干，得到深绿色粉末碳量子点(CQDs-OH)。
2、碳量子点-氧-7-硝基苯-2-氧代-1,3-二唑(CQDs-O-NBD)的制备
将0.10mg碳量子点(CQDs-OH)溶解在5mL N,N-二甲基甲酰胺中，加入0.06mg的4-氯-7-硝基苯-2-氧代-1,3-二唑(NBD-Cl)混合均匀，再逐滴加入130.0μL的N,N-二异丙基乙胺，常温下反应24h后，加入20mL乙酸乙酯后出现褐色沉淀，10000rpm离心15分钟，弃去上层液。再加入乙酸乙酯后超声分散、离心，弃去上层液，重复上述步骤多次，直到与NaHS溶液混合的乙酸乙酯层不显示红色，表明产品中的NBD-Cl已全部被洗掉(NBD-Cl与H2S反应非常敏感，显示红色)。最后将所得褐色固体放入60℃烘箱2.0h，得到目标产物CQDs-O-NBD。
(二)检测
(1)CQDs-OH和CQDs-O-NBD的TEM、XRD、XPS、IR和UV-vis检测
图2是碳量子点CQDs-OH的透射电子显微镜和高分辨透射电子显微镜(插图)的图像(a)，粒度分布直方图(b)和X射线衍射图谱(c)。如图2中a所示，CQDs-OH粒子近似球形且单分散。图2中a中的插图为CQDs-OH的高分辨率TEM(HRTEM)图像，插图中清楚地显示碳量子点的晶格间距为0.21nm，这与石墨碳的平面内晶格(100)一致。CQDs OH(基于100个粒子)的平均直径为5.20±0.93nm，范围为3.13至8.25nm(图2中b所示)。所制备的CQDs-OH的XRD衍射图(图2中c所示)在约2θ＝25°处显示主衍射峰(002)，这进一步证实CQDs-OH具有石墨结构和良好的结晶性。
图3a是CQDs-OH的X射线光电子全谱图(XPS)(a)，C 1s(b)和O1s(c)的高分辨XPS图谱。图3b是CQDs-OH和CQDs-O-NBD的傅里叶变换红外光谱(FT-IR)图。XPS测量光谱(图3a中a)显示CQDs-OH主要含有C和O两种元素，含量分别为76.96％和23.04％。两个峰分别对应于284.6和531.5eV，分别属于C1s和O1s。具体而言，C 1s的高分辨率XPS光谱(图3a中b)显示了分别位于287.1、286.2和284.9eV的三个峰，分别对应于C＝O(羰基碳)、C-O(sp3碳)和C-C/C＝C(图形碳)基团。O 1s高分辨率光谱(图3a中c)在531.7和533.2eV的键能处分裂成两个峰，分别归属于C＝O(羧基)和C-OH(羟基氧)基团。计算出CQDs-OH和C＝O的百分比分别为70.95％和29.95％，表明CQDs-OH表面存在大量的-OH。说明制备的CQDs-OH在水中具有良好的溶解性。图3b中CQDs-OH的傅里叶红外光谱显示，在3425cm-1处存在宽而大的吸收峰，这归因于CQDs-OH表面上O-H的拉伸振动峰。1614和1434cm-1处的两个尖峰分别对应于C＝O和C＝C(苯骨架)的拉伸振动峰。C-O拉伸振动峰的位置约为1136cm-1。FT-IR和XPS证实了CQDs-OH具有明显的核结构，表面有大量的-OH。
图4是CQDs-O-NBD的X射线光电子全谱图(XPS)(a)和N1s的高分辨XPS图谱(b)。从测量光谱(图4中a)可以看出，CQDs-O-NBD含有一种新元素N1s(400.3eV)，其含量为9.05％。N 1s高分辨率光谱被分成四个峰(在图4中b)：吡啶N(400.0eV)、N-C(400.1eV)、N-O(404.7eV)、-NO2(405.4eV)，表明CQDs-OH表面被NBD成功修饰。结合图3b可以看出：1539和1330cm-1处的峰值分别归因于-NO2的不对称和对称拉伸振动。此外，CQDs-OH表面的-OH宽而大的特征拉伸振动峰(3425cm-1)几乎消失，表明CQDs-OH与NBD-Cl发生了反应，其表面被NBD基团成功修饰。以上结果表明，CQDs-O-NBD被成功的合成出来的。
(2)双激发双发射荧光探针CQDs-O-NBD对Cys/Hcy和GSH/H2S的光学响应。
图5a是CDS-OH，CQDs-O-NBD和CQDs-O-NBD+Cys/Hcy/GSH/NaSH的紫外吸收光谱图。图5b是在自然光(上)和紫外光条件(下)下，CQDs-O-NBD分别与Cys、GSH、Hcy和NaHS的照片。如图5a所示，CQDs-O-NBD和CQDs-OH在370nm处呈现相同的吸收峰，表明CQDs-O-NBD的吸收峰主要由CQDs-OH引起。当加入一定量的生物硫醇时，形成的CQDs-O-NBD+生物硫醇溶液在370nm处也出现吸收峰，这是由于CQDs-O-NBD与生物硫醇反应后释放出CQDs-OH所致。当GSH加入时，没有出现更多的峰。当Cys、Hcy和NaHS分别加入时，吸收峰出现在467nm和540nm处。根据文献，467nm处的吸收峰属于NBD-N-Cys(Hcy)的特征吸收峰，540nm处的吸收峰属于NBD-SH的特征吸收峰。如图5b所示，在自然光下，形成的CQDs-O-NBD+NaHS溶液呈粉红色，而形成的CQDs-O-NBD+Cys(或Hcy或GSH)溶液呈亮黄色。所以，NaHS可以通过肉眼测试来识别。在紫外灯照射下，形成的CQDs-O-NBD+Cys(或Hcy或GSH或NaHS)溶液呈黄绿色，如图5b所示，证明CQDs-O-NBD与生物硫醇发生了反应。
实施例2双激发双发射荧光探针CQDs-O-NBD在检测生物硫醇的应用
(一)双激发双发射荧光探针CQDs-O-NBD对生物硫醇检测以及对Cys/Hcy和GSH/H2S的区分的荧光光谱。
实验条件：将5mg CQDs-O-NBD溶解于5mL DMF中制备探针储备液(1mg·mL-1)。将Cys、Hcy、GSH和NaHS(H2S的标准来源)溶解在超纯水中制备储备溶液(1mM)。首先，于乙醇/PBS水溶液(Vethanol/VPBS＝1/1，CPBS＝10mM，pH＝7.4)中加入探针CQDs-O-NBD制备探针CQDs-O-NBD的供试品溶液(10μg·mL-1)。然后向标准石英池中加入2mL探针CQDs-O-NBD的供试品溶液(10μg·mL-1)，最后加入60μL的生物硫醇。在室温下孵育一定时间，分别在377nm(孵化时间：120min)和470nm(孵化时间：60min)波长光的激发下记录样品荧光光谱。
图6是双激发双发射荧光探针CQDs-O-NBD(λex＝377nm)对生物硫醇检测的荧光光谱图。图7是双激发双发射荧光探针CQDs-O-NBD(λex＝470nm)对生物硫醇检测的荧光光谱图。如图6和图7所示。在377nm波长光的激发下，探针CQDs-O-NBD在467nm呈现出弱的发射峰，当在470nm波长光的激发下，探针CQDs-O-NBD在546nm处基本没有荧光发射峰。当加入生物硫醇(Cys/Hcy/GSH/NaHS)后，CQDs-O-NBD的醚键被破坏，CQDs被释放，形成NBD衍生物。当激发波长为377nm时，如图6所示，形成的CQDs-O-NBD+Cys/Hcy/GSH/NaSH溶液在467nm处的荧光强度明显增强。当激发波长为470nm时，如图7所示，只有形成的CQDs-O-NBD与Cys/Hcy的溶液在546nm处出现明显的发射峰，这是因为产生了新的荧光物质NBD-N-Cys或NBD-N-Hcy。上述结果清楚地表明，CQDs-O-NBD探针在467nm处能选择性地识别生物硫醇(Cys/Hcy/GSH/NaHS)，在546nm处能区分Cys/Hcy和GSH/NaHS。
(二)不同干扰物质对双激发荧光探针CQDs-O-NBD与生物硫醇检测的影响
实验条件：干扰物质包括氨基酸及各种离子(其中，(1)无分析物只有探针，(2)半胱氨酸Cys，(3)同型半胱氨酸Hcy，(4)谷胱甘肽GSH，(5)硫化氢钠NaHS，(6)精氨酸，(7)天冬氨酸，(8)谷氨酸，(9)组氨酸，(10)赖氨酸，(11)丝氨酸，(12)苏氨酸，(13)色氨酸，(14)酪氨酸，(15)缬氨酸，(16)甘氨酸，(17)苯丙氨酸，(18)Br-，(19)CO3 -，(20)HCO3 -，(21)Cl-，(22)Ca2+，(23)Fe3+，(24)Mg2+，(25)Pb2+，(26)Zn2+)。
分别将干扰物质及各种离子溶于超纯水中，制备浓度为1mM的各种储备溶液。
方法：将2mL浓度为10μg·mL-1的CQDs-O-NBD的乙醇/PBS水溶液加入标准石英池中，然后分别加入60μL生物硫醇或200μL干扰物质后，在室温下孵育一定时间，分别在377nm(孵化时间：120min)和470nm(孵化时间：60min)波长光的激发下记录样品荧光光谱。
图8是双激发双发射荧光探针CQDs-O-NBD(λex＝377nm)与生物硫醇和干扰物质荧光光谱强度的柱状图。图9是双激发双发射荧光探针CQDs-O-NBD(λex＝470nm)与生物硫醇和干扰物质荧光光谱强度的柱状图。从图8和图9中可以看出在377nm波长光的激发下，探针CQDs-O-NBD在467nm呈现出弱的发射峰；当470nm波长光的激发下，在546nm处基本没有荧光发射峰。如从图8所示，当激发波长为377nm时，加入干扰物质后，CQDs-O-NBD溶液的荧光强度没有显著变化。结果表明，干扰物质不与CQDs-O-NBD反应，且CQDs-O-NBD的醚键不被破坏。但加入生物硫醇(Cys、Hcy、GSH或NaHS)后，CQDs-O-NBD的荧光强度显著增加，表明生物硫醇与CQDs-O-NBD发生了反应，醚键断裂，碳点释放。如从图9所示，当激发波长为470nm时，只有Cys和Hcy能在564nm处引起明显的荧光信号增强。其他分析物几乎不改变CQDs-O-NBD的荧光。结果表明，在复杂的生理条件下，以CQDs-O-NBD为探针，在467nm波长下对生物硫醇具有较高的选择性，在546nm波长下能区分Cys/Hcy和GSH/NaHS。
(三)双激发双发射荧光探针CQDs-O-NBD在胎牛血清中检测Cys
虽然同型半胱氨酸Hcy和半胱氨酸Cys与CQDs-O-NBD具有相似的荧光反应，但血清中Hcy的浓度(5-12μM)远低于Cys的浓度(30-200μM)。因此，在实际血清样品的Cys分析中，可以忽略内源性Hcy的干扰。
标准曲线制备：首先，在浓度为10μg·mL-1的双激发双发射荧光探针CQDs-O-NBD(2mL)的乙醇/PBS水溶液中(Vethanol/VPBS＝1/1，CPBS＝10mM，pH＝7.4)分别加入不同体积的Cys溶液(浓度为0.001M的水溶液)，使Cys的最终浓度分别达到0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,5.0,7.5,10.0,12.5,15.0μM。在470nm波长光的激发下进行荧光检测，得出不同浓度的Cys与CQDs-O-NBD在546nm处的荧光强度做标准曲线。根据标准曲线，CQDs-O-NBD作为双激发荧光探针来检测胎牛血清中cys的浓度。
胎牛血清样品中检测Cys方法：使用三苯基膦将胎牛血清(FBS)中的二硫化物转化为游离硫醇化合物，将转化后的FBS稀释50倍，以保证Cys浓度满足线性检测的要求。通过标准加入法，将不同体积的Cys(浓度为0.001M的水溶液)添加到10μg·mL-1的双激发双发射荧光探针CQDs-O-NBD稀释后的FBS溶液(2mL)中，使Cys的最终浓度为2，6和10μM。并在546nm处测定相应的荧光强度。根据标准曲线，计算各添加浓度，结果见表1。
表1是胎牛血清中半胱氨酸Cys的测定数据(λex＝470nm)
Figure BDA0002979740140000091
由表1可见，得到了满意的回收率(99.7-103.2％)。因此，在470nm波长光的激发下，CQDs-O-NBD可以特异性地检测实际胎牛血清中的Cys。
(四)双激发荧光探针CQDs-O-NBD对Hela细胞的毒性测试
由于Cys和Hcy、GSH和NaSH在两种激发波长下的荧光光谱性质相似，所以在荧光共聚焦成像实验中只研究了CQDs-O-NBD作为探针对活细胞中Cys和GSH的成像能力。
实验条件：MTT法检测CQDs-O-NBD对活细胞的毒性。Hela细胞用Dulbecco改良的eagle's培养基(10％胎牛血清)(37℃、5％CO2)在96孔板上培养24h。移除培养基后，每个孔与不同浓度的探针(0-50μg·mL-1)孵育12h，然后加入15μL 3-(4,5-二甲基-2-硫唑)-2.5-二苯-2H-噻唑蓝(MTT)(5mg·mL-1)培养4h，最后在每个孔中加入100μL DMSO溶解形成的甲氧氮杂晶体。将平板搅拌10min，然后用酶标仪测量在570nm处每个孔的吸光度。每种浓度分别进行5次实验，用平均值±标准差来评价细胞活力。
图10是双激发荧光探针CQDs-O-NBD对Hela细胞的毒性测试。如图10所示，当CQDs-O-NBD浓度从0增加到50μg·mL-1时，细胞活力略有下降。当CQDs-O-NBD浓度达到50μg·mL-1时，Hela细胞的存活率仍在80％以上，说明在高浓度的CQDs-O-NBD作用下Hela细胞仍能保持良好的生长状态。以上结果表明，CQDs-O-NBD作为探针对HeLa细胞具有较低的细胞毒性和良好的生物相容性。可以预见，CQDs-O-NBD作为探针在细胞成像实验中具有广阔的应用前景。
(五)双激发荧光探针CQDs-O-NBD对生物细胞中生物硫醇检测的生物成像
实验条件：将Hela细胞置于37℃含5％CO2湿空气的Dulbecco改良Eagle's培养基(DMEM)中培养24小时，添加10％胎牛血清(FBS)、100μg·mL-1青霉素和100μg·mL-1链霉素。然后取出培养基，用磷酸盐缓冲液(PBS)(pH＝7.4)洗涤细胞三次。
第一组用20μg·mL-1探针孵育4h；
第二组用N-乙基马来酰亚胺(NEM，1mM)37℃孵育40min，然后用探针孵育4.0h；
第三组细胞经N-乙基马来酰亚胺(NEM，1mM)37℃预处理40min后，与探针共孵育4.0h，再与100μM Cys共孵育1h；
第四组细胞经N-乙基马来酰亚胺(NEM，1mM)37℃预处理40min后，与探针共孵育4.0h，再与100μM GSH共孵育1h。
各组细胞用PBS洗涤3次，用激光共聚焦显微镜(OLYMPUS FV1200)在激发波长下获得细胞图像波长分别为405nm和488nm。在420-550nm处收集蓝色通道，在520-570nm处收集绿色通道。
图11是双激发荧光探针CQDs-O-NBD对HeLa细胞中生物硫醇检测的生物成像图，分别是第一组探针(a-d)、第二组马来酰亚胺+探针(e-h)、第三组马来酰亚胺+探针(i-l)+Cys和第四组马来酰亚胺+探针(m-p)+GSH。
如图11中a-d所示，首先，HeLa细胞在CQDs-O-NBD溶液(20μg·mL-1)中孵育4.0h，HeLa细胞的荧光呈蓝绿色通道，表明CQDs-O-NBD能穿透HeLa细胞并与内源性硫醇反应产生明显的荧光反应。为了消除细胞中生物硫醇的影响，HeLa细胞用NEM(1mM)(一种众所周知的硫醇阻滞剂)处理40分钟，然后与CQDs-O-NBD(20μg·mL-1)一起再培养4.0小时。如图11中e-h所示，在蓝色和绿色通道中几乎看不到荧光。为了进一步评价CQDs-O-NBD作为外源Cys和GSH探针的荧光响应，进行了以下实验。HeLa细胞经NEM(1mM)预处理40min后，与CQDs-O-NBD(20μg·mL-1)共孵育4.0h，再与Cys(100μM)或GSH(100μM)共培养1.0h，如图11中i-l所示，含Cys的HeLa细胞在蓝色和绿色通道均表现出明显的荧光反应。如图11中m-p所示，含有GSH的HeLa细胞仅在蓝色通道显示出明显的荧光，而在绿色通道未观察到荧光。
以上结果清楚地表明，绿色荧光是由Cys对CQDs-O-NBD的选择性触发产生的NBD-N-Cys引起的，而蓝色荧光是由CQDs-O-NBD和Cys/GSH反应中释放的CQDs-OH引起的。因此，CQDs-O-NBD作为探针具有良好的传感性能，能够通过双荧光信号区分活细胞中的Cys和GSH。

Claims (10)

1.双激发双发射荧光探针CQDs-O-NBD，其特征在于，所述双激发双发射荧光探针CQDs-O-NBD的制备方法包括如下步骤：
1)将对苯二酚和浓H2SO4溶解在超纯水中，然后在微波炉中加热1-5min，自然冷却，加入超纯水溶解后，转移至透析袋中透析12h，冻干，得碳量子点CQDs-OH；
2)将碳量子点CQDs-OH、4-氯-7-硝基苯-2-氧代-1,3-二唑NBD-Cl和反应溶剂混合均匀，加入酸受体，常温下反应24h后，加入乙酸乙酯超声分散，离心取固体，反复加入乙酸乙酯多次，直至离心所得上层液不显红色，将离心所得固体于60℃干燥，得双激发双发射荧光探针CQDs-O-NBD。
2.如权利要求1所述的双激发双发射荧光探针CQDs-O-NBD，其特征在于，步骤1)中，按固液比，对苯二酚:浓H2SO4＝1g:100μL。
3.如权利要求1所述的双激发双发射荧光探针CQDs-O-NBD，其特征在于，步骤2)中，所述反应溶剂选自乙醇、二氯甲烷、四氢呋喃、乙腈、二甲基亚砜或N,N-二甲基甲酰胺。
4.如权利要求1所述的双激发双发射荧光探针CQDs-O-NBD，其特征在于，步骤2)中，所述酸受体选自三乙胺、K2CO3或N,N-二异丙基乙胺。
5.如权利要求3或4所述的双激发双发射荧光探针CQDs-O-NBD，其特征在于，所述反应溶剂为N,N-二甲基甲酰胺，所述酸受体为N,N-二异丙基乙胺。
6.如权利要求1所述的双激发双发射荧光探针CQDs-O-NBD，其特征在于，步骤2)中，按固液比，碳量子点:4-氯-7-硝基苯-2-氧代-1,3-二唑:N,N-二异丙基乙胺＝0.1mg:0.06mg:130μL。
7.权利要求1-6任一项所述的双激发双发射荧光探针CQDs-O-NBD在定性和定量检测胎牛血清中Cys的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，方法如下：于含有生物硫醇的胎牛血清中，加入权利要求1-6任一项所述的双激发双发射荧光探针CQDs-O-NBD的乙醇/PBS水溶液，混合均匀，在470nm波长光的激发下进行荧光检测。
9.权利要求1-6任一项所述的双激发双发射荧光探针CQDs-O-NBD在定性检测生物细胞中生物硫醇或区分生物细胞中Cys/Hcy和GSH/NaSH中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，方法如下：于生物细胞中，加入权利要求1-6任一项所述的双激发双发射荧光探针CQDs-O-NBD的PBS水溶液，混合均匀，分别于蓝色通道和绿色通道进行荧光成像。
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