CN106588912B - 一种可区分检测半胱氨酸/高半胱氨酸、谷胱甘肽和硫化氢的荧光探针及其制备方法、应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种可区分检测Cys/Hcy、GSH和H2S的荧光探针及其制备方法和应用,该探针的分子式为:C38H28IN5O5S,其结构式如下所示:本发明探针合成简单,并且产率较高;实现了水溶液中Cys/Hcy、GSH和H2S的区分检测;本发明实现了活细胞水平中Cys/Hcy、GSH和H2S的区分检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于多信号模式区分检测半胱氨酸/高半胱氨酸、谷胱甘肽和硫化氢的荧光探针及其制备方法、应用,属于分析化学技术领域。
背景技术
活性硫物质(RSS),包括小分子生物硫醇(Thiols)和气体分子硫化氢(H2S),是人体内起着重要生理作用的一类生物活性分子。半胱氨酸(Cys)、高半胱氨酸(Hcy)和谷胱甘肽(GSH)是最常见的三种小分子生物硫醇,然而,它们有着截然不同的生物和药理作用,同时相互之间又存在着密切的联系。Cys是乙酰辅酶、牛磺酸和GSH的前体,同时还能与铁离子形成硫铁络合物,但是异常水平的Cys通常会引起生长缓慢、嗜睡、肝功能损伤、肥胖等疾病。过高浓度的Hcy则可能诱导心血管病和阿尔茨海默氏症,在血浆中Hcy的总浓度还与某些先天性疾病和老年认知障碍有关。GSH是细胞中浓度最大的非蛋白硫醇(1-10mM),以还原型(GSH)和氧化型(GSSG)两种形式存在。它参与了众多生理活动,例如氧化还原反应、异物代谢、信号传导与基因调控等,在细胞生长和维持细胞氧化还原平衡上起着关键作用。GSH还是一种抗氧化剂,可以保护巯基蛋白和酶免遭氧化,维持活性。然而,浓度异常的GSH往往与癌症、阿尔茨海默氏症和心血管等疾病有关。H2S是继一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)之后被发现的第三种内源性信号气体分子,在心血管和神经系统中承担着重要的生理调节作用,例如调节血管张力、心肌收缩、神经传导和胰岛素分泌等。若细胞中H2S浓度发生异常,可能会引起高血压、阿尔茨海默氏症、胃粘膜损伤和肝硬化等疾病。因此,发展能区分识别硫醇(Cys/Hcy/GSH)和硫化氢(H2S)的荧光探针对研究生命体系中硫醇之间及硫醇与H2S的生理联系和它们的生理功能意义重大,也有助于探索与Cys/Hcy/GSH和H2S相关疾病的发生发展机制以及研发治疗相关疾病的药物。
近年来,由于小分子有机荧光探针具有高选择性、高灵敏度、操作方便、无创性检测等优点,从而受到了包括生命科学、医学、药理学、分析化学等各个领域的广泛关注。特别是在分析检测生物样品中,荧光探针更能体现出其优势。荧光探针能对生物样品中目标分子进行非侵入性成像检测,可以实时观察到荧光探针识别目标分子前后的光学信号变化,并且能将这些信号转化为具体的图片信息。目前,虽然报道了大量的Cys/Hcy、GSH和H2S荧光探针,但它们还无法同时将Cys/Hcy、GSH和H2S区分检测开来。所以,发明能同时、快速区分检测Cys/Hcy、GSH和H2S的易观查信号变化的荧光探针是非常有必要的。
发明内容
本发明通过分子设计,合成出了一种区分检测半胱氨酸/高半胱氨酸、谷胱甘肽和硫化氢的荧光探针,简称HMN,其是基于多信号模式区分检测半胱氨酸/高半胱氨酸、谷胱甘肽和硫化氢的;本发明还进一步提供了该探针HMN的制备方法和应用。
本发明采用以下技术方案:
一种可区分检测半胱氨酸/高半胱氨酸、谷胱甘肽和硫化氢的荧光探针,该探针的分子式为:C38H28IN5O5S,其结构式如下所示:
上述的可区分检测半胱氨酸/高半胱氨酸、谷胱甘肽和硫化氢的荧光探针的制备方法,它包括以下步骤:
1)将1.0mmol原料羟基吲哚、2.0mmol苄基溴和2.0mmol碘化钾置于圆底烧瓶中,滴加乙腈使反应物完全溶解,将反应液加热至回流,搅拌反应6小时,反应完毕后,通过旋转蒸发仪减压蒸馏除去反应液中的溶剂得到粗产品,并用硅胶层析柱纯化得到纯净化合物2;
所述化合物2的结构式为:
2)取0.2mmol化合物2和0.2mmol苯并噻唑(HBTQ)置于圆底烧瓶中,滴加乙醇使反应物完全溶解,将反应加热至回流,搅拌4小时,反应完毕后,通过旋转蒸发仪减压蒸馏除去反应液中的溶剂得到粗产品,并用硅胶层析柱纯化得到纯净化合物HBTMC;
所述化合物HBTMC的结构式如下:
3)取0.1mmol化合物HBTMC、0.12mmol 4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑和0.1mmol碳酸铯置于圆底烧瓶中,滴加二氯甲烷使之完全溶解,在氮气保护和常温下搅拌反应2小时,待反应完毕,通过旋转蒸发仪减压蒸馏除去反应液中的溶剂得到粗产品,并用硅胶层析柱纯化得到纯净目标探针化合物HMN。
所述步骤1)中硅胶层析柱纯化所用洗脱剂为二氯甲烷与乙醇体积比为50:1。
所述步骤2)中硅胶层析柱纯化所用洗脱剂为二氯甲烷与乙醇体积比为20:1。
所述步骤3)中硅胶层析柱纯化所用洗脱剂为二氯甲烷与乙醇体积比为25:1。
上述的荧光探针的合成路线如下:
本发明基于多信号模式区分检测Cys/Hcy、GSH和H2S荧光探针的用途:通过荧光光谱仪测试在水溶液中由Cys/Hcy、GSH和H2S引起荧光探针HMN的荧光光谱变化来区分检测水环境中的Cys/Hcy、GSH和H2S;或者通过共聚焦显微镜对孵育了荧光探针HMN和Cys/Hcy、GSH和H2S的活细胞进行荧光成像,观察蓝色、绿色和红色通道荧光信号的变化以达到区分检测生物环境中的Cys/Hcy、GSH和H2S的目的。
本发明的优点:(1)探针合成简单,并且产率较高;(2)本发明实现了水溶液中Cys/Hcy、GSH和H2S的区分检测;(3)本发明实现了活细胞水平中Cys/Hcy、GSH和H2S的区分检测。
附图说明
图1是实施例1中化合物2的1H NMR图谱;
图2是实施例1中化合物2的13C NMR图谱;
图3是实施例1中化合物HBTMC的1H NMR图谱;
图4是实施例1中化合物HBTMC的13C NMR图谱;
图5是实施例1中探针HMN的1H NMR图谱;
图6是实施例1中探针HMN的13C NMR图谱;
图7是实施例1中探针HMN随不同量Cys、Hcy、GSH和H2S的加入荧光谱图的变化情况;图中,Cys、Hcy和GSH浓度依次为0、10、30、50、70、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、650、800、1000μmol/L,H2S的浓度依次为0、10、30、50、70、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、800、1000、1200、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000μmol/L;
图8是实施例3中探针HMN与Cys、Hcy、GSH和H2S随时间变化的485、546和609nm处荧光强度值变化图;
图9是实施例4中探针HMN对不同干扰分析物的选择性柱状荧光数据图;图中,1,空白;2,丙氨酸;3,精氨酸;4,天冬氨酸;5,谷氨酸;6,异亮氨酸;7,苯丙氨酸;8,丝氨酸;9,苏氨酸;10,色氨酸;11,缬氨酸;12,组氨酸;13,抗坏血酸钠;14,醋酸钠;15,溴化钾;16,氯化钠;17,硝酸钠;18,亚硝酸钠;19,迭氮化钠;20,亚硫酸钠;21,硫代硫酸钠;22,氯化亚铜;23,氯化钙;24,氯化亚铁;25,氯化铁;26,氯化锌;27,次氯酸钠;28,过氧化钾;29,过氧化氢;30,过氧化叔丁醇;31,一氧化氮;32,Cys;33,Hcy;34,GSH;35,H2S(LC);36,H2S(HC);
图10是实施例5中探针HMN与HeLa细胞中Cys、Hcy、GSH和H2S响应的荧光成像图;图中,(a)是加入5μM探针HMN孵育30分钟后的荧光成像,(b)是先加入0.5mmol/L NEM孵育30分钟,随后加入5μM探针HMN继续培育30分钟后的荧光成像;(c-e)是先加入0.5mmol/L NEM孵育30分钟,随后加入0.2mmol/L Cys、Hcy或2.0mmol/L Na2S并孵育20分钟,最后再加入5μM探针HMN继续培育30分钟后的荧光成像;第一列至第三列分别为蓝色、绿色和红色通道荧光成像,第四列为蓝色、绿色、红色通道成像和明场成像叠加图;蓝色、绿色和红色通道荧光成像的激发波长分别为405、488和561nm,标尺为20微米。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明,但本发明不受下述实施例的限制。
实施例1
化合物2的合成:
将175mg羟基吲哚(1.0mmol),342mg(2.0mmol)苄基溴和232mg碘化钾(2.0mmol)置于圆底烧瓶中,加乙腈使反应物完全溶解,将反应液加热至回流,搅拌反应6小时。反应完毕后,通过旋转蒸发仪减压蒸馏将溶剂除去得到粗产品,以体积比为50:1的二氯甲烷与乙醇为洗脱剂,用硅胶(200-300目)层析柱进行纯化,得到252mg深褐色固体(产率64%)。1H NMR(400MHz,CD3OD),δ(ppm):1.64(s,6H),5.77(s,2H),6.91-6.94(dd,J=8.8,2.4Hz,1H),7.136-7.142(d,J=2.4Hz,1H),7.37-7.38(2H),7.42-7.48(3H),7.56-7.58(d,J=8.8Hz,1H);13C NMR(100MHz,CD3OD):δ(ppm):14.61,22.80,51.04,54.46,111.01,115.79,117.43,127.81,129.15,129.74,132.73,133.52,144.61,159.66,197.29.
化合物HBTMC的合成:
取51mg化合物HBTQ(0.2mmol)和79mg化合物2(0.2mmol)置于圆底烧瓶中,加乙醇使反应物完全溶解,将反应液加热至回流,搅拌反应4小时。反应完毕后,通过旋转蒸发仪减压蒸馏将溶剂除去得到粗产品,以体积比为20:1的二氯甲烷与乙醇为洗脱剂,用硅胶(200-300目)层析柱进行纯化,得到86mg暗红色固体(产率68%)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):1.86(s,6H),5.99(s,2H),6.91(dd,J=8.8,2.4Hz,1H),7.27-7.26(2H),7.36-7.44(m,5H),7.48-7.52(t,J=7.2Hz,1H),7.60-7.62(2H),7.70-7.74(d,J=16.8,1H),8.11-8.13(d,J=8.0Hz,1H),8.18-8.22(1H),8.24-8.37(dd,J=8.8,2.0Hz,1H),8.60-8.64(d,J=16.0Hz,1H),8.99-9.00(d,J=2.0Hz,1H);13C NMR(100MHz,DMSO-d6):δ(ppm):14.49,26.44,52.47,63.44,110.57,111.07,116.24,117.08,118.55,120.09,122.65,125.80,127.32,128.91,129.78,132.85,133.38,134.42,135.29,146.64,151.79,152.69,159.80,161.07,163.74,180.02。
化合物HMN的合成:
取63mg化合物HBTMC(0.1mmol)、24mg NBD-Cl(0.12mmol)和33mg碳酸铯(0.1mmol)置于圆底烧瓶中,加二氯甲烷使反应物完全溶解,在氮气保护和常温下搅拌反应2小时。待反应完毕后,通过旋转蒸发仪减压蒸馏将溶剂除去得到粗产品,以体积比为25:1的二氯甲烷与乙醇为洗脱剂,用硅胶(200-300目)层析柱进行纯化,得到35mg蓝色固体(产率44%)。1H NMR(400MHz,CDCl3),δ(ppm):1.85(s,6H),5.65(s,2H),6.52-6.55(d,J=11.2Hz,1H),6.81-6.83(d,J=8.4Hz,1H),6.96-6.99(d,J=14.4Hz,1H),7.34-7.37(2H),7.41-7.50(7H),7.86(s,1H),7.93-7.95(d,J=8.4Hz,1H),8.05-8.07(d,J=7.6Hz,2H),8.44-8.47(d,J=11.2Hz,1H),8.67-8.69(d,J=8.4Hz,2H),8.86(s,1H);13C NMR(100MHz,CDCl3):δ(ppm):14.47,27.59,50.13,110.59,113.52,116.34,121.80,122.24,124.30,126.25,127.28,128.42,129.60,130.92,135.68,135.99,136.22,140.80,144.33,144.86,145.83,151.07,151.98,153.19,153.58,163.47,175.55。
实施例2
探针HMN与不同当量Cys/Hcy、GSH和H2S反应的荧光光谱变化
取实施例1制备的探针HMN溶于乙腈中,制成浓度为1.0mmol/L探针母液(探针HMN的浓度为1.0mmol/L);将Cys/Hcy、GSH和H2S加入蒸馏水,配制成浓度为5mmol/L的Cys/Hcy、GSH和H2S母液。从探针母液中取出30μL加入到5mL的离心管当中,分别加入不同当量的Cys/Hcy、GSH(0-100eq)和H2S(0-500eq)母液,用0.57mL乙腈和不同体积的PBS水溶液(浓度25mmol/L,pH 7.4)稀释至3mL,配置成探针浓度为10μmol/L,含20%乙腈的测试溶液。用荧光光谱仪测试探针与不同当量的Cys/Hcy、GSH(0-100eq)和H2S(0-500eq)反应液的荧光光谱变化(激发波长分别为410、470和550nm),荧光光谱变化情况如图7所示。由图7可见,随着Cys或Hcy加入当量的逐渐增加,当用410nm光源激发时,探针HMN溶液在485nm处的荧光峰值不变;当用470或550nm光源激发时,在546和609nm处的荧光峰值逐渐增加。随着GSH加入当量的逐渐增加,当用410或550nm光源激发时,探针HMN溶液在485和546nm处的荧光峰值不变;当用550nm光源激发时,在609nm处的荧光峰值逐渐增加。随着H2S加入当量的逐渐增加,当用410nm光源激发时,探针HMN溶液在485nm处的荧光峰值不变,而单量达到50后,荧光峰值开始增加;当用470nm光源激发时,探针HMN溶液在546nm处的荧光峰值一直不变;当用550nm光源激发时,探针HMN溶液在609nm处的荧光峰值逐渐增加,而单量达到50后,荧光峰值开始减弱。当荧光强度达到最大值时,加入Cys/Hcy后在546和609nm处的荧光强度比探针空白液分别增强53.4/57.6和32.2/32.9倍;加入GSH后在609nm处的荧光强度比探针空白液增强33.6倍;加入H2S后在485和609nm处的荧光强度比探针空白液分别增强52.7和17.7倍。
实施例3
探针HMN与Cys/Hcy、GSH和H2S随时间变化的荧光变化
从实施例2探针母液中取出30μL加入到5mL的离心管当中,分别加入不同当量的Cys/Hcy(55eq)、GSH(65eq)和H2S(50或500eq)母液,用0.57mL乙腈和不同体积的PBS水溶液(浓度25mmol/L,pH 7.4)稀释至3mL,配置成探针浓度为10μmol/L,含20%乙腈的测试溶液。分别用410、470和550nm的激发波长,测试探针随时间变化的荧光光谱。由图8可见,随着时间增加,加入Cys/Hcy后,在485和609nm处的荧光强度逐渐变大,并且分别在12/20和15/20min左右达到最大值;加入GSH后,在609nm处的荧光强度逐渐变大,并且在20min左右达到最大值;加入50eq H2S后,在609nm处的荧光强度逐渐变大,并且在4min左右达到最大值;加入500eq H2S后,在485nm处的荧光强度逐渐变大,并且在2min左右达到最大值。
实施例4
探针HMN对不同干扰分析物的选择性研究
从实施例2中荧光探针母液中取出30μL加入到5mL的离心管当中,分别加入以下不同浓度的分析物:1.0mmol/L的丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸、组氨酸、抗坏血酸钠、醋酸钠、溴化钾、氯化钠、硝酸钠、亚硝酸钠、迭氮化钠、亚硫酸钠、硫代硫酸钠、氯化亚铜、氯化钙、氯化亚铁、氯化铁、氯化锌、次氯酸钠、过氧化钾、过氧化氢、过氧化叔丁醇和一氧化氮,0.6mmol/L的Cys、Hcy和GSH,0.5mmol/L的H2S,5.0mmol/L的H2S,用0.57mL DMF和不同体积的PBS水溶液(浓度25mmol/L,pH 7.4)稀释至3mL,配置成探针浓度为10μmol/L,含20%乙腈的测试溶液。反应20分钟后检测测试液的荧光光谱变化。由图9可以发现,相对于空白测试液,当用410nm光源激发时,只有加入5.0mmol/L H2S的探针溶液在485nm处荧光峰值显著增加;当用470nm光源激发时,只有加入Cys和Hcy的探针溶液在546nm处荧光峰值显著增加;当用550nm光源激发时,只有加入Cys、Hcy、GSH和H2S(0.5mmol)的探针溶液在609nm处荧光峰值显著增加。而加入各种氨基酸、阴离子、金属离子、活性氧和活性氮的测试液,无论用410、470或550nm光源激发都没有引起探针溶液明显的荧光强度变化。实验结果说明探针HMN可以通过三个通道的荧光变化来区别其他干扰物,同时实现Cys/Hcy、GSH和H2S的区分识别。
实施例5
探针HMN与细胞中的Cys/Hcy、GSH和H2S荧光成像
为了证明探针HMN能区分识别细胞中的Cys/Hcy、GSH和H2S,一共做了五组细胞荧光成像实验。第一组:从实施例2中荧光探针母液中取出5μL加入到育有HeLa细胞的培养皿(含1mL PBS培养基)中,探针浓度为5μmol/L,孵育30分钟;第二组:将0.5mmol/L的N-乙基马来酰亚胺(NEM)加入到有HeLa细胞的培养皿中,孵育30分钟后加入5μmol/L探针HMN,并继续孵育30分钟;第三组:将0.5mmol/L的N-乙基马来酰亚胺(NEM)加入到有HeLa细胞的培养皿中,预先孵育30分钟,随后加入0.2mmol/L的Cys并孵育15分钟,最后再加入5μmol/L探针HMN,继续孵育30分钟;第四组:将0.5mmol/L的NEM加入到有HeLa细胞的培养皿中,预先孵育30分钟,随后加入0.2mmol/L的Hcy并孵育15分钟,最后再加入5μmol/L探针HMN,继续孵育30分钟;第五组:将0.5mmol/L的NEM加入到有HeLa细胞的培养皿中,预先孵育30分钟,随后加入2.0mmol/L的Na2S并孵育15分钟,最后再加入5μmol/L探针HMN,继续孵育30分钟。随后,用共聚焦显微镜分别对五组细胞进行荧光成像,使用激发波长为405、488和561nm的光源激发,收集465-500、525-555和595-630nm范围的荧光。结果如图10所示,在只加入探针的细胞组中,蓝色和绿色通道都没有荧光,而红色通道有很强的荧光,这应该是探针细胞中内源性的GSH作用的结果;在加入硫醇抑制剂NEM的细胞组中,无论是蓝色、绿色通道,还是红色通道几乎都观察不到荧光;然而,在加入Cys或Hcy的细胞组中,可以明显地观察到绿色和红色荧光;而加入H2S的细胞组中,绿色和红色通道都没有荧光,但是在蓝色通道能观察到较强的荧光。实验结果说明探针HMN可以通过共聚焦显微镜三通道荧光成像,实现区分检测细胞环境中的Cys/Hcy、GSH和H2S,具有潜在的实际应用价值。
Claims (5)
1.一种可区分检测半胱氨酸/高半胱氨酸、谷胱甘肽和硫化氢的荧光探针,其特征在于,探针的分子式为:C38H28IN5O5S,其结构式如下所示:
。
2.一种权利要求1所述的可区分检测半胱氨酸/高半胱氨酸、谷胱甘肽和硫化氢的荧光探针的制备方法,其特征在于,它包括以下步骤:
1)将1.0mmol原料2,3,3-甲基羟基吲哚、2.0mmol苄基溴和2.0mmol碘化钾置于圆底烧瓶中,滴加乙腈使反应物完全溶解,将反应液加热至回流,搅拌反应6小时,反应完毕后,通过旋转蒸发仪减压蒸馏除去反应液中的溶剂得到粗产品,并用硅胶层析柱纯化得到纯净化合物2;
所述化合物2的结构式为:
;
2)取0.2mmol化合物2和0.2mmol3-苯并噻唑基-2-羟基苯甲醛置于圆底烧瓶中,滴加乙醇使反应物完全溶解,将反应加热至回流,搅拌4小时,反应完毕后,通过旋转蒸发仪减压蒸馏除去反应液中的溶剂得到粗产品,并用硅胶层析柱纯化得到纯净化合物HBTMC;
所述化合物HBTMC的结构式如下:
;
3)取0.1mmol化合物HBTMC、0.12mmol 4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑和0.1mmol碳酸铯置于圆底烧瓶中,滴加二氯甲烷使之完全溶解,在氮气保护和常温下搅拌反应2小时,待反应完毕,通过旋转蒸发仪减压蒸馏除去反应液中的溶剂得到粗产品,并用硅胶层析柱纯化得到纯净目标探针化合物。
3.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述步骤1)中硅胶层析柱纯化所用洗脱剂为体积比50:1的二氯甲烷与乙醇。
4.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述步骤2)中硅胶层析柱纯化所用洗脱剂为体积比20:1的二氯甲烷与乙醇。
5.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述步骤3)中硅胶层析柱纯化所用洗脱剂为体积比25:1的二氯甲烷与乙醇。
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