CN105372217B - 一种甲醛荧光探针及其制备方法、应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种甲醛荧光探针其制备方法、应用，属于分析化学技术领域。本发明的甲醛荧光探针，是一种具有双发射带的比率型荧光探针。其激发波长为318 nm；随甲醛浓度的升高，其在359 nm处的荧光峰值逐渐降低，同时在451 nm处产生一个新的发射带并且荧光峰值逐渐增强。本发明的甲醛荧光探针，能抗乙醛、乙二醛、甲基乙二醛、苯甲醛、丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、精氨酸、半胱氨酸、谷胱甘肽和葡萄糖的干扰。检测准确性高；灵敏度高；抗干扰能力强。另外，本发明的甲醛荧光探针还能检测生物样品（细胞环境）中的甲醛，现了在活细胞水平中甲醛的荧光成像，具有潜在的实际应用价值。而本发明的甲醛荧光探针的合成只需通过一步反应，方法简单，产率较高。

Description

一种甲醛荧光探针及其制备方法、应用

技术领域

本发明涉及一种甲醛荧光探针其制备方法、应用，属于分析化学技术领域。

背景技术

近年来，检测具有活性羰基的物质受到了广泛关注，比如一氧化碳、乙二醛、甲基乙二醛和丙烯醛等。醛类物质是人体新陈代谢过程的产物，通常被认为是对人体有毒的。那是因为羰基具有较高活性，能与蛋白质和DNA末端的氨基反应，破坏其原有的生物活性，已被证明醛类物质与糖尿病、心血管病、脑梗塞、肝脏疾病和癌症等疾病有关。甲醛作为最简单的醛，它不但可以通过自然活动和人类生产活动产生，也可以在生物体内通过去甲基化酶和氧化酶催化产生，比如氨基脲敏感胺氧化酶（SSAO）和赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶1（LSD1）。人体内正常水平浓度的甲醛起着重要作用，与空间记忆和认知能力的形成紧密相关。然而，当甲醛浓度高于正常水平时，会引起一些疾病的发生，例如心脏病、阿兹海默症、癌症等。因此，检测生理环境的甲醛可能对与甲醛相关的病理研究有帮助，是一项非常重要和有实际意义的工作。

荧光分析法具有特异选择性、实时在线检测和对生物样品非侵入检测等其他传统检测方法而不具备的优点而备受关注。荧光分析法是通过荧光探针与特定目标分析物作用，检测其荧光信号变化的一种检测方法。以在检测过程中产生的发射带数量来分，荧光探针通常分为两类，一类是只有单发射带的荧光增强型或淬灭型荧光探针，其荧光信号的强度通常与探针浓度、探针所处环境、检测仪器等因素有关，因此其检测的准确性会受到影响；另一类是具有双发射带的比率型荧光探针，可以通过检测其比值信号来消除以上因素所带来的实验误差，因此这类荧光探针在荧光分析法中更具有准确性。而目前报道的甲醛荧光探针都是基于第一类的增强型荧光探针，还没有比率型甲醛探针被报道。所以开发具有比值荧光信号的甲醛探针还需进一步探索和研究。

发明内容

针对目前甲醛荧光探针检测甲醛时所面临的“检测准确性容易受探针浓度、探针所处环境、检测仪器影响”的现状，本发明通过分子设计，合成出一种具有双发射带的比率型甲醛荧光探针，我们将其命名为RFFP；并进一步提供了RFFP的制备方法和应用。

技术方案

一种甲醛荧光探针，其分子式为：C₁₄H₁₅NO；其结构式如下:

。

本发明的甲醛荧光探针，是一种具有双发射带的比率型荧光探针。其激发波长为318 nm；随甲醛浓度的升高，其在359 nm处的荧光峰值逐渐降低，同时在451 nm处产生一个新的发射带并且荧光峰值逐渐增强。其在451 nm处的荧光强度与359 nm处的荧光强度比值（I₄₅₁/I₃₅₉），随甲醛浓度的升高而增强；当甲醛浓度是醛荧光探针浓度的300倍时，I₄₅₁/I₃₅₉=53。

本发明的甲醛荧光探针，随着时间增加，451 nm处的荧光强度与359 nm处的荧光强度比值（I₄₅₁/I₃₅₉）逐渐变大，并且在200分钟左右达到最大值。

本发明的甲醛荧光探针，能抗乙醛、乙二醛、甲基乙二醛、苯甲醛、丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、精氨酸、半胱氨酸、谷胱甘肽和葡萄糖的干扰。

所以，本发明还提供了上述甲醛荧光探针的应用，用于检测甲醛。包括用于检测水环境中的甲醛和生物样品的甲醛。

上述应用，具体方法为：采用荧光光谱仪，通过甲醛荧光探针的荧光光谱变化来检测水环境中的甲醛；或者，采用共聚焦显微镜，通过观察甲醛荧光探针的荧光成像图的变化来检测生物样品中的甲醛。所述生物样品，可以是活细胞。

上述应用，采用荧光光谱仪，激发波长为318 nm；随甲醛浓度的升高，荧光光谱在359 nm处的荧光峰值逐渐降低，同时在451 nm处产生一个新的发射带并且荧光峰值逐渐增强。

上述应用，采用共聚焦显微镜，激发光源为汞灯，分别收集蓝色和绿色频道荧光；随着甲醛浓度的增加，蓝色频道荧光逐渐减弱，同时绿色频道荧光逐渐增强。

上述的甲醛荧光探针的合成路线如下：

。

上述甲醛荧光探针的制备方法：

将6-羟基-2-萘甲醛的甲醇溶液和质量分数为25%的氨水混合，在冰浴条件下搅拌30-60分钟；然后加入烯丙基硼酸频哪醇酯，撤去冰浴，在搅拌条件下反应10小时以上；除去溶剂，得产品。

优选的，除去溶剂采用的方法为减压蒸馏。

优选的，可以采用硅胶层析柱对产品进行纯化。

本发明甲醛荧光探针，检测准确性不容易受探针浓度、探针所处环境、检测仪器影响，准确性高；所能检测到的甲醛的最低浓度为5.53 × 10^-5 mmol/L，灵敏度高；抗干扰能力强，实现了在水溶液中对甲醛的高选择性检测；不仅能检测水环境中的甲醛，还能检测生物样品（细胞环境）中的甲醛，现了在活细胞水平中甲醛的荧光成像，具有潜在的实际应用价值。本发明的甲醛荧光探针的合成只需通过一步反应完成：其制备方法简单，并且产率较高。

附图说明

图1是实施例1中探针RFFP的¹H NMR图谱；

图2是实施例1中探针RFFP的¹³C NMR图谱；

图3是实施例2中探针RFFP随不同量甲醛的加入，荧光谱图的变化情况；图中，在359 nm处的荧光峰值，从上至下，依次为在甲醛浓度为0、0.01、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.40、0.50、0.60、0.80、1.00、1.50、2.00、3.00 mmol/L中探针RFFP的荧光光谱；在451 nm处的荧光峰值，从下至上，依次为在甲醛浓度为0、0.01、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.40、0.50、0.60、0.80、1.00、1.50、2.00、3.00 mmol/L中探针RFFP的荧光光谱；

图4是实施例2中探针RFFP荧光强度比值（I₄₅₁/I₃₅₉）与不同量甲醛的线性关系图；图中，从左往右，甲醛浓度依次为0.20、0.25、0.30、0.40、0.50、0.60、0.80、1.00、1.50、2.00、3.00 mmol/L；

图5是实施例3中探针RFFP与甲醛随时间变化的点状荧光数据图；

图6是实施例4中探针RFFP对不同干扰分析物的选择性柱状荧光数据图；图中，1，空白；2，甲醛；3，乙醛；4，甲基乙二醛；5，乙二醛；6，苯甲醛；7，丙氨酸；8，甘氨酸；9，丝氨酸；10，精氨酸；11，半胱氨酸；12，谷胱甘肽；13，葡萄糖；14，双氧水；

图7是实施例5中探针RFFP与细胞中甲醛响应的荧光成像图；图中，加入10 μM探针RFFP 孵育30分钟后的荧光成像(a-d)，随后加入1 mmol/L(e-h)或者3 mmol/L(i-l)甲醛继续培育2小时后的荧光成像；(a, e, i)，明场成像；(b, f, j)，蓝色通道荧光成像图；(c,g, k)，绿色通道荧光成像；(d, h, k)，比值图像（绿/蓝）；标尺为25微米。

具体实施方式

实施例1:化合物RFFP的合成：

将86 mg 6-羟基-2-萘甲醛（0.5 mmol）溶解于5 mL甲醇中，在冰浴条件下，加入378 μL质量分数为25%的氨水（5 mmol）并持续搅拌30分钟。随后加入101 mg烯丙基硼酸频哪醇酯（0.6 mmol），撤去冰浴并继续搅拌反应过夜(10h以上)。反应完后，将反应液通过减压旋转蒸发仪除去溶剂得到粗产品，并用硅胶（200-300目）层析柱，以体积比为10:1的二氯甲烷与乙醇为洗脱剂进行纯化，得到70 mg白色固体（产率为66%）。¹H NMR (400 MHz,CDCl₃), (ppm): 2.47-2.63 (m, 2H), 4.10-4.13 (t, J = 6.8 Hz, 1H), 5.09-5.18(m,2H), 5.69-5.79 (m, 1H), 6.94-6.95(1H), 6.98-7.01 (dd, J = 8.8, 2.4 Hz, 1H),7.31-7.34 (dd, J = 8.8, 1.6 Hz, 1H),7.43-7.45 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 7.54-7.56(d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.60(s, 1H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ (ppm): 43.34,55.31, 109.46, 118.27, 118.75, 124.96, 126.78, 128.32, 129.39, 134.06, 13.96,138.78, 15.39。所得白色固体即为RFFP。

实施例2: 探针RFFP随不同量甲醛的加入荧光谱图的变化

取实施例1制备的探针RFFP溶于丙酮中，制成浓度为1 mol/L探针母液（探针RFFP的浓度为1 mol/L）；将质量分数为37%的甲醛溶液加入蒸馏水，配制成甲醛浓度分别为1mmol/L、50 mmol/L和500 mmol/L的甲醛母液。从探针母液中取出30 μL加入到5mL的离心管当中，加入不同当量（1-300 eq）的甲醛母液（是指加入的甲醛母液中的甲醛含量为探针母液中RFFP含量的1-300倍），用磷酸二氢钾水溶液（浓度25 mmol/L，pH 7.4）稀释至3mL，配置成探针浓度为10 μmol/L，含1%丙酮的测试溶液。用荧光光谱仪测试探针在不同浓度甲醛母液中的荧光光谱变化（激发波长为318 nm），荧光光谱变化情况如图3 所示。由图3可见，随着甲醛加入当量的增加，荧光探针RFFP溶液在359 nm处的荧光峰值逐渐降低，同时在451nm处产生一个新的发射带并且其荧光峰值逐渐增强。451 nm处的荧光强度与359 nm处的荧光强度比值（I₄₅₁/I₃₅₉）增加了53倍。

实施例3: 探针RFFP检测甲醛下限的计算

根据实例2的荧光光谱图，451 nm处的荧光强度与359 nm处的荧光强度比值（I₄₅₁/I₃₅₉）与对应甲醛浓度做图。由图4可见，甲醛浓度在20-300当量时，I₄₅₁/I₃₅₉与甲醛浓度具有很好线性。根据公式Dl=3σ/k(Dl为检测下限，σ为截距标准偏差，k为斜率)可计算检测下限为5.53 × 10^-5 mmol/L。

实施例4: 探针RFFP随不同量甲醛的加入荧光谱图的变化

从实施例2 的荧光探针母液中取出30 μL 加入到5mL 的离心管当中，加入18 μL浓度为500 mmol/L的甲醛母液，再用磷酸二氢钾水溶液（浓度25 mmol/L，pH 7.4）稀释至3mL，配制成探针浓度为10 μmol/L，甲醛浓度为3 mmol/L，含1%丙酮的测试溶液。用荧光光谱仪测试探针在甲醛母液中随时间变化的荧光光谱。由图5可见，随着时间增加，451 nm处的荧光强度与359 nm处的荧光强度比值（I₄₅₁/I₃₅₉）逐渐变大，并且在200分钟左右达到最大值。

实施例5: 探针RFFP对不同干扰分析物的选择性研究

从实施例2 中荧光探针母液中取出30μL 加入到5mL 的离心管当中，分别加入以下不同浓度的干扰分析物：5 mmol/L的乙醛、乙二醛、甲基乙二醛、苯甲醛、丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、精氨酸、半胱氨酸、谷胱甘肽、葡萄糖，以及0.5 mmol/L的双氧水，3 mmol/L的甲醛，配制成探针浓度为10μmol/L，含1%丙酮的测试溶液。反应30分钟后检测溶液的荧光发射光谱变化。由图6可以发现，相对于空白测试液（仅含荧光探针母液），只有加入甲醛的测试液的荧光强度比值（I₄₅₁/I₃₅₉）明显地变大，而加入其它分析物的测试液的荧光强度比值几乎没有变化。

实施例6：探针RFFP与细胞中甲醛的荧光成像

从实施例2 中荧光探针母液中取出10 μL加入到育有HeLa细胞的培养皿（含1 mLPBS培养基）中，探针浓度为10μmol/L，孵育30分钟，作为控制组；在其中两组控制组样品中分别加入1 mmol/L和3 mmol/L的甲醛，继续孵育2小时，作为两组实验组。随后分别用共聚焦显微镜对控制组和实验组进行荧光成像，激发光源为汞灯，分别收集蓝色和绿色频道荧光，结果如图7所示。在控制组的荧光成像中，可以观察到蓝色频道有较强荧光，而绿色频道荧光非常微弱；在实验组中，随着加入甲醛浓度的增加，蓝色频道荧光逐渐减弱，同时绿色频道荧光逐渐增强。在比值成像图（绿色荧光/蓝色荧光）可以发现比值信号强度显著增强。实验结果说明探针RFFP可以通过双通道荧光检测细胞环境中的甲醛，具有潜在的实际应用价值。

Claims (6)

1.一种甲醛荧光探针的应用，所述甲醛荧光探针，其分子式为：C₁₄H₁₅NO；其结构式如下:

；

其特征在于，用于检测甲醛。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，用于检测水环境中的甲醛和生物样品的甲醛。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，采用荧光光谱仪，通过甲醛荧光探针的荧光光谱变化来检测水环境中的甲醛；或者，采用共聚焦显微镜，通过观察甲醛荧光探针的荧光成像图的变化来检测生物样品中的甲醛。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，采用荧光光谱仪，激发波长为318 nm；随甲醛浓度的升高，荧光光谱在359 nm处的荧光峰值逐渐降低，同时在451 nm处产生一个新的发射带并且荧光峰值逐渐增强；

或者，采用共聚焦显微镜，激发光源为汞灯，分别收集蓝色和绿色频道荧光；随着甲醛浓度的增加，蓝色频道荧光逐渐减弱，同时绿色频道荧光逐渐增强。

5.一种甲醛荧光探针的制备方法，所述甲醛荧光探针，其分子式为：C₁₄H₁₅NO；其结构式如下:

；

其特征在于，

将6-羟基-2-萘甲醛的甲醇溶液和质量分数为25%的氨水混合，在冰浴条件下搅拌30-60分钟；然后加入烯丙基硼酸频哪醇酯，撤去冰浴，在搅拌条件下反应10小时以上；除去溶剂，得产品。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，除去溶剂采用的方法为减压蒸馏；采用硅胶层析柱对产品进行纯化。