CN109735328A

CN109735328A - 一种检测细胞内硫化氢的荧光探针及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN109735328A
Application number: CN201910145158.0A
Authority: CN
Inventors: 林伟英; 卢雅如; 董宝利; 张楠; 宋文辉
Original assignee: University of Jinan
Current assignee: University of Jinan
Priority date: 2019-02-27
Filing date: 2019-02-27
Publication date: 2019-05-10
Anticipated expiration: 2039-02-27
Also published as: CN109735328B

Abstract

本发明提供了一种检测细胞内硫化氢的荧光探针及其制备方法和应用。所述荧光探针化学结构式为：。可通过4‑乙炔基苯甲腈与4‑溴‑2‑羟基苯甲醛的反应产物与2,4‑二硝基氟苯反应获得。所述荧光探针可通过荧光检测溶液、细胞或生物体中的硫化氢。所述荧光探针可经化学合成获得，合成工艺简单易行，原料廉价易得，制备成本低；具有高特异性，检测过程中不受其他组分的干扰；响应时间短、灵敏度高，具有良好的荧光发射光谱特性，可以实现对细胞内硫化氢的快速准确检测。本发明的探针在研究生物细胞内硫化氢对生理及病理过程的影响具有广阔的应用前景。

Description

一种检测细胞内硫化氢的荧光探针及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一种检测细胞内硫化氢的荧光探针及其应用。

背景技术

硫化氢（H₂S）与一氧化氮（NO）和一氧化碳（CO）被视为生中的重要气体信号分子，H₂S的生物合成主要是在胱硫醚β合成酶（CBS），胱硫醚γ裂解酶（CSE）和3-巯基丙酮酸盐磺基转移酶（3-MST）三种酶的催化下，在心脏，脑，肝和肾脏中由L-半胱氨酸（Cys）产生。研究结果表明，H₂S在调节心肌的生理及病理过程中具有重要的作用，参与血管的舒张、血管的生成、炎症的调节、血压的调节以及神经系统的调节。内源性H₂S能够对氧化应激下的细胞和心脏缺血再灌注的损伤起到保护作用。同时，阿尔茨海默病、唐氏综合症以及糖尿病，肝硬化、心脏病和高血压等多种心血管疾病，也会导致H₂S水平代谢异常。

目前为止，检测H₂S的方法主要包括亚甲基蓝比色法，电化学分析和色谱分析，然而这些技术中很少能够实现生命系统中H₂S水平的非侵入性原位监测。与这些检测技术相比，基于小分子荧光探针的荧光分析法具有灵敏度高、选择性好、响应迅速、操作简单、且能实现实时、无损、高时空分辨检测等优点，已被广泛应于各种生物小分子的检测。基于H₂S的还原性及其主要存在形式HS-的强亲核性，在近些年来开发了许多检测H₂S的荧光探针，反应位点主要包括将叠氮化物或硝基还原为胺，与Cu²⁺形成络合物等。但这些探针大多不具有快速的响应和较好的选择性，因此开发响应迅速，可高特异性检测H₂S的探针具有重要的意义。

发明内容

针对目前缺乏快速响应、选择性好的硫化氢检测探针的问题，本发明提供一种检测细胞内硫化氢的荧光探针，响应速度快、抗干扰能力强。

本发明的另一目的是提供一种上述荧光探针在检测溶液中或生物细胞内硫化氢的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一种检测硫化氢的荧光探针，简称DFAN，其化学结构式如式（I）所示：

式（I）。

上述荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

（1）在氮气保护下，三苯基膦、[1,1-双（二苯基膦基）二茂铁]二氯化钯、碘化亚铜存在下，将4-乙炔基苯甲腈、4-溴-2-羟基苯甲醛于三乙胺中加热回流反应，反应结束后反应液分离纯化得化合物1，

化合物1；

（2）化合物1与2,4-二硝基氟苯在N,N-二异丙基乙胺存在下于二氯甲烷中在室温下搅拌反应，反应结束后反应液分离纯化得荧光探针。

所述4-乙炔基苯甲腈与4-溴-2-羟基苯甲醛的摩尔比为1:1。

步骤（1）中，所述反应温度为90℃。

步骤（1）中，所述分离纯化步骤为：以体积比为5:1的石油醚和乙酸乙酯为淋洗剂，将反应液通过柱层析分离提纯得到化合物1。

所述化合物1与2,4-二硝基氟苯的摩尔比为1：1.15。

步骤（2）中，所述分离纯化步骤为：以体积比为2:1的石油醚和乙酸乙酯为淋洗剂，将反应液通过柱层析分离提纯得到荧光探针。

一种上述荧光探针在检测溶液、细胞或生物体中硫化氢的应用。

本发明的机理如下：

本发明将2,4-二硝基苯基作为识别位点，引入4-[（4-甲酰基-3-羟基苯基）乙炔基]苄腈中作为检测细胞内H₂S的特异性探针，在H₂S存在的环境下，由于邻位的醛基的空间效应，可使荧光探针分子结构中的二硝基苯醚迅速裂解，从而释放出荧光强度明显增强的化合物1，并通过检测荧光信号变化来测定细胞内的H₂S。

本发明具有以下优点：

本发明提供的检测细胞内硫化氢的荧光探针可经化学合成获得，合成工艺简单易行，原料廉价易得，制备成本低。本荧光探针具有高特异性，检测过程中不受其他组分的干扰。本荧光探针的响应时间短、灵敏度高，具有良好的荧光发射光谱特性，可以实现对细胞内硫化氢的快速准确检测。本发明的探针在研究生物细胞内硫化氢对生理及病理过程的影响具有广阔的应用前景。

附图说明

图1是荧光探针的¹H NMR图谱；

图2是荧光探针在不同浓度H₂S条件下的荧光光谱；

图3是荧光探针与H₂S浓度的线性关系；

图4是荧光探针对不同物质的选择性；

图5是荧光探针与Na₂S反应的动力学；

图6是荧光探针在活细胞中的成像应用。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。

实施例1 荧光探针的合成

（1）将4-乙炔基苯甲腈（1 mmol）、4-溴-2-羟基苯甲醛（1 mmol）、三苯基膦（0.02mmol）、[1,1-双（二苯基膦基）二茂铁]二氯化钯（0.02 mmol）溶于三乙胺中，搅拌10 min后将碘化亚铜（0.04 mmol）加入反应体系，在氮气保护下于90℃下加热回流2小时，以石油醚：乙酸乙酯=5：1v/v为淋洗剂通过柱层析分离提纯得到化合物1：；

（2）将化合物1（0.3 mmol）与2,4-二硝基氟苯（0.35 mmol）、N，N-二异丙基乙胺（0.3mmol）溶于10 mL二氯甲烷中，在室温下搅拌反应6小时，以石油醚：乙酸乙酯=2：1v/v为淋洗剂通过柱层析分离提纯得到目标产物，其¹H NMR图谱见图1。

实施例2 荧光探针对不同浓度Na₂S的响应

将实施例1中获得的探针，用乙醇溶解后，用PBS稀释成5 μM探针缓冲溶液（含10%乙醇，pH 7.4）。取22份上述探针溶液，加入Na₂S溶液使其浓度分别为：0，10，20，30，40，50，60，70，80，90，100，120，130，150，170，190，210，230，260，280，290，300 μM，然后进行荧光检测（λ_Ex= 405 nm）；计算各体系中相对荧光强度；该探针对不同浓度Na₂S的响应如图2所示：最大荧光强度峰值为510 nm，随着Na₂S溶液浓度的提高荧光强度逐渐增强。以Na₂S浓度分别为0、10、20、30、40 μM时检测物浓度为横坐标，以510 nm处相对应荧光强度（I_510nm）为纵坐标，得图3，可知I_510nm处的荧光强度与检测物浓度呈线性相关，随着浓度的增大荧光强度增强。

实施例3 荧光探针对不同物质的选择性

将实施例1中获得的探针，用乙醇溶解后，用PBS稀释成5 μM探针缓冲溶液（含10%乙醇，pH 7.4）。取22份体积为4mL的上述探针溶液，分别加入20 μL浓度为40 mM的不同物质的PBS溶液，然后进行荧光扫描（λ_Ex= 405 nm）；计算各体系中相对荧光强度；以510 nm处相对应荧光强度（I_510nm）为纵坐标，得到探针对不同物质的响应柱状图，如图4所示，其中，1-22分别为空白、Al³⁺、 Ba²⁺、Ca²⁺、Co²⁺、Cu²⁺、Cys、F^-、葡萄糖、GSH、H₂O₂、HClO、Hcy、I^-、Mg²⁺、MnO₂、Ni²⁺、Sn²⁺、SO₃ ^2-、VC、Zn²⁺、Na₂S。可知，荧光探针仅对加入Na₂S的溶液有响应，抗干扰性强。

实施例4 荧光探针与Na₂S反应的动力学

将实施例1中获得的探针，用乙醇溶解后，用PBS稀释成5 μM探针缓冲溶液（含10%乙醇，pH 7.4）。取适量上述探针溶液，加入浓度为200 μM 的Na₂S溶液，进行动力学检测（λ_Ex=405 nm），每隔30 s检测一次，检测12.5 min。该探针对Na₂S的动力学响应如图5所示：510nm处的荧光强度以时间依赖性方式逐渐增加，在8 min时荧光信号基本稳定。说明本探针反应迅速，可作为实时检测活细胞中H₂S的荧光探针。

实施例5 荧光探针在活细胞中的成像应用

将3份HepG2细胞放置于含有10%胎牛血清（FBS）和1%抗生素的培养基（DMEM）中，在含5%CO₂的湿润环境下于37 ℃培养48 h。用微量进样器吸取实施例1中制备的荧光探针母液于含有HepG2细胞的培养基中，使探针浓度为10 μM继续在培养箱中培养30 min。之后用PBS冲洗2遍，然后分别与等量的PBS溶液、100 μM硫化钠溶液、200 μM硫化钠溶液一起孵育30min，在激发波长为405 nm下于DAPI、FITC、TRITC通道进行荧光成像，结果如图6所示。活HepG2细胞与DFAN（10μM）一起孵育，观察到相对较弱的绿光，表明没有外源性H₂S刺激，HepG2细胞中H₂S浓度相对较低。在向HepG2细胞添加不同浓度（100 μM和200 μM）的外源Na₂S后，在FITC通道观察到明显的绿光，且随着外源Na₂S浓度的增加荧光强度逐渐增强，表明DFAN能够实现活细胞内外源H₂S的可视化检测。

Claims

1.一种检测硫化氢的荧光探针，其化学结构式如式（I）所示：

式（I）。

2.一种如权利要求1所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）在氮气保护下，三苯基膦、[1,1-双（二苯基膦基）二茂铁]二氯化钯、碘化亚铜存在下，将4-乙炔基苯甲腈、4-溴-2-羟基苯甲醛于三乙胺中加热回流反应，反应结束后反应液分离纯化得化合物1：；

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，4-乙炔基苯甲腈与4-溴-2-羟基苯甲醛的摩尔比为1:1；所述化合物1与2,4-二硝基氟苯的摩尔比为1：1.15。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述反应温度为90℃。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述分离纯化步骤为：以体积比为5:1的石油醚和乙酸乙酯为淋洗剂，将反应液通过柱层析分离提纯得到化合物1；

6.一种如权利要求1所述的荧光探针在检测溶液、细胞或生物体中硫化氢的应用。