CN112094260A - 一种h2s近红外荧光分子探针及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种H₂S近红外荧光分子探针及其制备方法与应用，该荧光探针其结构式如下所示。本发明硫化氢的近红外荧光分子探针，选择性强，灵敏度高，响应效果好，并且其近红外吸收与荧光的发射的特性使其能避免生物自发荧光干扰，很好地运用于活细胞成像等。此外，本发明制备工艺简单，成本低，收率高，具有广阔的应用前景，可以大规模生产应用。

Description

一种H2S近红外荧光分子探针及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于荧光分子探针技术领域，具体涉及一种用于检测H₂S近红外荧光分子探针及其制备方法与应用。

背景技术

硫化氢(H₂S)，具有臭鸡蛋气味。是继NO和CO之后，第三种被发现的气体信号分子。在生物体内的多种生理过程都扮演了重要的角色。大量研究证实，H₂S具有舒张血管平滑肌，调节神经递质，抑制胰岛素信号，调节炎症等作用。生物体内H₂S分子水平的高低，往往会导致一系列疾病，包括阿尔茨海默病、唐氏综合症、糖尿病以及冠心病等。因此使用有效的分子工具来检测内源性H₂S分子水平具有十分重要的意义。

传统检测H₂S的荧光探针多数都是可见光激发，这种探针在与H₂S响应后产生的荧光很容易受到生物体自发荧光的干扰。而近红外荧光分子探针具有灵敏度高，选择性好，组织穿透性强，检测方便等优点，相较于传统H₂S的检测方法具有很大的优势。但是如何得到性能更加优异的近红外荧光分子探针，还需要进一步研究。

发明内容

发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种具有良好的选择性检测H₂S的近红外荧光分子探针，其能对H₂S进行快速荧光响应检测，并且可以成功地进行细胞成像。

本发明还提供了该荧光分子探针的制备方法和应用。

技术方案：为实现上述发明目的，本发明所述一种H₂S近红外荧光分子探针，其分子式为C₃₇H₃₂N₃O₆ ⁺，结构式如下：

本发明所述的H₂S近红外荧光分子探针的制备方法，包括如下步骤：

(1)在惰性气体保护条件下，将化合物1加入到N,N-二甲基甲酰胺中，搅拌，待完全溶解后，加入三乙胺，搅拌；

(2)在惰性气体保护条件下，缓慢加入3，5-二硝基溴苯，搅拌至完全溶解；

(3)在惰性气体保护条件下，继续搅拌加热反应；

(4)反应结束后，萃取，合并有机层，旋干，得到目标探针；

其反应路线如下所示：

所述化合物1的合成参考文献：X.Wu,L.Li,W.Shi,Q.Gong,H.Ma,Near-InfraredFluorescent Probe with New Recognition Moiety for Specific Detection ofTyrosinase Activity:Design,Synthesis,and Application in Living Cells andZebrafish,Angew Chem Int Ed Engl,55(2016)14728-32.

作为优选，所述惰性气体选自氮气。

其中，步骤(1)所述化合物1与N,N-二甲基甲酰胺的比例为1mmol：10-15mL。

其中，步骤(1)所述化合物1、三乙胺与步骤(2)所述3，5-二硝基溴苯的摩尔比1:(2-4):(2-4)。

其中，步骤(3)所述搅拌加热至80-90℃进行反应，反应直到溶液变深蓝色。通常反应8-10h即可。

作为优选，步骤(4)所述萃取的方法为：反应液中加入二氯甲烷和蒸馏水，混匀，震荡，静置，取下层有机溶液层，重复3-4次，合并有机层。

本发明所述的H₂S近红外荧光分子探针在检测H₂S中的应用。尤其是在定量检测H₂S中。

本发明所述的H₂S近红外荧光分子探针在体外紫外荧光响应和细胞成像中的应用。

本发明的荧光分子探针可以制备成用于体外紫外荧光响应和细胞成像的工具或者试剂。尤其是活体细胞的成像中的应用。

本发明荧光分子的结构为R-DNBr，其中R基(化合物1)为近红外荧光团，能被近红外光激发并发出波长更长的荧光。DNBr(3，5-二硝基溴苯)作为强吸电子基团，当其与近红外荧光团R基链接后，由于光诱导电子转移效应，DNBr会使荧光团R基的荧光被淬灭，而DNBr基被H₂S分子进攻后，生成的给电子基羟基会使荧光团R基的荧光恢复。与H₂S响应前后的荧光变化使其可以实时监测检测H₂S分子。并且，荧光分子探针的近红外特性可以使得检测的深度以及分辨率得到提高。通过良好的细胞成像效果，可以看到该探针应用于临床之中的潜力。

本发明检测H₂S近红外荧光分子探针具有以下优势：

第一、本发明以DNBr基团作为响应基团检测H₂S具有非常优异的选择性。

第二、本发明的近红外荧光探针吸收和发射均在近红外区具有较强的生物体穿透性，还能减少生物体自发荧光的干扰。

第三、本发明的近红外荧光探针具有较小的生物毒性。

第四、本发明的近红外荧光探针具有良好的细胞成像效果。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：

本发明提供了一种全新结构的近红外荧光分子探针，对于H₂S的选择性好，灵敏度高，响应时间短，重复性好，并且其细胞毒性低，生物相容性好，细胞渗透能力强，近红外吸收与荧光的发射的特性使其极大的避免了生物体自发荧光的干扰，能很好的运用于细胞成像等。此外，本发明合成工艺简单，原料易得，成本低，收率高可以达到65％。

附图说明

图1是本发明近红外荧光探针的质谱、核磁氢谱表征(氘代甲醇)。

图2是本发明近红外荧光探针与H₂S响应的紫外和荧光响应。

图3是本发明近红外荧光探针的选择性实验数据图。

图4是本发明近红外荧光探针的MTT实验数据图。

图5是本发明近红外荧光探针的共聚焦显微镜细胞成像图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

本发明中使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。实验所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中所选用的以下所有试剂皆为市售分析纯或化学纯。

实施例1

检测硫化氢近红外荧光探针的制备：

将化合物1(1mmol)加入到圆底烧瓶中，在氮气保护下缓慢加入N,N-二甲基甲酰胺(12mL)，搅拌完全溶解，在氮气保护的条件下加入三乙胺(3mmol)，继续搅拌10min，在氮气保护下缓慢加入3，5-二硝基溴苯3mmol)，搅拌完全溶解。上述体系在油浴锅中，搅拌加热至85℃，反应8小时，待溶液变深蓝色，冷却体系，将瓶中反应液倒入分液漏斗中加入二氯甲烷和蒸馏水，充分震荡，静置分液漏斗，待分液漏斗中溶液分层之后，取下层有机层。重复上述操作三次，合并有机层。将得到的溶液旋干得深蓝色固体，即为目标探针(NRh-DNBr)，收率65％。

实施例1制备的探针质谱以及核磁氢谱如图1所示，¹H NMR(400MHz,MeOD)δ8.97(d,J＝2.8Hz,1H),8.89(d,J＝15.3Hz,1H),8.54(dd,J＝9.2,2.8Hz,1H),8.36(d,J＝8.5Hz,1H),8.18(d,J＝8.9Hz,1H),8.11(d,J＝8.2Hz,1H),7.86(d,J＝8.9Hz,1H),7.77–7.72(m,1H),7.63(dd,J＝14.8,7.8Hz,2H),7.44(dd,J＝11.4,5.7Hz,2H),7.32(s,1H),7.16–7.12(m,1H),6.72(d,J＝15.3Hz,1H),4.62(q,J＝7.2Hz,2H),2.82(dt,J＝12.2,5.9Hz,4H),2.08(s,6H),2.02–1.98(m,2H),1.59(t,J＝7.3Hz,3H).[M⁺]614.3。说明本发明的荧光探针成功合成。

实施例2

近红外荧光探针与H₂S体外响应紫外和荧光响应实验：

称取6.12mg(10μmol)实施例1制备的探针(NRh-DNBR)溶于1mL DMSO，配置成10mM探针母液。称取5.6mg NaHS溶于1mL水，配置成100mM NaHS母液。从10mM探针母液中吸取3μL加入到装有3mL的PBS缓冲液(pH＝7.4)的比色皿中，此时探针浓度为10μM。在比色皿中，加入NaHS(终浓度0-200μM)进行紫外和荧光响应实验(激发光波长为680nm)，所得数据经origin软件处理得图2，如图所示，探针在加入NaHS前的紫外最大吸收在680nm处，732nm处的荧光发射很低。在滴加NaHS之后，680nm处的紫外峰降低，716nm处的紫外吸收峰逐渐升高，而732nm处的荧光发射极大的增强，结果表明探针与H₂S具有良好的响应效果，如图2计算，检测限为23nM，检测范围0-10μM。

此外，探针的近红外荧光的发射波长在732nm，组织穿透能力强，在近红外通道的成像时可以有效地避免生物体自发荧光的干扰。

实施例3

选择性实验：

用DMSO制备实施例1制备的NRh-DNBR探针(1mM)和底物(100mM)。从每个100mM的底物溶液中分别取30μL，分别加入到12个装有的2940μL PBS缓冲液(pH＝7.4)的离心管中混合。然后从1mM的探针溶液中取30μL，分别加入到每个底物溶液中。待测底物为NaNO₂、NaHCO₃、H₂O₂、Cys、Hcy、GSH、Vc、Va、Na₂SO₄、Na₂SO₃、Na₂S₂O₃、NaHS。用四色皿测定荧光发射光谱。结果如图3所示，只有NaHS组显示出了强烈的荧光信号，即本发明的荧光探针对H₂S有很好的选择性。

实施例4

近红外荧光探针与A549细胞进行MTT实验：

在96孔板的外围一圈加入PBS缓冲液(pH＝7.4)，在剩余内部孔中铺满A549细胞，37℃下培养12小时。称取6.12mg实施例1制备的探针溶于1mL生物用DMSO溶液，配置成10mM生物用探针母液。配置5mg/mL MTT溶液，准备5个5mL的离心管，均加入3mL DMEM培养基，依次在离心管中加入0、4.5、9、13.5、18μL生物用探针母液。将5个离心管中溶液吸取190μL依次每一横排等浓度加入5排孔中孵育24h后，在每个孔中加入10μL MTT溶液。37℃继续孵育3小时，倒掉培养基，在每个孔中均加入100μL DMSO溶液。待充分溶解后，进行检测(检测波长为490nm)。用origin进行数据处理得图4，如图所示，在探针浓度达到60μM(18μL生物用探针母液)，细胞仍有80％以上的存活率，表明探针的生物适用性较好，细胞毒性小。

实施例5

近红外荧光探针与硫化氢响应的共聚焦显微镜细胞实验：

在两个共聚焦皿中铺适当浓度的A549细胞，培养至细胞状态优良，将共聚焦皿中培养基吸取干净。配置100mM NaHS溶液，吸取实施例4中生物用探针母液2μL加入2mLDMEM培养基中充分混匀，并吸取1mL分别加入两个共聚焦皿中，37℃孵育10分钟后，在其中一个皿中加入2μL NaHS溶液，37℃继续孵育20分钟后，倒掉培养基。用多聚甲醛溶液固定10分钟后，加入DAPI染色液分别进行染色5分钟，PBS缓冲液(pH＝7.4)冲洗3次加入多聚甲醛溶液继续固定保存。共聚焦显微镜拍摄图片如图5，如图所示，不加NaHS组近红外通道没有荧光信号，而添加了NaHS的一组表现出了强烈的荧光信号，表明探针在细胞中能有很好的细胞成像效果。

实施例6

实施例6与实施例1的制备方法相同，化合物1与N,N-二甲基甲酰胺的比例为1mmol：10mL。化合物1、三乙胺、3，5-二硝基溴苯的摩尔比1:2:2。搅拌加热至80℃进行反应10h，反应直到溶液变深蓝色。

实施例7

实施例7与实施例1的制备方法相同，化合物1与N,N-二甲基甲酰胺的比例为1mmol：15mL。化合物1、三乙胺、3，5-二硝基溴苯的摩尔比14:4。搅拌加热至90℃进行反应8h，反应直到溶液变深蓝色。

Claims (10)

1.一种H₂S近红外荧光分子探针，其特征在于，其结构式如下：

2.一种权利要求1所述的H₂S近红外荧光分子探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)在惰性气体保护条件下，将化合物1加入到N,N-二甲基甲酰胺中，搅拌，待完全溶解后，加入三乙胺，搅拌；

(2)在惰性气体保护条件下，继续加入3，5-二硝基溴苯，搅拌；

(3)在惰性气体保护条件下，继续搅拌加热反应；

(4)步骤(3)反应结束后，萃取，合并有机层，旋干，得到目标探针；

其反应路线如下所示：

3.根据权利要求2所述的H₂S近红外荧光分子探针的制备方法，其特征在于，所述惰性气体选自氮气。

4.根据权利要求2所述的H₂S近红外荧光分子探针的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述化合物1与N,N-二甲基甲酰胺的比例为1mmol：10-15mL。

5.根据权利要求2所述的H₂S近红外荧光分子探针的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述化合物1、三乙胺与步骤(2)所述3，5-二硝基溴苯的优选摩尔比1：(2-4)：(2-4)。

6.根据权利要求2所述的H₂S近红外荧光分子探针的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述搅拌加热至80-90℃进行反应，反应直到溶液变深蓝色。

7.根据权利要求2所述的H₂S近红外荧光分子探针的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述萃取的方法为：反应液中加入二氯甲烷和蒸馏水，混匀，震荡，静置，取下层有机溶液层，重复3-4次，合并有机层。

8.一种权利要求1所述的H₂S近红外荧光分子探针在检测H₂S中的应用。

9.一种权利要求1所述的H₂S近红外荧光分子探针在体外紫外荧光响应和细胞成像中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述细胞成像为活体细胞成像。

Images