CN114621248A - 识别rna和具有光动力的荧光探针及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了识别RNA和具有光动力的荧光探针及其制备方法。该荧光探针的结构通式如式(Ⅰ)所示。其制备方法包括以下步骤：1)将噻吩并[3,2‑b]噻吩、N,N‑二甲基甲酰胺和三氯氧磷反应得到淡黄色固体；然后将淡黄色固体与N‑溴代琥珀酰亚胺反应得到中间体1；2)将中间体1与(9‑苯基‑9H‑咔唑‑2‑基)硼酸反应，四(三苯基膦)钯为催化剂，得到中间体2；3)将4‑甲基吡啶与碘丙烷反应得到中间体3；4)将中间体2与中间体3反应，哌啶为催化剂，得荧光探针。本发明的荧光探针具有良好的光学性能和生物相容性，对RNA表现出高选择性，并且活性氧产生效率高，在细胞荧光成像和光动力治疗方面具有广阔的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于荧光探针技术领域，特别涉及一种识别RNA和具有光动力的荧光探针及其制备方法。
背景技术
利用靶向特异性分子荧光探针对活细胞进行荧光成像是医学诊断和生物医学研究中的一种重要技术。RNA作为存在于生物细胞以及病毒中的遗传信息的载体，在遗传信息的传递、表达和蛋白质的合成过程中起到重要作用。然而，有关RNA在细胞中的分布动力学，转录活性以及与特殊二级结构DNA的关系的信息有限。因此，研究特异性识别RNA的荧光探针进行荧光成像对于理解细胞的生理行为具有重大的意义。
然而，现存的许多用于识别RNA的荧光探针存在一些问题，包括光学性能差、选择性差、细胞毒性高、膜穿透性能差等，这些缺陷很大程度上限制了荧光探针的应用。如中国发明专利申请CN 106147752 A公开了一种识别RNA以及应用在细胞成像中的荧光探针。该发明将甲基化的4-氯-2-甲基喹啉、甲基化的2-甲基苯并噻唑和4-甲硫基苯甲醛反应得到荧光探针。但是荧光探针的斯托克位移小，荧光发射峰在525nm附近，远离近红外区，容易受到背景光的干扰，不利于用于成像。
癌症已成为人类面临的重大疾病之一。传统治疗癌症的方法包括手术切除，化学疗法和放射疗法，但是这些方法对人体具有较大的损伤和副作用。因此，研究无创的、副作用小的肿瘤治疗方法成为科研人员的重要目标。光动力治疗是利用光敏剂在经过光照后产生活性氧，引发细胞凋亡，从而治疗肿瘤。与传统治疗方法相比，光动力治疗具有无创，治疗可控，不会产生耐药性，副作用小的特点，在肿瘤治疗方面具有较大的应用前景。
目前使用的小分子有机光敏剂仍然存在一些问题，包括生物相容性差、易团聚、活性氧产生效率低以及缺乏靶向性等，导致这些光敏剂的光动力治疗效果并不理想。如中国发明专利申请CN 111777615 A公开了一种检测环氧合酶2的光动力治疗探针。该发明将柔性丁烷与双光子萘酰胺荧光团连接，并且引入Ce6光敏剂用于光动力治疗。但是Ce6活性氧产生效率低，不稳定，易氧化，缺乏靶向性，不利于用于光动力治疗。
中国发明专利申请CN201910402473.7公开了一种具有线粒体RNA靶向功能的三光子荧光探针及其制备方法和用途，其结构式如下：
但是该技术探针对RNA的响应性不够强，当RNA浓度从0增加到60mM时，荧光强度仅增加了约2.5倍。
中国发明专利申请CN202110360952.4公开了一种RNA荧光探针及其制备方法和应用，其结构式如下：
其中，R1＝-H、-CH3O、-N(CH2CH3)2、-NCH2COOH或
R2＝-NH2或-OH。
但是该技术探针对RNA的响应性不够强，当RNA浓度从0增加到150mg/mL时，荧光强度仅增加了约3倍；并且该技术探针的斯托克位移小，只有约70nm，在细胞中成像的荧光强度低，明显低于SYTO RNASelect成像的荧光强度，不利于在生物细胞中的应用。
发明内容
本发明的目的在于针对现有RNA荧光探针选择性低、膜穿透性能差、光学性能和生物相容性差的问题，提供一种同时具有高效活性氧产生效率的识别RNA和具有光动力的荧光探针及其制备方法。
为了实现以上目的，本发明通过以下技术方案实现：
识别RNA和具有光动力的荧光探针，其结构通式如式(Ⅰ)：
所述的识别RNA和具有光动力的荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
(1)制备中间体1
将噻吩并[3,2-b]噻吩和N,N-二甲基甲酰胺加入到二氯甲烷或者二氯乙烷中，氮气保护下，冷却到-5～5℃，滴加三氯氧磷，升温回流反应过夜，终止反应，萃取，有机层干燥并浓缩得到粗产物，纯化得到淡黄色固体；
将淡黄色固体和N-溴代琥珀酰亚胺加入到N,N-二甲基甲酰胺和乙酸的混合溶液中，氮气保护下，110～120℃反应过夜，待反应结束后，加水稀释，萃取，有机层干燥并浓缩得到粗产物，纯化得到中间体1；
(2)制备中间体2
将中间体1、(9-苯基-9H-咔唑-2-基)硼酸和碳酸钾水溶液加入到四氢呋喃或者甲苯中，以四(三苯基膦)钯为催化剂，氮气保护下，80～90℃反应过夜，待反应结束后，加入水稀释，萃取，有机层干燥并浓缩得到粗产物，纯化得到中间体2；
(3)制备中间体3
将4-甲基吡啶与碘丙烷加入到二氯甲烷、正己烷或者乙醇中，回流反应过夜，待反应结束后，旋干溶剂，重结晶得到中间体3；
(4)制备荧光探针
将中间体2与中间体3溶于二氯甲烷或者乙醇，以哌啶为催化剂，回流反应过夜，待反应结束后，浓缩，经柱层析法和重结晶得到所述识别RNA和具有光动力的荧光探针。
为进一步实现本发明目的，优选地，所述的噻吩并[3,2-b]噻吩和N,N-二甲基甲酰胺的摩尔比为1∶10～20；所述的淡黄色固体和N-溴代琥珀酰亚胺的摩尔比为1∶1.2～1.5；所述的中间体1和(9-苯基-9H-咔唑-2-基)硼酸的摩尔比为1∶1.2～1.5；所述的4-甲基吡啶与碘丙烷的摩尔比为1∶3～5；所述的中间体2与中间体3的摩尔比为1∶1.2～1.5。
优选地，步骤(1)中，所述的终止反应通过加入饱和碳酸氢钠水溶液实现；所述的二氯甲烷或者二氯乙烷的用量为每mmol噻吩并[3,2-b]噻吩加入2～4mL；所述的N,N-二甲基甲酰胺和乙酸的体积比为1～4∶1；所述的N,N-二甲基甲酰胺的用量为每mmol N-溴代琥珀酰亚胺加入2～4mL；所述的乙酸的用量为每mmol N-溴代琥珀酰亚胺加入1～2mL。
优选地，步骤(1)和步骤(2)中，所述的萃取都是为二氯甲烷萃取；所述的干燥都是经过无水硫酸钠干燥；所述的纯化都是经柱层析法纯化；步骤(1)中，所述的加水稀释是每mmol N-溴代琥珀酰亚胺加入5～10mL水稀释；步骤(2)中，所述的加水稀释是每mmol中间体1加入20～50mL水稀释。
优选地，步骤(1)中柱层析法分离淡黄色固体时的洗脱液为正己烷与二氯甲烷混合液；正己烷与二氯甲烷的体积比1～5∶1；
柱层析法分离得到中间体1的洗脱液为正己烷与乙酸乙酯的混合液，正己烷与乙酸乙酯的体积比为5～10∶1；
步骤(2)中柱层析法纯化时的洗脱液为正己烷与二氯甲烷混合液，正己烷与二氯甲烷的体积比为1～5∶1。
优选地，步骤(2)中，所述的碳酸钾水溶液的浓度为1～2mol/L，用量为每mmol中间体1加入5～10mL；所述的四氢呋喃或者甲苯的用量为每mmol中间体1加入20～25mL；所述的四(三苯基膦)钯的用量每mmol中间体1加入25～50mg。
优选地，步骤(3)中，重结晶的溶剂为正己烷或者乙醚；所述的二氯甲烷、正己烷或者乙醇的用量每mmol 4-甲基吡啶加入2～4mL。
优选地，步骤(4)中，柱层析法纯化时的洗脱液为正己烷与乙醇混合液，正己烷与乙醇的体积比为20～50∶1；重结晶的溶剂为正己烷或者乙醚。
优选地，步骤(4)中，所述的二氯甲烷或者乙醇的用量为每mmol中间体2加入20～40mL；所述的哌啶的用量为每mmol中间体2加入4～8滴。
本发明识别RNA和具有光动力的荧光探针具有良好的光学性能和生物相容性，对RNA表现出高选择性，并且活性氧产生效率高，可用于荧光成像或在光动力治疗。
相对于现有技术，本发明具有如下本优点及有益效果：
本发明设计的合成步骤简易，反应容易进行，产物处理过程简单，易于操作。通过引入鎓盐结构，增加了探针对RNA的选择性，苯基咔唑结构和噻吩并噻吩结构改进了探针的光学性能，使得该探针对RNA表现出高选择性，应用到细胞荧光成像中表现出良好的成像效果。同时该荧光探针活性氧产生效率高，能够应用到肿瘤的光动力治疗中。
附图说明
图1为本发明荧光探针制备方法的合成路线图。
图2为实施例1所得荧光探针在不同溶剂中的吸收光谱。
图3为实施例1所得荧光探针在不同溶剂中的荧光光谱。
图4为实施例1所得荧光探针对生物大分子的选择性。
图5为实施例1所得荧光探针的荧光强度随不同RNA浓度的变化。
图6为实施例1所得荧光探针的细胞荧光成像。
图7为实施例1所得荧光探针产生活性氧性能测试。
具体实施方式
为更好地理解本发明，下面结合实施例及附图对本发明作进一步的描述，但发明的实施方式不限于此。除非特殊说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本领域常规试剂、方法和设备。
本发明实施例中，核磁谱采用核磁共振仪(Bruker AvanceⅢ500MHz(600MHz))测试，使用溶剂为氘代氯仿和氘代二甲基亚砜。质谱使用超高压液相色谱-高分辨质谱联用仪(Agilent1290/Bruker maXis impact)测定。紫外光谱使用紫外分光光度计(Shimadzu UV-2450)测定，荧光光谱使用分子荧光仪(Hitachi F-7000)和荧光分光光度计(ThermoScientific Lumina)测定。细胞荧光成像图使用激光共聚焦荧光显微镜(LSM 880withAiryscan)和荧光倒置显微镜(Axio Observer)拍摄。
实施例1
一种识别RNA和具有光动力的荧光探针的制备方法，合成路线如图1所示，具体合成步骤如下：
(1)制备中间体1
将10mmol，1.40g噻吩并[3,2-b]噻吩和10mL N,N-二甲基甲酰胺加入到20mL二氯甲烷中，氮气保护下，冷却到0℃，缓慢滴加3mL三氯氧磷，升温回流反应过夜，加入饱和碳酸氢钠水溶液终止反应，二氯甲烷萃取三次，有机层经过无水硫酸钠干燥并浓缩得到粗产物，以正己烷∶二氯甲烷＝1∶1，v/v为洗脱剂，经柱层析法纯化得到淡黄色固体1.55g，产率为92.3％。
将8.2mmol，1.38g淡黄色固体和10mmol，1.78g N-溴代琥珀酰亚胺加入到30mL N,N-二甲基甲酰胺和15mL乙酸的混合溶液中，氮气保护下，120℃反应过夜，待反应结束后，加50mL水稀释，二氯甲烷萃取，有机层经过无水硫酸钠干燥并浓缩得到粗产物，以正己烷∶乙酸乙酯＝10∶1，v/v为洗脱剂，经柱层析法纯化得到0.52g中间体1，产率为25.7％。
(2)制备中间体2
将0.42g，1.7mmol中间体1与0.52g，1.8mmol(9-苯基-9H-咔唑-2-基)硼酸加入到35mL四氢呋喃中，加入1mol/L碳酸钾水溶液15mL，50mg四(三苯基膦)钯为催化剂，氮气保护下，90℃反应过夜，待反应结束后，加50mL水稀释，二氯甲烷萃取，有机层经无水硫酸钠干燥并浓缩得到粗产物，以正己烷∶二氯甲烷＝1∶1，v/v为洗脱液，经柱层析法纯化得到0.64g中间体2，产率为92.0％。
(3)制备中间体3
将15mmol，1.40g 4-甲基吡啶与5mL碘丙烷加入到50mL二氯甲烷中，回流反应过夜，待反应结束后，旋干溶剂，经过重结晶得到2.30g中间体3，产率为58.3％。
(4)制备荧光探针
将1.3mmol，0.532g中间体2与1.5mmol，0.395g中间体3溶于30mL乙醇，加入5滴哌啶为催化剂，回流反应过夜，待反应结束后，浓缩，以正己烷∶乙醇＝50∶1，v/v为洗脱液，柱层析法分离，然后用正己烷重结晶得到深红色固体0.498g，结构式如式(Ⅰ)所示，产率为58.5％。
实施例2
一种识别RNA和具有光动力的荧光探针的制备方法，合成路线如图1所示，具体合成步骤如下：
(1)制备中间体1
将12mmol，1.68g噻吩并[3,2-b]噻吩和10mL N,N-二甲基甲酰胺加入到40mL二氯甲烷中，氮气保护下，冷却到0℃，缓慢滴加3mL三氯氧磷，升温回流反应过夜，加入饱和碳酸氢钠水溶液终止反应，二氯甲烷萃取三次，有机层经过无水硫酸钠干燥并浓缩得到粗产物，以正己烷∶二氯甲烷＝2∶1，v/v为洗脱剂，经柱层析法纯化得到淡黄色固体1.73g，产率为85.8％。
将8.5mmol，1.43g淡黄色固体和12mmol，2.14g N-溴代琥珀酰亚胺加入到25mL N,N-二甲基甲酰胺和20mL乙酸的混合溶液中，氮气保护下，110℃反应过夜，待反应结束后，加60mL水稀释，二氯甲烷萃取，有机层经过无水硫酸钠干燥并浓缩得到粗产物，以正己烷∶乙酸乙酯＝10∶1，v/v为洗脱剂，经柱层析法纯化得到0.88g中间体1，产率为41.9％。
(2)制备中间体2
将0.49g，2mmol中间体1与0.86g，3mmol(9-苯基-9H-咔唑-2-基)硼酸加入到40mL四氢呋喃中，加入1mol/L碳酸钾水溶液10mL，80mg四(三苯基膦)钯为催化剂，氮气保护下，80℃反应过夜，待反应结束后，加70mL水稀释，二氯甲烷萃取，有机层经无水硫酸钠干燥并浓缩得到粗产物，以正己烷∶二氯甲烷＝5∶1，v/v为洗脱液，经柱层析法纯化得到0.71g中间体2，产率为86.7％。
(3)制备中间体3
将15mmol，1.40g 4-甲基吡啶与5mL碘丙烷加入到40mL正己烷中，回流反应过夜，待反应结束后，旋干溶剂，经过重结晶得到2.45g中间体3，产率为62.1％。
(4)制备荧光探针
将1.3mmol，0.532g中间体2与1.6mmol，0.42g中间体3溶于40mL二氯甲烷，加入8滴哌啶为催化剂，回流反应过夜，待反应结束后，浓缩，以正己烷∶乙醇＝50∶1，v/v为洗脱液，柱层析法分离，然后用乙醚重结晶得到深红色固体0.53g，结构式如式(Ⅰ)所示，产率为62.3％。
实施例3
一种识别RNA和具有光动力的荧光探针的制备方法，合成路线如图1所示，具体合成步骤如下：
(1)制备中间体1
将10mmol，1.40g噻吩并[3,2-b]噻吩和12mL N,N-二甲基甲酰胺加入到30mL二氯乙烷中，氮气保护下，冷却到-5℃，缓慢滴加3mL三氯氧磷，升温回流反应过夜，加入饱和碳酸氢钠水溶液终止反应，二氯甲烷萃取三次，有机层经过无水硫酸钠干燥并浓缩得到粗产物，以正己烷∶二氯甲烷＝5∶1，v/v为洗脱剂，经柱层析法纯化得到淡黄色固体1.49g，产率为88.7％。
将7mmol，1.18g淡黄色固体和10mmol，1.78g N-溴代琥珀酰亚胺加入到40mL N,N-二甲基甲酰胺和10mL乙酸的混合溶液中，氮气保护下，110℃反应过夜，待反应结束后，加100mL水稀释，二氯甲烷萃取，有机层经过无水硫酸钠干燥并浓缩得到粗产物，以正己烷∶乙酸乙酯＝5∶1，v/v为洗脱剂，经柱层析法纯化得到0.95g中间体1，产率为54.9％。
(2)制备中间体2
将0.49g，2mmol中间体1与0.72g，2.5mmol(9-苯基-9H-咔唑-2-基)硼酸加入到50mL四氢呋喃中，加入2mol/L碳酸钾水溶液10mL，100mg四(三苯基膦)钯为催化剂，氮气保护下，90℃反应过夜，待反应结束后，加100mL水稀释，二氯甲烷萃取，有机层经无水硫酸钠干燥并浓缩得到粗产物，以正己烷∶二氯甲烷＝2∶1，v/v为洗脱液，经柱层析法纯化得到0.73g中间体2，产率为89.1％。
(3)制备中间体3
将15mmol，1.40g 4-甲基吡啶与5mL碘丙烷加入到30mL乙醇中，回流反应过夜，待反应结束后，旋干溶剂，经过重结晶得到2.13g中间体3，产率为54.0％。
(4)制备荧光探针
将1.3mmol，0.532g中间体2与1.9mmol，0.50g中间体3溶于50mL乙醇，加入10滴哌啶为催化剂，回流反应过夜，待反应结束后，浓缩，以正己烷∶乙醇＝30∶1，v/v为洗脱液，柱层析法分离，然后用正己烷重结晶得到深红色固体0.57g，结构式如式(Ⅰ)所示，产率为67.0％。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.88(d,J＝6.9Hz,2H),8.35–8.25(m,3H),8.20(d,J＝6.9Hz,2H),8.00(s,1H),7.81(s,1H),7.78–7.72(m,2H),7.72–7.66(m,3H),7.64–7.58(m,2H),7.47(ddd,J＝8.2,7.2,1.2Hz,1H),7.37(d,J＝8.2Hz,1H),7.35–7.30(m,1H),7.14(d,J＝15.9Hz,1H),4.42(t,J＝7.3Hz,2H),1.92(q,J＝7.3Hz,2H),0.89(t,J＝7.3Hz,3H)。13CNMR(151MHz,DMSO-d6)δ152.88,149.89,144.41,142.76,142.53,141.52,141.09,138.91,136.95,135.24,132.12,130.85,128.50,127.38,127.28,125.61,123.81,123.51,122.84,121.99,121.91,121.26,120.98,118.60,117.30,110.23,106.58,61.37,24.40,10.74。HRMS(ESI):calcd for C34H27N2S2+[M-I]+527.1610,found,527.1620。
荧光探针在不同溶剂中的光谱性质如图2、3所示。如图2所示，在PBS缓冲溶液中，荧光探针的紫外吸收峰在430nm。在图3中，荧光探针在PBS缓冲溶液中的荧光发射峰在700nm，在其他溶剂中，发射峰在650nm附近。相比于中国发明专利申请CN 106147752 A，本发明的荧光探针具有更大的斯托克位移，发射峰接近近红外区，不易受到背景光的影响，在应用于生物成像方面具有较大的优势。
如图6所示，荧光探针能够迅速的进入细胞，被标记的细胞呈现出正常的生理状态，表明荧光探针具有良好的生物相容性。相比于中国发明专利申请CN 106147752 A中公开的荧光探针在细胞中发出绿色荧光信号，本发明的荧光探针在细胞中发出红色荧光信号，受到背景荧光的影响小，成像效果会更好。
荧光探针对RNA的选择性结果如图4所示，在相同浓度的DNA、BSA和RNA溶液中，探针对RNA表现出更强的选择性，其荧光强度是DNA的14.5倍，BSA的6.3倍。探针对RNA的荧光响应效应如图5所示，随着RNA浓度的增加，探针溶液的荧光强度也不断增加，在RNA浓度是探针质量100倍时，探针溶液的荧光强度增加了41.6倍。这些结果表明，荧光探针对RNA具有较高的选择性。
如图7所示，光照120s后，混合溶液在380nm处的紫外吸收峰基本消失，而中国发明专利申请CN 111777615 A中公布的荧光探针通过分解产生Ce6当光照Ce6和ABDA的混合溶液时，则需要光照300s紫外吸收峰才基本消失，这表明本发明的荧光探针产生活性氧的效率更高，能够作为光敏剂应用到光动力治疗中。
实施例4荧光探针在不同溶剂中的光谱性质
取制备的荧光探针6.5mg溶于DMSO中，配置成浓度为1mM的母液。取100μL母液于10mL容量瓶中，分别用DMSO、乙醇、四氢呋喃、PBS缓冲溶液和二氯甲烷滴定至刻度处，配置成浓度为10μM的不同溶剂的探针溶液。静置30min后，在室温环境中测试荧光探针的紫外和荧光光谱。
实施例5荧光探针对RNA的选择性
取实施例1制备的荧光探针6.5mg溶于DMSO中，配置成浓度为1mM的母液。配置5mg/mL的DNA和BSA的PBS溶液，配置1mg/mL的RNA的PBS溶液。取100μL母液于10mL容量瓶中，分别加入1.3mL的DNA溶液，1.3mL的BSA溶液和6.5mL的RNA溶液，然后用PBS缓冲溶液滴定至刻度处，配置成100倍探针质量的DNA、BSA和RNA溶液，其中探针浓度为10μM。静置2小时后，在室温环境中测试探针对DNA、BSA和RNA的选择性。
分别配置0、10、20、30、40、50、60、70、80、90和100倍探针质量的RNA溶液，超声处理2小时后，在室温环境中测试探针的荧光强度随RNA浓度变化的关系。
实施例6荧光探针的细胞荧光成像
取1mL含有约1*104个4T1细胞的细胞悬液加入到共聚焦皿中，37℃、5％CO2的环境下培养24小时。吸出培养基，PBS洗涤，加入1mL10μM的含探针培养基，培养2小时后，吸出含探针培养基，PBS洗涤。加入含有绿色线粒体荧光探针的培养基培育30分钟，吸出培养基，PBS洗涤，加入多聚甲醛固定，然后将共聚焦皿置于激光共聚焦显微镜下观察成像情况。
实施例7荧光探针产生活性氧性能测试
为检测荧光探针在光照下活性氧产生情况，可使用9,10-蒽基-双(亚甲基)二丙二酸(ABDA)作为检测试剂。光照下探针产生的活性氧会与ABDA反应，使得ABDA在380nm处的紫外吸收峰下降，因此可以通过检测ABDA在380nm处紫外吸收峰的变化来评估探针的活性氧产生效率。配置探针浓度为10μM，ABDA浓度为100μM的混合水溶液，以10μM的探针水溶液为基线，检测不同光照时间下混合溶液在380nm处的紫外吸收峰。
综上，本发明合成的一种识别RNA和具有光动力的荧光探针具有良好的光学性能和生物相容性，对RNA具有较高的选择性以及活性氧产生效率高，可应用于细胞荧光成像，并且在肿瘤的光动力治疗方面具有极大的应用潜能。
本发明不受上诉实施例的约束，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.识别RNA和具有光动力的荧光探针，其特征在于，其结构通式如式(Ⅰ)：
2.权利要求1所述的识别RNA和具有光动力的荧光探针的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)制备中间体1
将噻吩并[3,2-b]噻吩和N,N-二甲基甲酰胺加入到二氯甲烷或者二氯乙烷中，氮气保护下，冷却到-5～5℃，滴加三氯氧磷，升温回流反应过夜，终止反应，萃取，有机层干燥并浓缩得到粗产物，纯化得到淡黄色固体；
将淡黄色固体和N-溴代琥珀酰亚胺加入到N,N-二甲基甲酰胺和乙酸的混合溶液中，氮气保护下，110～120℃反应过夜，待反应结束后，加水稀释，萃取，有机层干燥并浓缩得到粗产物，纯化得到中间体1；
(2)制备中间体2
将中间体1、(9-苯基-9H-咔唑-2-基)硼酸和碳酸钾水溶液加入到四氢呋喃或者甲苯中，以四(三苯基膦)钯为催化剂，氮气保护下，80～90℃反应过夜，待反应结束后，加入水稀释，萃取，有机层干燥并浓缩得到粗产物，纯化得到中间体2；
(3)制备中间体3
将4-甲基吡啶与碘丙烷加入到二氯甲烷、正己烷或者乙醇中，回流反应过夜，待反应结束后，旋干溶剂，重结晶得到中间体3；
(4)制备荧光探针
将中间体2与中间体3溶于二氯甲烷或者乙醇，以哌啶为催化剂，回流反应过夜，待反应结束后，浓缩，经柱层析法和重结晶得到所述识别RNA和具有光动力的荧光探针。
3.根据权利要求2所述的识别RNA和具有光动力的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述的噻吩并[3,2-b]噻吩和N,N-二甲基甲酰胺的摩尔比为1∶10～20；所述的淡黄色固体和N-溴代琥珀酰亚胺的摩尔比为1∶1.2～1.5；所述的中间体1和(9-苯基-9H-咔唑-2-基)硼酸的摩尔比为1∶1.2～1.5；所述的4-甲基吡啶与碘丙烷的摩尔比为1∶3～5；所述的中间体2与中间体3的摩尔比为1∶1.2～1.5。
4.根据权利要求2所述的识别RNA和具有光动力的荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的终止反应通过加入饱和碳酸氢钠水溶液实现；所述的二氯甲烷或者二氯乙烷的用量为每mmol噻吩并[3,2-b]噻吩加入2～4mL；所述的N,N-二甲基甲酰胺和乙酸的体积比为1～4∶1；所述的N,N-二甲基甲酰胺的用量为每mmol N-溴代琥珀酰亚胺加入2～4mL；所述的乙酸的用量为每mmol N-溴代琥珀酰亚胺加入1～2mL。
5.根据权利要求2所述的识别RNA和具有光动力的荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤(1)和步骤(2)中，所述的萃取都是为二氯甲烷萃取；所述的干燥都是经过无水硫酸钠干燥；所述的纯化都是经柱层析法纯化；步骤(1)中，所述的加水稀释是每mmol N-溴代琥珀酰亚胺加入5～10mL水稀释；步骤(2)中，所述的加水稀释是每mmol中间体1加入20～50mL水稀释。
6.根据权利要求5所述的识别RNA和具有光动力的荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤(1)中柱层析法分离淡黄色固体时的洗脱液为正己烷与二氯甲烷混合液；正己烷与二氯甲烷的体积比1～5∶1；
柱层析法分离得到中间体1的洗脱液为正己烷与乙酸乙酯的混合液，正己烷与乙酸乙酯的体积比为5～10∶1；
步骤(2)中柱层析法纯化时的洗脱液为正己烷与二氯甲烷混合液，正己烷与二氯甲烷的体积比为1～5∶1。
7.根据权利要求2所述的识别RNA和具有光动力的荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的碳酸钾水溶液的浓度为1～2mol/L，用量为每mmol中间体1加入5～10mL；所述的四氢呋喃或者甲苯的用量为每mmol中间体1加入20～25mL；所述的四(三苯基膦)钯的用量每mmol中间体1加入25～50mg。
8.根据权利要求2所述的识别RNA和具有光动力的荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，重结晶的溶剂为正己烷或者乙醚；所述的二氯甲烷、正己烷或者乙醇的用量每mmol 4-甲基吡啶加入2～4mL。
9.根据权利要求2所述的识别RNA和具有光动力的荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，柱层析法纯化时的洗脱液为正己烷与乙醇混合液，正己烷与乙醇的体积比为20～50∶1；重结晶的溶剂为正己烷或者乙醚。
10.根据权利要求2所述的识别RNA和具有光动力的荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述的二氯甲烷或者乙醇的用量为每mmol中间体2加入20～40mL；所述的哌啶的用量为每mmol中间体2加入4～8滴。
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