CN111732581B - 一种检测次氯酸/次氯酸钠的荧光探针及制备方法和应用 - Google Patents

一种检测次氯酸/次氯酸钠的荧光探针及制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于技术领域，具体涉及一种检测次氯酸/次氯酸钠的荧光探针及制备方法和应用。本发明通过10H‑吩噻嗪与溴乙烷的反应，得到10‑乙基‑10H‑吩噻嗪；通过10‑乙基‑10H‑吩噻嗪进行维尔斯迈尔(Vilsmeier)反应，得到3‑甲酰基10‑乙基‑10H‑吩噻嗪；通过3‑二乙胺基苯酚与3‑甲酰基‑10‑乙基‑10H‑吩噻嗪反应，得到9‑(10‑乙基‑10H‑吩噻嗪)‑3，6‑双(二乙胺基)占吨翁氯化物，即为本发明检测次氯酸/次氯酸钠的荧光探针。本发明的荧光探针用于活细胞内次氯酸/次氯酸钠的检测，将次氯酸/次氯酸钠荧光探针与磷酸缓冲溶液和DMF的缓冲液混合，再加入待测溶液中，得到混合溶液，利用596nm荧光强度的变化检测次氯酸/次氯酸钠的存在与否。

Description

一种检测次氯酸/次氯酸钠的荧光探针及制备方法和应用
技术领域
本发明属于技术领域，具体涉及一种检测次氯酸/次氯酸钠的荧光探针及制备方法和应用。
背景技术
活性氧(ROS)与多种生理和病理过程密切相关。广泛的研究表明，生物体内活性氧和抗氧化防御系统之间的不平衡会导致氧化应激，这可能会增加癌症的发病率。作为重要的细胞器为机体提供能量，线粒体是细胞活性氧的主要来源，包括过氧化氢(H2O2)、超氧阴离子(O2-)、羟基自由基(·OH)、次氯酸(HClO)等。作为一种重要的生物弱酸性物质，HClO(pKa＝7.53)在生理pH下部分解离为ClO-。越来越多的证据表明，HClO/ClO-在免疫防御中起主导作用。然而，HClO/ClO-的异常水平可能对人体健康造成危害，导致蛋白质和组织氧化损伤，引起一系列严重的疾病，如帕金森病、动脉粥样硬化、阿尔茨海默病和其他神经退行性疾病。因此，定量检测细胞内HClO/ClO-分布的有效方法在生物化学和临床化学中具有重要意义。
发明内容
针对传统用于检测HClO/ClO-的方法存在会引起待测样品的破会和很难应用于生物体内HClO/ClO-的检测的技术问题，本发明提供了一种检测次氯酸/次氯酸钠的荧光探针及制备方法和应用。
为了达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：
一种快速检测次氯酸/次氯酸钠的荧光探针，其特征在于：9-(10-乙基-10H-吩噻嗪)-3，6-双(二乙胺基)占吨翁氯化物，结构式如式(1)：
Figure BDA0002561138710000021
2.一种快速检测次氯酸/次氯酸钠的荧光探针的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤1，通过10H-吩噻嗪与溴乙烷的反应，得到10-乙基-10H-吩噻嗪；步骤2，通过10-乙基-10H-吩噻嗪进行维尔斯迈尔反应，得到3-甲酰基10-乙基-10H-吩噻嗪；步骤3，通过3-二乙胺基苯酚与3-甲酰基-10-乙基-10H-吩噻嗪反应，得到9-(10-乙基-10H-吩噻嗪)-3，6-双(二乙胺基)占吨翁氯化物，即为次氯酸/次氯酸钠的荧光探针。
3.根据权利要求2所述的一种快速检测次氯酸/次氯酸钠的荧光探针的制备方法，其特征在于：所述步骤1，通过10H-吩噻嗪与溴乙烷的反应，得到10-乙基-10H-吩噻嗪具体方法是：将10H-吩噻嗪与DMF混合并在N2条件下搅拌至完全溶解，再在30min内缓慢添加NaH，然后缓慢添加1-溴乙烷得到混合物，对混合物进行加热，再倒入冰水中，通过过滤器收集，粗品经硅胶柱层析纯化得到纯白色固体10-乙基-10H-吩噻嗪，结构式如式(2)：
Figure BDA0002561138710000022
所述步骤2，通过10-乙基-10H-吩噻嗪进行维尔斯迈尔反应，得到3-甲酰基10-乙基-10H-吩噻嗪的具体方法是：在氮气保护下，用磁力搅拌器向DMF中加入POCl3，冰浴搅拌，再缓慢加入10-乙基-10H-吩噻嗪的DMF溶液，再升温搅拌过夜；冷却至室温后，倒入冰水中，用Na2CO3水溶液中和，然后用二氯甲烷萃取三次；用无水硫酸镁和蒸发有机溶剂将有机层结合并干燥；粗品经硅胶柱层析纯化，得到产物为橙色固体3-甲酰基-10-乙基-10H-吩噻嗪，结构式如式(3)：
Figure BDA0002561138710000031
所述步骤3，通过3-二乙胺基苯酚与3-甲酰基-10-乙基-10H-吩噻嗪反应，得到9-(10-乙基-10H-吩噻嗪)-3，6-双(二乙胺基)占吨翁氯化物，即为次氯酸/次氯酸钠的荧光探针的具体方法是：将3-甲酰基-10-乙基-10H-吩噻嗪和3-二乙胺基苯酚溶于正丙酸中，以对甲苯磺酸为催化剂，进行加热回流反应，冷却后倒入到饱和乙酸钠溶液中，得到悬浊液，用氯仿提取得到的悬浮液，无水硫酸钠干燥有机提取物，蒸发溶剂，然后将固体溶解在甲醇和氯仿的混合液中，混合剧烈搅拌并真空浓缩，硅胶柱层析纯化，得到9-(10-乙基-10H-吩噻嗪)-3，6-双(二乙胺基)占吨翁氯化物，即得检测HClO/ClO-的荧光探针化合物。
进一步，所述步骤2，通过10-乙基-10H-吩噻嗪进行维尔斯迈尔反应，温度为0～5℃和60～65℃。
进一步，所述步骤1中10H-吩噻嗪、DMF、NaH与1-溴乙烷的摩尔比为1:10:1:1.0～2.0；所述步骤2中10-乙基-10H-吩噻嗪:DMF:POCl3的摩尔比为1.0:1.5～2.0:1.5～2.0；所述步骤3中3-二乙胺基苯酚与3-甲酰基-10-乙基-10H-吩噻嗪的摩尔比为1:2.0～2.1；所述3-二乙胺基苯酚与3-甲酰基-10-乙基-10H-吩噻嗪的混合物与正丙酸的质量比为1:10～20。
进一步，所述步骤1中对混合物进行加热的加热温度为80℃，加热时间为3h；所述步骤2中冰浴搅拌的搅拌时间为30min；所述步骤2中升温搅拌过夜的温度为60℃；所述步骤3中搅拌的时间为30min；所述步骤3中加热回流反应的时间为10h，反应温度为65℃。
进一步，所述步骤1中硅胶柱层析的洗脱剂为PE/CH2Cl2体积比为20:1；所述步骤2中硅胶柱层析的洗脱剂为乙酸乙酯/石油醚体积比为1:10；所述步骤3中硅胶柱层析的洗脱剂为二氯甲烷/甲醇体积比为9:1。
进一步，所述步骤3中甲醇与氯仿体积比为1:1。
一种快速检测次氯酸/次氯酸钠的荧光探针的应用，用于活细胞内次氯酸/次氯酸钠的检测。
一种快速检测次氯酸/次氯酸钠的荧光探针的应用方法，将次氯酸/次氯酸钠荧光探针与磷酸缓冲溶液和DMF的缓冲液混合，再加入待测溶液中，得到混合溶液，利用596nm荧光强度的变化检测次氯酸/次氯酸钠荧光探针的存在与否；所述待测溶液中无次氯酸/次氯酸钠时混合溶液无荧光发射；所述待测溶液中有次氯酸/次氯酸钠时混合溶液发出红色荧光。
与现有技术相比本发明具有以下优点：
(1)本发明合成工艺简单易行，按照比例将3-甲酰基-10-乙基-10H-吩噻嗪和3-二乙胺基苯酚混合，加入正丙酸，以对甲苯磺酸为催化剂，四氯苯醌为氧化剂，最后采用硅胶色谱法进行纯化，得新型次氯酸/次氯酸钠荧光探针；
(2)本发明为9-(10-乙基-10H-吩噻嗪)-3，6-双(二乙胺基)占吨翁氯化物，对次氯酸/次氯酸钠显示了高的灵敏性和选择性；
(3)本发明检测过程在磷酸盐缓冲溶液中进行；
(4)本发明还可用于细胞内次氯酸/次氯酸钠的检测。
附图说明
图1为实施例1的式(1)所示的化合物(检测次氯酸/次氯酸钠)的合成路线图；
图2为实施例1的式(2)所示的化合物的1H NMR图谱；
图3为实施例1的式(1)所示的化合物的1H NMR图谱；
图4为实施例1的式(1)所示的化合物的13C NMR图谱；
图5为实施例1的式(1)所示的化合物的HRMS图谱；
图6为实施例1的式(1)所示的新型检测次氯酸/次氯酸钠荧光探针对次氯酸的滴定图；
图7为实施例1的式(1)所示的新型检测次氯酸/次氯酸钠荧光探针对次氯酸的反应时间曲线；
图8为实施例1的式(1)所示的新型检测次氯酸/次氯酸钠荧光探针对次氯酸的选择性；
图9为实施例1的式(1)所示的新型检测次氯酸/次氯酸钠荧光探针的细胞成像。
具体实施方式
实施例1
一种快速检测次氯酸/次氯酸钠的荧光探针，荧光探针为9-(10-乙基-10H-吩噻嗪)-3，6-双(二乙胺基)占吨翁氯化物，结构式如式(1)：
Figure BDA0002561138710000051
上述本实施例的检测的新型荧光探针的制备方法，其合成路线如图1所示，包括以下步骤：
(1)合成结构式如式(2)所示的10-乙基-10H-吩噻嗪：
Figure BDA0002561138710000061
反应方程式如式(1)所示
Figure BDA0002561138710000062
具体过程为：将吩噻嗪(2.0g，0.010mol)与DMF(30mL)的混合物在N2下搅拌完全溶解，然后在30min内缓慢添加NaH(1.2g，0.050mol)，然后缓慢添加1-溴乙烷(0.88mL，0.012mol)。将混合物在80℃下加热3h(TCL)。完成后，将溶液倒入100g冰水中，通过过滤器收集。粗品经硅胶柱层析(PE/CH2Cl2，20:1，v/v)纯化得到纯白色固体10-乙基-10H-吩噻嗪(1.85g，收率81.5％)。
(2)合成结构式如式(3)所示的3-甲酰基10-乙基-10H-吩噻嗪：
Figure BDA0002561138710000063
反应方程式如式(2)所示
Figure BDA0002561138710000071
具体过程为：在100mL圆底烧瓶中，在氮气保护下，用磁力搅拌器向DMF(2.0mL，25mmol)中加入POCl3(0.88mL，9.45mmol)，然后在室温下搅拌反应混合物30分钟。将5.0mlDMF中的10-乙基-10H-吩噻嗪(1.6g，7.0mmol)缓慢加入该反应混合物中。完全添加后，将反应混合物在60℃下搅拌过夜。冷却至室温后，将反应混合物倒入100g冰水中，用Na2CO3水溶液中和，然后用100mL二氯甲烷萃取三次。用无水硫酸镁和蒸发有机溶剂将有机层结合并干燥。粗品以乙酸乙酯/石油醚(1/10；v/v)为洗脱剂，硅胶柱层析纯化，产物(1.00g，56％)为橙色固体。
式(3)所示的化合物的1H NMR图谱如图2所示。1H NMR(CDCl3，600MHz,ppm):δ9.782(s，1H)，7.627-7.613(m，1H)，7.564-7.561(m，1H)，7.164-7.139(m,1H)，7.098-7.083(m，1H)，6.963-6.938(m，1H)，6.904-6.877(m，2H)，3.975-3.958(m,2H)，1.443(t,J＝6.6Hz,3H)。
(3)合成结构式如式(1)所示的9-(10-乙基-10H-吩噻嗪)-3，6-双(二乙胺基)占吨翁氯化物：
Figure BDA0002561138710000072
反应方程式如式(3)所示：
Figure BDA0002561138710000081
具体过程为：将3-(二乙氨基)苯酚(0.84g，5.16mmol)、3-甲酰基10-乙基-10H-吩噻嗪(0.66g，2.59mmol)和对甲苯磺酸(0.036g，0.20mmol)在丙酸(20mL)中的混合物在65℃下搅拌过夜。冷却至室温后，将混合物倒入3MNaOAc(100mL)中。用氯仿提取得到的悬浮液，无水硫酸钠干燥有机提取物，蒸发溶剂。所得固体溶解在甲醇(20mL)和氯仿(20mL)的混合液中。然后滴加氯仿(10mL，溶有四氯苯醌(0.66g，2.60mmol))。将混合物剧烈搅拌2小时并在真空中浓缩。经硅胶柱层析法，以二氯甲烷/甲醇(9:1，v/v)为流动相，得到1.21g黑色混合物，收率80.5％。表征结果见图2、图3和图4。
式(1)所示的化合物的1H NMR图谱如图3所示：δ7.43-7.40(m，2H)，7.35-7.34(m，1H)，7.31(d，J＝1.8Hz,1H),7.28-7.25(m，2H)，7.19-7.17(m,1H)，7.14-7.11(m，3H)，7.02-6.99(m，1H)，6.95(d，J＝1.8Hz,2H)，4.04(q，J＝6.6Hz,2H)，3.671-3.648(m，8H)，1.39(t，J＝6.6Hz，3H)，1.22(t，J＝6.6Hz，12H)；
式(1)所示的化合物的13C NMR图谱如图4所示13C NMR(150MHz，CDCl3)δ160.7,160.0,158.4,149.5,146.8,135.1,133.1,131.4,131.3,130.5,128.8,126.7,126.4,125.5,119.2,118.6,117.7,115.9,99.5,48.7,44.9,16.0,15.8；
式(1)所示的化合物的HRMS图谱如图5所示HRMS(ESI)：calcd for[M]+548.2730，found 548.27204。
上述本实施例制得的新型荧光探针的应用研究，荧光探针应用于HClO/ClO-定性评价。该荧光探针与HClO/ClO-发生氧化反应，通过定量检测加成产物的荧光强度来测定HClO/ClO-的含量。
1、荧光探针应用于HClO/ClO-定性评价
(1)配制pH＝7.4、浓度为0.02mol/L的磷酸盐缓冲溶液和用N,N-二甲酰胺以体积比为8:2，配制2×10-5mol/L的荧光探针储备液；向储备液中加入待测溶液，待测溶液中无HClO/ClO-，596nm处的荧光强度很弱；待测溶液中含有HClO/ClO-，596nm荧光强度增强。如图6。
2、荧光探针应用于HClO/ClO-反应时间
用荧光探针储备液加入荧光比色皿中，加入次氯酸溶液进行荧光时间实验；以时间为横坐标，以596nm处荧光强度为纵坐标绘制图，得到ClO-时间工作曲线，其反应时间在20秒内。如图7。
3、荧光探针对次氯酸的选择性图
在荧光比色皿中，各加入2mL的pH＝7.4的磷酸盐缓冲溶液和2μL荧光探针储备液，再分别加入5摩尔当量的F-，NO3 -，H2PO4 -，NO2 -，ClO4 -，Mg2+，Ca2+，Cu2+，Fe2+，Cys，GSH，H2O2，NO·，O2-，·OH，ONOO-，分别测其在596nm处的荧光强度。荧光发射图见图6。经实验证明，荧光探针对次氯酸具有特异性响应。如图8。
4荧光探针对次氯酸的细胞成像
实验之前用二甲亚砜溶液体系配制2.0×10-3M的荧光探针储备液。将HepG2细胞进行如下处理：a)参比细胞；b)取上述荧光探针储备液加入含有贴壁细胞的培养基，置于37℃的5％CO2培养箱中孵育15min；c)将含有贴壁细胞加入上述荧光探针储备液；d)取上述荧光探针储备液加入含有贴壁细胞的培养基，置于37℃的5％CO2培养箱中孵育15min。然后再加入次氯酸钠后，再孵育15min。将处理好的细胞在
Figure BDA0002561138710000101
FL Auto Cell Imaging System的RFP(Ex 530nm/Em 593nm)下，分别进行荧光成像(40倍物镜，e，f，g，h为相应明场)。如图9。
本发明说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。尽管上面对本发明说明性的具体实施方式进行了描述，以便于本技术领的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。

Claims (8)

1.一种快速检测次氯酸/次氯酸钠的荧光探针，其特征在于：9- (10-乙基-10H-吩噻嗪) -3，6-双(二乙胺基)占吨翁氯化物，结构式如式（1）：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
（1）。
2.一种快速检测次氯酸/次氯酸钠的荧光探针的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤1，通过10H-吩噻嗪与溴乙烷的反应，得到10-乙基-10H-吩噻嗪；步骤2，通过10-乙基-10H-吩噻嗪进行维尔斯迈尔反应，得到3-甲酰基-10-乙基-10H-吩噻嗪；步骤3，通过3-二乙胺基苯酚与3-甲酰基-10-乙基-10H-吩噻嗪反应，得到9-(10-乙基-10H-吩噻嗪) -3，6-双(二乙胺基)占吨翁氯化物，即为检测次氯酸/次氯酸钠的荧光探针。
3.根据权利要求2所述的一种快速检测次氯酸/次氯酸钠的荧光探针的制备方法，其特征在于：所述步骤1，通过10H-吩噻嗪与溴乙烷的反应，得到10-乙基-10H-吩噻嗪的具体方法是：将10H-吩噻嗪与DMF混合并在N2条件下搅拌至完全溶解，再在30 min内缓慢添加NaH，然后缓慢添加1-溴乙烷得到混合物，对混合物进行加热，再倒入冰水中，通过过滤器收集，粗品经硅胶柱层析纯化得到纯白色固体10-乙基-10H-吩噻嗪，结构式如式（2）：
Figure 122753DEST_PATH_IMAGE002
（2）；
所述步骤2，通过10-乙基-10H-吩噻嗪进行维尔斯迈尔反应，得到3-甲酰基-10-乙基-10H-吩噻嗪的具体方法是：在氮气保护下，用磁力搅拌器向DMF中加入POCl3，冰浴搅拌，再缓慢加入10-乙基-10H-吩噻嗪的DMF溶液，再升温搅拌过夜；冷却至室温后，倒入冰水中，用Na2CO3水溶液中和，然后用二氯甲烷萃取三次；用无水硫酸镁和蒸发有机溶剂将有机层结合并干燥；粗品经硅胶柱层析纯化，得到产物为橙色固体3-甲酰基-10-乙基-10H-吩噻嗪，结构式如式（3）：
Figure DEST_PATH_IMAGE003
（3）；
所述步骤3，通过3-二乙胺基苯酚与3-甲酰基-10-乙基-10H-吩噻嗪反应，得到9-(10-乙基-10H-吩噻嗪) -3，6-双(二乙胺基)占吨翁氯化物的具体方法是：将3-甲酰基-10-乙基-10H-吩噻嗪和3-二乙胺基苯酚溶于正丙酸中，以对甲苯磺酸为催化剂，进行加热回流反应，冷却后倒入到饱和乙酸钠溶液中，得到悬浊液，用氯仿提取得到的悬浮液，无水硫酸钠干燥有机提取物，蒸发溶剂，然后将固体溶解在甲醇和氯仿的混合液中，并加入2,3,5,6-四氯-1,4-苯醌进行氧化，混合剧烈搅拌并真空浓缩，硅胶柱层析纯化，得到9- (10-乙基-10H-吩噻嗪) -3，6-双(二乙胺基)占吨翁氯化物，即得检测次氯酸/次氯酸钠的荧光探针化合物。
4.根据权利要求3所述的一种快速检测次氯酸/次氯酸钠的荧光探针的制备方法，其特征在于：所述步骤2，通过10-乙基-10H-吩噻嗪进行维尔斯迈尔反应，升温搅拌过夜的温度为60~65℃。
5.根据权利要求3所述的一种快速检测次氯酸/次氯酸钠的荧光探针的制备方法，其特征在于：所述步骤1中10H-吩噻嗪、DMF、NaH与溴乙烷的摩尔比为 1 : 10 : 1 : 1.0~2.0；所述步骤2中10-乙基-10H-吩噻嗪 : DMF : POCl3的摩尔比为1.0 : 1.5~2.0 : 1.5~2.0；所述步骤3中3-二乙胺基苯酚与3-甲酰基-10-乙基-10H-吩噻嗪的摩尔比为1:2.0~2.1；所述3-二乙胺基苯酚与3-甲酰基-10-乙基-10H-吩噻嗪的混合物与正丙酸的质量比为 1:10~20。
6.根据权利要求3所述的一种快速检测次氯酸/次氯酸钠的荧光探针的制备方法，其特征在于：所述步骤1中对混合物进行加热的加热温度为80℃，加热时间为3 h；所述步骤2中冰浴搅拌的搅拌时间为30 min；所述步骤2中升温搅拌过夜的温度为 60℃；所述步骤3中搅拌的时间为30 min；所述步骤3中加热回流反应的时间为10 h，反应温度为65℃。
7.根据权利要求3所述的一种快速检测次氯酸/次氯酸钠的荧光探针的制备方法，其特征在于：所述步骤1中硅胶柱层析的洗脱剂是体积比为20 : 1的石油醚和二氯甲烷；所述步骤2中硅胶柱层析的洗脱剂是体积比为1 : 10的乙酸乙酯和石油醚；所述步骤3中硅胶柱层析的洗脱剂是体积比为9 : 1的二氯甲烷和甲醇。
8.根据权利要求3所述的一种快速检测次氯酸/次氯酸钠的荧光探针的制备方法，其特征在于：所述步骤3中甲醇与氯仿体积比为1 : 1。
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