CN115181098B - 一种靶向线粒体的aie型次氯酸荧光探针及其制备方法、应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种靶向线粒体的AIE型次氯酸荧光探针及其制备方法、应用。该荧光探针的化学式为C₄₀H₃₀N₅SPF₆，其合成过程分为以下四步：(a)化合物1与N‑溴代丁二酰亚胺反应，得到化合物2；(b)化合物2与4‑吡啶硼酸频哪醇酯反应，得到化合物3；(c)化合物3与2‑(1‑乙基喹啉‑4(1H)‑亚基)丙二腈反应，得到化合物4；(d)化合物4与碘甲烷反应，然后进行离子交换，得到目标产物。本发明提供的AIE型次氯酸荧光探针在水含量丰富的细胞液、组织液等液体环境中依然表现出可靠的荧光信号，有望用于细胞线粒体内次氯酸的荧光成像检测。

Description

一种靶向线粒体的AIE型次氯酸荧光探针及其制备方法、应用

技术领域

本发明涉及生化检测及功能材料技术领域，具体涉及一种靶向线粒体的AIE型次氯酸荧光探针及其制备方法、应用。

背景技术

次氯酸(HClO)是生物体内重要的活性氧物种之一，由过氧化氢和氯离子在髓过氧化物酶的催化下产生。次氯酸在生物体内扮演着“双面”角色，一方面充当第二信使参于机体免疫调节，抵御外来病原菌入侵，起积极的防御作用，参与维持细胞内部微环境的氧化还原稳态；另一方面次氯酸水平异常时，会破坏蛋白质、DNA、磷脂膜等关键生物大分子，引起细胞凋亡、坏死，进而引发肺病、肝病、神经系统疾病等恶性疾病。

线粒体作为细胞内的一类重要细胞器，是次氯酸、过氧化氢等活性氧物种的主要产生场所，在维持细胞内环境的氧化还原平衡过程中占有重要地位，因此开发一种简便、快捷、可靠、准确的检测线粒体内次氯酸水平的方法具有重要意义。

已知的传统次氯酸检测方法包括碘量法、比色法、电化学法、库伦法等，荧光法因具有操作方便、原位成像、时空分辨率高等优点，已成为检测细胞中次氯酸水平的主流方法。目前绝大部分公开报道的次氯酸荧光探针都是由传统的发光基团(如香豆素、荧光素、亚甲蓝、罗丹明等)构建而成，如中国专利CN106518860A、CN106632363A、CN109781678A、CN110483573A等。具体来看，中国专利CN106588910A公开了一种双功能荧光探针，该荧光探针属于聚集诱导荧光淬灭(ACQ)型，通常其检测结果的准确性对探针分子的浓度非常敏感，而且探针分子的抗光漂白能力并不突出。中国专利CN108863922A公开了一种基于AIE的可快速检测次氯酸的聚合物比率荧光传感器，尽管该探针本身也有AIE效应，但是其与次氯酸响应后分子发生裂解，主要发光基团变为芘甲醛(这是一个典型的ACQ荧光基团)，因此依然无法充分发挥AIE荧光探针本身的优势。此外该探针主要在pH＝4的生理环境中有效，这极大的限制了其使用范围。

在生物环境中，上述结构的荧光分子普遍容易产生ACQ现象，并且光稳定性差使得检测结果的准确度受到严重干扰。与ACQ型染料不同的是，聚集诱导发光(AIE)型荧光探针在细胞液、组织液等水含量丰富的液体环境中聚集后荧光信号会增强，表现出优异的抗光漂白能力，因此AIE型荧光探针在生物领域的应用潜力巨大。综合已报道的各类次氯酸荧光探针，或不具有细胞器靶向能力，或抗干扰能力差，或信号保真度低，或灵敏度不够高，这些缺点和不足使其远达不到生物领域应用要求。针对这些问题，本申请发明人研发了一种新型分子结构的靶向线粒体AIE型次氯酸荧光探针。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种新型分子结构的靶向线粒体的AIE型次氯酸荧光探针，该荧光探针的化学式为C₄₀H₃₀N₅SPF₆，分子结构如下：

本发明的第二重目的在于提供上述荧光探针的制备方法，具体包括以下步骤：(a)化合物1与N-溴代丁二酰亚胺(NBS)反应，得到化合物2；(b)化合物2与4-吡啶硼酸频哪醇酯反应，得到化合物3；(c)化合物3与2-(1-乙基喹啉-4(1H)-亚基)丙二腈反应，得到化合物4；(d)化合物4与碘甲烷反应，接着与六氟磷酸银(AgPF₆)进行离子交换，最终得到目标产物。

进一步的，步骤(a)中化合物1与NBS的摩尔比为1:1.0-1.1，步骤(b)中化合物2与4-吡啶硼酸频哪醇酯的摩尔比为1:1.0-1.5，步骤(c)中化合物3与2-(1-乙基喹啉-4(1H)-亚基)丙二腈的摩尔比为1:1.0-2.0，步骤(d)中化合物4与碘甲烷、AgPF₆的摩尔比为1:1.0-3.0:5.0-7.0。

进一步的，步骤(a)具体过程如下：将化合物1、有机溶剂加入到反应器中，将反应器置于冰水浴中搅拌备用；将NBS溶于有机溶剂中，所得溶液滴加至反应器中，接着加热至室温搅拌反应，反应完分离提纯得到化合物2。

进一步的，步骤(b)具体过程如下：将化合物2以及4-吡啶硼酸频哪醇酯、碳酸钾、四三苯基膦钯加入到反应器中，再加入适量四氢呋喃(THF)和水，所得混合物在惰性气氛下搅拌回流反应(反应温度60-70℃)，反应完分离提纯得到化合物3。

进一步的，步骤(c)具体过程如下：将化合物3以及2-(1-乙基喹啉-4(1H)-亚基)丙二腈加入到反应器中，再加入适量乙醇和乙腈、催化量哌啶、少量冰醋酸，所得混合物搅拌回流反应(反应温度70-80℃)，反应完分离提纯得到化合物4。

进一步的，步骤(d)具体过程如下：将化合物4、碘甲烷加入到反应器中，再加入适量甲苯于室温下避光搅拌反应，将固液分离所得固体与AgPF₆一同加入到反应器中，再加入适量乙醇和二氯甲烷(DCM)于室温下搅拌反应，反应完分离提纯得到目标产物。

进一步的，步骤(a)-步骤(d)中产物的分离提纯方法包括萃取、柱层析分离，其中柱层析分离所选用的硅胶颗粒大小为200-300目，步骤(a)选用的洗脱剂配比为乙酸乙酯/二氯甲烷(体积比)＝1:1-3，步骤(b)选用的洗脱剂配比为乙酸乙酯/二氯甲烷(体积比)＝2-5:1，步骤(c)选用的洗脱剂配比为乙酸乙酯/二氯甲烷(体积比)＝5-7:1，步骤(d)选用的洗脱剂配比为二氯甲烷/甲醇(体积比)＝20-40:1。

本发明的第三重目的在于利用上述荧光探针定量检测细胞线粒体内的次氯酸含量。

本发明公开的荧光探针除了能定量检测次氯酸外，还拥有以下三方面的优势：(1)通过引入吡啶的六氟磷酸根盐，能够调控探针分子的亲疏水特性，平衡分子的AIE特性以及与次氯酸的反应活性；(2)线粒体是细胞内产生次氯酸的主要场所，分子中的吡啶阳离子能够主动靶向线粒体，使得利用其检测次氯酸更具有应用价值；(3)探针分子识别次氯酸前后都能保持AIE效应，充分发挥了AIE荧光探针在生理环境中的使用优势。

与现有技术相比，本发明的有益效果体现在以下几方面：(1)反应所需的原料易得，各步反应条件相对温和，不涉及高温、高压，整个工艺流程相对简单，比较容易实现和规模化；(2)制得的荧光探针靶向性和适应性好，与次氯酸响应前后都能保持AIE效应，即便在较高含水量的细胞液、组织液等液体环境中依然表现出可靠的荧光信号，有望用于细胞线粒体内次氯酸的荧光成像检测；(3)该荧光探针的灵敏度高，检测限低至40.8nM；通过不同通道荧光信号比值的变化可以精确测定样品中的次氯酸水平，当次氯酸浓度在0-60μM范围内，可直接通过F₅₁₀/F₆₁₇值与次氯酸浓度的线性关系准确计算出测试液中的次氯酸浓度。

附图说明

图1为本发明荧光探针的高分辨质谱测试结果图。

图2为本发明荧光探针与次氯酸响应前后的紫外-可见吸收光谱图。

图3为本发明荧光探针的AIE性能测试结果图。

图4为本发明荧光探针与不同浓度次氯酸响应后荧光发射光谱变化图。

图5为本发明荧光探针对0-60μmol/L浓度范围内次氯酸的荧光强度比值(F₅₁₀/F₆₁₇)线性关系图。

图6为本发明荧光探针抗干扰能力测试图。

具体实施方式

为使本领域普通技术人员充分理解本发明的技术方案和有益效果，以下结合具体实施例及附图进行进一步说明。

本发明所述靶向线粒体的AIE型次氯酸荧光探针的分子结构及制备方法如下：

第一步：将NBS、化合物1分别溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，将化合物1/DMF溶液置于冰水浴中，向其中滴加NBS/DMF溶液，控制化合物1与NBS的摩尔比为1:1.0-1.1，在室温环境下(约0-25℃)反应得到化合物2；

第二步：按比例将化合物2与4-吡啶硼酸频哪醇酯(两者摩尔比1:1.0-1.5)、碳酸钾、四三苯基膦钯加入到圆底烧瓶中，再加入适量四氢呋喃和水，向烧瓶中通入惰性气体并加热搅拌，在60-70℃下回流反应得到化合物3；

第三步：按照1:1.0-2.0的摩尔比将化合物3和2-(1-乙基喹啉-4(1H)-亚基)丙二腈加入到圆底烧瓶中，再加入适量乙醇和乙腈、催化量哌啶以及少量冰醋酸，所得混合物在70-80℃下搅拌回流反应得到化合物4；

第四步：按照1:1.0-3.0的摩尔比将化合物4与碘甲烷加入到圆底烧瓶中，再加入适量甲苯，所得混合液在室温下(约20-25℃)搅拌反应。产物经抽滤后，按照1:5.0-7.0的摩尔比添加六氟磷酸银，再加入适量乙醇和二氯甲烷于室温(约20-25℃)下搅拌反应，产物经萃取、柱层析分离得到目标荧光探针分子，记为QM-PZ-Py。

实施例1

向含有化合物1(0.9g，2.97mmol)的100mL双口圆底烧瓶中添加无水DMF 15mL。将N-溴代丁二酰亚胺(0.554g，3.11mmol)溶于15mL无水DMF中，冰水浴条件下将配制好的N-溴代丁二酰亚胺溶液滴加至上述圆底烧瓶中。滴加完毕后继续在冰水浴条件下搅拌60min，接着将圆底烧瓶转移至25℃环境中继续搅拌反应5h。反应结束后，首先用二氯甲烷/H₂O(1/3，v/v)萃取三次，接着减压旋蒸除去溶剂，所得粗产品进一步柱层析分离纯化(乙酸乙酯/二氯甲烷＝1/1，v/v)，得到的黄色粉末即为化合物2。产量：900mg，产率：80.00％。

将化合物2(800mg，2.09mmol)、4-吡啶硼酸频哪醇酯(643mg，3.14mmol)、碳酸钾(1.24g，9.98mmol)和四三苯基膦钯(138.67mg，0.12mmol)加入到100mL两口圆底烧瓶中，在氩气保护下注入除氧去离子水5mL、除氧THF 30mL，所得混合物加热至70℃搅拌反应16h。反应结束后，首先用二氯甲烷/H₂O(1/3，v/v)萃取三次，接着减压旋蒸除去溶剂，所得粗产品进一步柱层析分离纯化(乙酸乙酯/二氯甲烷＝3/1，v/v)，得到的橙色粉末即为化合物3。产量：620mg，产率：76.85％。

将化合物3(500mg，1.31mmol)、2-(1-乙基喹啉-4(1H)-亚基)丙二腈(581mg，2.63mmol)加入到100mL两口圆底烧瓶中，再注入无水乙醇20mL、无水乙腈20mL，随后加入哌啶0.1mL、醋酸0.1mL作为催化剂，所得混合物加热至75℃搅拌回流反应16h。反应结束后，首先用二氯甲烷/H₂O(1/3，v/v)萃取三次，接着减压旋蒸除去溶剂，所得粗产品进一步柱层析分离纯化(乙酸乙酯/二氯甲烷＝5/1，v/v)，得到的红色粉末即为化合物4。产量：310mg，产率：39.57％。

将化合物4(300mg，0.50mmol)加入到50mL两口圆底烧瓶(锡纸遮光)中，再注入甲苯30mL并滴入碘甲烷1.0mL，所得混合物在25℃下搅拌反应12h。反应结束后，静置5h再抽滤，滤渣用无水乙醇洗涤后得到黑色粉末。将黑色粉末、六氟磷酸银(618.90mg，2.45mmol)加入到100mL反应管中，注入无水乙醇10mL、二氯甲烷10mL，所得混合物在约25℃下搅拌反应16h。反应结束后用二氯甲烷/H₂O(1/3，v/v)萃取三次，接着减压旋蒸除去溶剂，所得粗产品进一步柱层析分离纯化(二氯甲烷/甲醇＝40/1，v/v)，得到的褐色粉末即为荧光探针QM-PZ-Py。产量：260mg，产率：84.69％。

为了解目标产物的各项性能，对其进行了以下分析测试。

1.高分辨质谱测试

为确认制得的黑色粉末产物就是我们想要的目标产品，对其进行了高分辨质谱HRMS(ESI源)测试，结果如图1所示。HRMS(ESI)：m/z for C₄₀H₃₀N₅S⁺[M]⁺：612.2216；found612.2284，这说明确已成功制得了目标分子结构的产物。

2.紫外-可见吸收光谱测试

以二甲基亚砜(DMSO)为溶剂，配制浓度为1mM的QM-PZ-Py/DMSO溶液。分别取10μL该溶液加至1mL的PBS(pH＝7.4，10mM)缓冲溶液中得到两份工作溶液，然后分别加入0倍量(次氯酸浓度/荧光探针浓度＝0μmol/L/10μmol/L)和10倍量(次氯酸浓度/荧光探针浓度＝100μmol/L/10μmol/L)的次氯酸，测试上述两种体系的紫外-可见吸收光谱，结果如图2所示。从图2可以看出，添加次氯酸后测试体系的最大吸收由458nm移至442nm处，表明本发明提供的荧光探针确实能够与次氯酸发生反应。

3.AIE性能测试

为充分了解制得的荧光探针QM-PZ-Py的AIE性能，进行了以下测试：以THF为溶剂，配制浓度为1mM的QM-PZ-Py/THF溶液。以THF和水作为混合溶剂，配制不同含水量的测试溶液。具体方法为：向圆底离心管中加入THF(1mL、0.9mL、0.8mL、0.7mL、0.6mL、0.5mL、0.4mL、0.3mL、0.2mL、0.1mL、0.01mL)和去离子水(0mL、0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL、0.7mL、0.8mL、0.9mL、0.99mL)，形成不同含水量的测试溶液。取10μL QM-PZ-Py/THF溶液加至上述不同含水量的测试溶液中，超声5s形成最终测试体系。在测量荧光强度时，将上述离心管内液体转移至四通石英比色皿中，利用450nm的激发光照射比色皿，记录617nm处的荧光强度，结果如图3所示。

从图3可以看出，本发明提供的荧光探针在THF/H₂O(体积比)＝100/0的测试溶液中荧光强度为2000，而在THF/H₂O(体积比)＝1/99的测试溶液中荧光强度为12000，荧光强度增加了6倍，这说明该荧光探针的AIE性能优良。

4.荧光探针滴定次氯酸的实验

以DMSO为溶剂，配制浓度为1mM的QM-PZ-Py/DMSO溶液；以水为溶剂，配制浓度为10mM的次氯酸水溶液。量取10μL QM-PZ-Py/DMSO溶液于2mL离心管中，量取不同体积的次氯酸水溶液加入到上述离心管中，在激发光450nm的测试条件下获得了如图4所示的荧光光谱变化曲线图以及如图5所示的次氯酸浓度与F₅₁₀/F₆₁₇值的工作曲线图。

图4测定结果表明，测试溶液中次氯酸浓度由0μmol/L增加至60μmol/L时，荧光发射光谱图中617nm处荧光强度减弱，而510nm处荧光强度增强，这说明本发明提供的荧光探针与次氯酸之间会发生反应。

从图5可以看出，当测试溶液中次氯酸浓度在0-60μmol/L时，F₅₁₀/F₆₁₇值与次氯酸浓度有良好的线性关系(线性相关系数为0.997)，这表明本发明提供的荧光探针可以借助F₅₁₀/F₆₁₇值定量确定次氯酸浓度。根据信噪比S/N＝3，利用公式LOD＝3σ/к计算得到本发明所述荧光探针的检测限为40.8nmol/L

5.荧光探针抗干扰实验

向一系列圆底离心管中各加入1mL PBS(pH＝7.4，10mM)缓冲溶液和10μL QM-PZ-Py/DMSO母液，再分别加入10倍量(干扰物浓度/荧光探针浓度＝100μmol/L/10μmol/L)的NaClO、Na₂CO₃、CH₃COOK、Na₂S、NaHSO₃、Fe²⁺、Cu²⁺、GSH、Cys、Hcy、NaClO、H₂O₂、NaONOO、·OH、O₂ ^·-、¹O₂、Vc等，然后分别测试各个溶液的荧光发射图谱，结果如图6所示。

从图6可以看出，除NaClO之外，其他检测物(H₂O₂；ONOO^-；·OH；O₂ ^·-；¹O₂；CO₃ ^2-；CH₃COO-；S^2-；HSO₃-；Vc；GSH；Cys；Hcy；Fe²⁺；Cu²⁺)存在的情况下并没有明显影响到探针本身的发光，这表明本发明提供的荧光探针对次氯酸的选择性非常高，在检测时不受其它干扰物的影响。

Claims (9)

1.一种靶向线粒体的AIE型次氯酸荧光探针，其特征在于：该荧光探针的化学式为C₄₀H₃₀N₅SPF₆，其分子结构如下

。

2.权利要求1所述荧光探针的制备方法，其特征在于包括以下步骤：（a）在N,N-二甲基甲酰胺存在条件下，化合物1与NBS反应，分离提纯得到化合物2；（b）在碳酸钾、四三苯基膦钯、四氢呋喃和水存在条件下，化合物2与4-吡啶硼酸频哪醇酯反应，分离提纯得到化合物3；（c）在乙醇、乙腈存在条件下，化合物3与2-(1-乙基喹啉-4(1H)-亚基)丙二腈反应，分离提纯得到化合物4；（d）在甲苯存在条件下化合物4与碘甲烷反应，所得产物在乙醇、二氯甲烷存在条件下与AgPF₆进行离子交换，分离提纯得到目标产物；

。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（a）中化合物1与NBS的摩尔比为1:1.0-1.1，步骤（b）中化合物2与4-吡啶硼酸频哪醇酯的摩尔比为1:1.0-1.5，步骤（c）中化合物3与2-(1-乙基喹啉-4(1H)-亚基)丙二腈的摩尔比为1:1.0-2.0，步骤（d）中化合物4与碘甲烷、AgPF₆的摩尔比为1:1.0-3.0:5.0-7.0。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于步骤（a）具体过程如下：将化合物1、N,N-二甲基甲酰胺加入到反应器中，将反应器置于冰水浴中搅拌备用；将NBS溶于N,N-二甲基甲酰胺中，所得溶液滴加至反应器中，接着加热至室温搅拌反应，反应完分离提纯得到化合物2。

5.如权利要求2所述的方法，其特征在于步骤（b）具体过程如下：将化合物2以及4-吡啶硼酸频哪醇酯、碳酸钾、四三苯基膦钯加入到反应器中，再加入四氢呋喃和水，所得混合物在惰性气氛、60−70℃下搅拌回流反应，反应完分离提纯得到化合物3。

6.如权利要求2所述的方法，其特征在于步骤（c）具体过程如下：将化合物3以及2-(1-乙基喹啉-4(1H)-亚基)丙二腈加入到反应器中，再加入适量乙醇和乙腈、催化量哌啶、少量冰醋酸，所得混合物于70-80℃下搅拌回流反应，反应完分离提纯得到化合物4。

7.如权利要求2所述的方法，其特征在于步骤（d）具体过程如下：将化合物4、碘甲烷加入到反应器中，再加入适量甲苯于室温下避光搅拌反应，将固液分离所得固体与AgPF₆加入到反应器中，再加入适量乙醇和二氯甲烷于室温下搅拌反应，反应完分离提纯得到目标产物。

8.如权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤（b）所述惰性气氛具体为氩气或氮气。

9.如权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（a）−步骤（d）中产物的分离提纯方法包括萃取、柱层析分离，其中柱层析分离所选用的硅胶颗粒大小为200−300目，步骤（a）选用的洗脱剂为体积比=1:1-3的乙酸乙酯/二氯甲烷，步骤（b）选用的洗脱剂为体积比=2-5:1的乙酸乙酯/二氯甲烷，步骤（c）选用的洗脱剂为体积比=5-7:1的乙酸乙酯/二氯甲烷，步骤（d）选用的洗脱剂为体积比=20-40:1的二氯甲烷/甲醇。

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