CN106867521A - 一种新型萘酰亚胺h2s荧光探针及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种新型萘酰亚胺H2S荧光探针（M2），以4‑溴‑1,8‑萘二甲酰亚胺为原料，与2‑氨乙基吗啉反应，得化合物1；化合物1与K2CO3在甲醇中反应得化合物2；化合物2与HI在避光条件下125 ℃回流，反应液用浓NaOH调节pH至中性，过滤，得橙黄色固体HMBQ；HMBQ溶于二氯甲烷，加入三乙胺，加入二硫键苯甲酰氯（0 ℃），室温下搅拌，即得目标产物M2。M2在Tris‑HCl(10 mM,pH=7.4)CTAB(1 mM)溶液中可对H2S进行选择性识别，检测限为0.06 μM。成功进行了M2在MCF‑7细胞内对H2S的识别实验，具有潜在的生物和医学应用价值。
Description
技术领域
本发明属于荧光分子探针领域，涉及一种新型萘酰亚胺H2S荧光探针及其制备方法与应用。
背景技术
硫化氢(H2S)是一种具有特殊气味的气体，对环境的毒性污染已经得到深入的研究。另外，H2S是一种重要的气体信号分子，与许多重要的生理病理过程息息相关。同时，H2S是继一氧化碳和一氧化氮之后第三种可在生命体内发挥生理作用的内源性气体信号分子。人体内源性H2S主要通过L-半胱氨酸的酶解作用产生。H2S生理相关浓度的范围从纳摩尔级到毫摩尔级水平不等。在生理浓度水平下，H2S参与一系列的生理调控过程，例如调节血管张力、心肌收缩、神经传导和胰岛素分泌等。细胞如果不能维持其正常的H2S浓度，便会引起动脉和肺动脉高压、阿尔茨海默氏症、胃粘膜损伤和肝硬化等疾病。因此，选择性识别和高灵敏检测生物体内的H2S具有十分重要的生物医学意义。目前，存在的检测方法有比色法、电化学分析、色谱分析和金属硫化物沉淀等，但这些方法不是灵敏度低就是在检测过程中会对生物造成一定的损害。荧光分子探针能够将分子识别信息转换成仪器可测量的荧光信号，具有灵敏度高、选择性好、操作简单、对生物损害小和可实时原位检测(荧光成像技术)等优点，在H2S的检测中得到了广泛的关注。应用荧光探针法检测细胞内H2S浓度的变化是近年来研究热点之一。1,8-萘酰亚胺类化合物是一种重要的荧光团，具有高的光稳定性、大的Stokes位移、较强的荧光发射等优点，被广泛应用于聚合物、储光物质、DNA切割和燃料等方面。目前，已有很多利用H2S荧光探针来检测H2S的报道，其在设计、作用机制和生物应用等方面得到飞跃发展。这些探针有些可以实现H2S的体外检测，有些可以实现细胞内的H2S检测，有些甚至可以实现亚细胞器内的痕量检测，但仍然存在着诸多缺陷，如灵敏度低，选择性差，响应速度慢以及合成复杂等，因而开发出响应更快、现象更明显、实用性更高的H2S检测分子探针仍然十分重要。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型萘酰亚胺H2S荧光探针及其制备方法与应用，具体技术方案如下：
一种新型萘酰亚胺H2S荧光探针(M2)，该荧光探针的结构式如下式(Ⅰ)所示：
一种新型萘酰亚胺H2S荧光探针(M2)的制备方法，该方法步骤如下：
(1)以4-溴-1,8-萘二甲酰亚胺为原料，与2-氨乙基吗啉反应，乙醇为溶剂，回流搅拌6～8h，滤除固体，柱层析纯化，得化合物1；
(2)将步骤(1)所得化合物1与K2CO3在甲醇中回流搅拌16～28h，抽滤，滤出物水洗3次，所得淡黄色固体即为化合物2；
(3)将步骤(2)所得化合物2与HI在避光条件下125℃回流4～6h，反应液用浓NaOH调节pH至中性，过滤，滤出物进行柱层析纯化，得橙黄色固体HMBQ；
(4)将步骤(3)所得HMBQ和三乙胺溶于二氯甲烷，冰水浴下逐滴加入二硫键苯甲酰氯的二氯甲烷溶液，室温下搅拌8～12h，重结晶得到白色固体即为最终目标产物M2。
优选的，步骤(1)中4-溴-1,8-萘二甲酰亚胺、2-氨乙基吗啉与溶剂乙醇的配比为(0.83～1.39)g：(1.04～1.30)g：20mL；柱层析洗脱剂为乙酸乙酯。
优选的，步骤(2)中化合物1、K2CO3、与溶剂甲醇的配比为(1.16～1.55)g：(2.21～2.76)g：20mL。
优选的，步骤(3)中化合物2、HI(57wt％)的配比为500mg：25mL；柱层析洗脱剂为甲醇和二氯甲烷的混合液，且甲醇与二氯甲烷的体积比为1:40。
优选的，步骤(4)中HMBQ、三乙胺、溶剂二氯甲烷与二硫键苯甲酰氯的配比为(274.5～308.8)mg：3mL：10mL：(521.7～554.3)mg。
本发明提供了新型萘酰亚胺H2S荧光探针(M2)的合成路线，如下式(Ⅱ)所示：
本发明提供了新型萘酰亚胺H2S荧光探针(M2)在H2S检测方面的应用。
本发明提供的新型萘酰亚胺H2S荧光探针(M2)对H2S的识别体系为Tris-HCl缓冲液。
本发明对新型萘酰亚胺H2S荧光探针(M2)的荧光选择性进行了探究，加入HS-后，荧光发生分子内诱导电子转移(ESIPT)，抑制PET的发生，荧光发生增强。
本发明对新型萘酰亚胺H2S荧光探针(M2)的紫外选择性进行了探究，单独配体M2在350nm有最大吸收，当加入10当量HS-时，在483nm有最大吸收。
本发明提供了新型萘酰亚胺H2S荧光探针(M2)对H2S的检测限和探针对pH的响应范围。
本发明提供了其他离子(F-,Cl-,Br-,I-,NO3 -,NO2 -,H2PO4 -,HPO4 2-,PO4 3-,SO4 2-,HSO3 -,S2O3 2-,CA,AcO-,CO3 2-,HCO3 -,SCN-)和含硫醇衍生物(Hcy,Cys,GSH,Thiophenol)对新型萘酰亚胺H2S荧光探针(M2)的H2S识别的干扰能力。
本发明提供了新型萘酰亚胺H2S荧光探针(M2)在MCF-7细胞内对H2S的识别功能。
该H2S荧光探针保持了4-溴-1,8-萘二甲酰亚胺荧光基团光稳定性好的优点，且克服了现有技术存在的对H2S选择性差、灵敏度低的缺点，能够实现对细胞中H2S的高灵敏度检测。该探针结构新颖、合成简单、生物兼容性好、细胞毒性低、对H2S选择性高，该探针可选择性识别H2S，在Tris-HCl缓冲液中，加入NaHS后，溶液由淡黄色变为荧光亮黄色；最低检测限为0.06μM，可用于MCF-7细胞内的H2S识别。
与现有技术相比，本发明的积极效果有：
1.本发明提供的新型萘酰亚胺H2S荧光探针(M2)结构新颖，合成容易且后处理简单；
2.本发明提供的新型萘酰亚胺H2S荧光探针(M2)实现了对硫氢根离子的快速定量检测，并且灵敏度高、选择性好、抗干扰能力强，现象明显，在紫外灯下能看到检测后溶液的荧光变化；
3.本发明提供的新型萘酰亚胺H2S荧光探针(M2)生物兼容性好、细胞毒性低，成功进行了M2在MCF-7细胞内对H2S的识别实验，为探针在活体细胞中实时检测内源性H2S提供了可能，可应用于生物体系细胞中H2S的检测。
附图说明
图1是本发明实施例3中探针M2(10μM)与10当量阴离子在Tris-HCl(10mM,pH＝7.4)CTAB(1mM)溶液中的紫外吸收图。
图2是本发明实施例3中探针M2与10当量阴离子在Tris-HCl(10mM,pH＝7.4)CTAB(1mM)溶液中的荧光发射图。
图3是本发明实施例3中探针M2检测H2S的工作曲线图。
图4是本发明实施例3中其他阴离子对探针M2识别H2S的干扰性图。
图5是本发明实施例3中pH对探针M2识别H2S的影响图。
图6是本发明实施例4中探针M2的细胞应用图。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合本发明的优选实施例进行详细描述。
实施例1：制备新型萘酰亚胺H2S荧光探针M2
(1)称取1.17g(4.22mmol)4-溴-1,8-萘二甲酰亚胺化合物和1.18g(9.08mmol)2-氨乙基吗啉溶于20mL乙醇，回流搅拌7h。反应完成后将反应液冷却至室温，滤除固体，用乙酸乙酯作为洗脱剂进行柱层析纯化，即为目标产物1，产率90.4％；
(2)称取1.4g(3.61mmol)化合物1与2.56g(18.55mmol)K2CO3在20mL甲醇中回流搅拌24h，反应结束后将反应液冷却至室温，抽滤，滤出物用100mL的水洗3次，所得蛋黄色固体即为目标产物2，产率82.4％；
(3)称取500mg(1.5mmol)化合物2溶于25mL HI(57wt％)避光条件下置于125℃下回流5h，反应液用浓NaOH调节pH至中性，此时有大量沉淀析出，过滤，取滤出物。过柱子提纯(洗脱剂为甲醇：二氯甲烷＝1:40，v/v)，所得为橙黄色固体HMBQ，产率76.7％；
(4)称取284.1mg(0.828mmol)HMBQ和3mL的三乙胺溶于10mL重蒸的二氯甲烷中，将540mg(1.656mmol))二硫键苯甲酰氯溶于10mL重蒸过的二氯甲烷溶解所得混合液，在冰水浴条件下将其逐滴加入到HMBQ混合液中。滴加完毕后，将反应液置于室温下搅拌10h。反应完成后，减压除去反应溶剂，用甲醇重结晶得到白色固体300mg(产率40％)，即目标化合物M2。
实施例2：相关溶液配制
溶液的配制：实验中用到的试剂均为分析纯，未进一步处理，直接使用；用到的水是二次高纯水，通过Milli-Q纯水机纯化。
1mM探针M2标准溶液的配制：精确度为万分之一克的分析天平，准确称取探针M2的固体于10mL的容量瓶中，DMSO定容，配制成1mM的基础溶液。
10mM阴离子标准溶液的配制：与配置配体标准溶液相似，用分析天平准确称取一定量的各种阴离子的钠盐于10mL的容量瓶中，高纯水定容，配制成浓度为10mmol/L的溶液。
识别体系中，探针M2浓度为10μM，干扰离子和NaHS浓度为100μM。
实施例3：波谱分析
单独探针M2在350nm有最大吸收，当加入10当量HS-时，在483nm有最大吸收。由以上结果可知，探针M2在Tris-HCl(10mM,pH＝7.4)CTAB(1mM)体系中对HS-有良好的紫外吸收响应，结果见图1。
探针M2在548nm处基本无荧光，当加入10当量HS-时，荧光显著增强。但当加入其它离子和生物小分子时，并没有特别明显的荧光变化。由上述实验结果可知，M2在Tris-HCl(10mM,pH＝7.4)CTAB(1mM)体系中对HS-有好的荧光选择性，结果见图2。
在缓冲溶液Tris-HCl中固定探针M2浓度为(10μM)不变，随着HS-离子浓度增加，拟合出线性方程Y＝25.96+81.64X，R2＝0.9969，经计算检测限为0.06μM，见图3。
向M2(10μM)和10当量各种离子溶液中各加入10当量的HS-,然后测其荧光发射光谱。通过图4可知，其它离子对探针M2识别HS-无明显干扰。
配制pH＝6-7.4的Tris-HCl缓冲溶液，加入探针M2后，荧光无变化，图5中方块所示；加入探针M2和10当量HS-时，荧光增强，图5中圆点所示。表明该探针在pH＝6-7.4范围内，对H2S的识别不产生影响。
实施例4：细胞实验
对探针M2在MCF-7细胞中检测HS-进行了细胞成像实验。实验步骤如下：在MCF-7细胞中先加入10μM的M2探针溶液，在37℃条件下孵育30min，分别在自然光和绿光下成像。如图6中探针M2，可观察到无荧光。然后水洗两次，再往体系中加入10μM的HS-溶液，相同条件下孵育30min后成像。如图6中激发因子NaHS，可以看出细胞内出现大量荧光。白场1和白场2是M2、M2 +HS-在自然光下的细胞成像，细胞形态良好，说明加入的探针和HS-离子并未对细胞造成不可逆伤害。M2可以应用于细胞内检测HS-，说明该探针具有潜在生物和医学应用价值。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，用以说明本发明的技术构思及特点，但本发明的保护范围并不局限于此，本领域普通技术人员对本发明的技术方案所做的其他修改或者等同替换，只要不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (9)
1.一种新型萘酰亚胺H2S荧光探针(M2)，其特征在于，该荧光探针的结构式如下式(Ⅰ)所示：
2.一种根据权利要求1所述的新型萘酰亚胺H2S荧光探针(M2)的制备方法，其特征在于，该方法步骤如下：
(1)以4-溴-1,8-萘二甲酰亚胺为原料，与2-氨乙基吗啉反应，乙醇为溶剂，回流搅拌6～8h，滤除固体，柱层析纯化，得化合物1；
(2)将步骤(1)所得化合物1与K2CO3在甲醇中回流搅拌16～28h，抽滤，滤出物水洗3次，所得淡黄色固体即为化合物2；
(3)将步骤(2)所得化合物2与HI在避光条件下125℃回流4～6h，反应液用浓NaOH调节pH至中性，过滤，滤出物进行柱层析纯化，得橙黄色固体HMBQ；
(4)将步骤(3)所得HMBQ和三乙胺溶于二氯甲烷，冰水浴下逐滴加入二硫键苯甲酰氯的二氯甲烷溶液，室温下搅拌8～12h，重结晶得到白色固体即为最终目标产物M2。
3.根据权利要求2所述新型萘酰亚胺H2S荧光探针(M2)的制备方法，其特征在于，步骤(1)中4-溴-1,8-萘二甲酰亚胺、2-氨乙基吗啉与溶剂乙醇的配比为(0.83～1.39)g：(1.04～1.30)g：20mL；柱层析洗脱剂为乙酸乙酯。
4.根据权利要求2所述新型萘酰亚胺H2S荧光探针(M2)的制备方法，其特征在于，步骤(2)中化合物1、K2CO3、与溶剂甲醇的配比为(1.16～1.55)g：(2.21～2.76)g：20mL。
5.根据权利要求2所述新型萘酰亚胺H2S荧光探针(M2)的制备方法，其特征在于，步骤(3)中化合物2、HI(57wt％)的配比为500mg：25mL；柱层析洗脱剂为甲醇和二氯甲烷的混合液，且甲醇与二氯甲烷的体积比为1:40。
6.根据权利要求2所述新型萘酰亚胺H2S荧光探针(M2)的制备方法，其特征在于，步骤(4)中HMBQ、三乙胺、溶剂二氯甲烷与二硫键苯甲酰氯的配比为(274.5～308.8)mg：3mL：10mL：(521.7～554.3)mg。
7.权利要求1所述新型萘酰亚胺H2S荧光探针(M2)在H2S检测方面的应用。
8.根据权利要求7所述新型萘酰亚胺H2S荧光探针(M2)在H2S检测方面的应用，其特征在于，该探针检测H2S的识别体系为Tris-HCl缓冲液。
9.根据权利要求7所述新型萘酰亚胺H2S荧光探针(M2)在H2S检测方面的应用，其特征在于，该探针在MCF-7细胞内对H2S的识别功能。
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