CN111057057B - 一种用于半胱氨酸特异性检测的荧光化合物及制备方法 - Google Patents
一种用于半胱氨酸特异性检测的荧光化合物及制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开一种2‑（咪唑并[1,2‑a]吡啶‑2‑基）苯基丙烯酸酯的荧光化合物，其可以特异性检测生物体内的半胱氨酸；可以选择性的与半胱氨酸作用，该荧光化合物制备过程简单，原料易得，成本低廉，并且具有较好的细胞膜通透性以及较低的细胞毒性，可进入活细胞中并与胞内半胱氨酸迅速发生迈克尔加成反应，产生可肉眼分辨的强烈荧光；通过紫外吸收和荧光分光光度法分析得出该荧光化合物可以在各种干扰物下对半胱氨酸有着优越的选择性，对常见生物分子有着很强的抗干扰能力；本发明化合物结构稳定，可长期保存；不仅可对胞内半胱氨酸选择性识别，而且能在各种活细胞的生长环境下高灵敏度的定量检测半胱氨酸，并应用于活细胞及斑马鱼成像中。
Description
技术领域
本发明属于有机小分子荧光探针领域，尤其涉及以2-（咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基）苯酚为荧光母体的特异性检测半胱氨酸的荧光化学化合物及其应用。
背景技术
半胱氨酸（Cys），高半胱氨酸（Hcy）和谷胱甘肽（GSH）是生物体中涉及和参与各种生理活动的三种氨基硫醇。它们的代谢和转运与体内许多重要酶和蛋白质的功能表达密切相关。因此，体内异常水平的生物硫醇可引起多种疾病。Cys的巯基是酶促反应中的理想亲核试剂，在生理条件下经历可逆的氧化还原反应，这对于形成二硫键同时保持蛋白质的三级和四级结构是必需的。Hcy是蛋氨酸从Cys衍生的关键中间产物，与心血管系统的健康密切相关。GSH参与许多重要的细胞功能活动，如维持细胞内氧化还原稳态，异质代谢，细胞内信号传导和基因调控。由于三种巯基类氨基酸的结构的相似性，区分它们一直是研究的难题。因此，具有高选择性和灵敏度的Cys检测方法对于更清楚地了解其生物学功能的机制具有重要意义，它还可以为多种疾病的预防和诊断提供重要信息，为临床应用提供理论依据。
传统方法用于检测生物硫醇，包括高效液相色谱，质谱和毛细管电泳。这些方法需要高设备成本，样品处理复杂，运行时间长，因此不适合高通量的常规临床试验和科研应用。荧光探针检测方法具有传统仪器检测所不具备的优点。近年来，大量的硫醇检测探针相继被报道。其中大多数探针可以检测活细胞或组织样品中的巯基类化合物，但是只有少数探针可以在巯基类化合物中选择性识别半胱氨酸，因此，开发出一种新型的用于特异性识别细胞和活体组织中半胱氨酸的荧光化合物是我们迫切解决的问题。
丙烯酰酯基团是具有极化α、β不饱和中心的经典迈克尔受体，其可通过迈克尔加成与生物硫醇的巯基发生反应。由于三种生物硫醇的亲核性不同，可以通过不同的加成反应速率和环化裂解过程实现氨基硫醇的选择性鉴定。因为丙烯酰酯基团的选择性和高灵敏度，许多研究人员利用它来实现对生物硫醇的区分。
综上，选择2-（咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基）苯酚作为荧光母体结构，并利用丙烯酰酯基团对2-（咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基）苯酚上羟基进行修饰，猝灭自身的荧光，提高其灵敏度，有望开发出能够特异性识别半胱氨酸并可应用于细胞和活体组织成像的新型荧光化合物。
发明内容
本发明第一个目的是开发出一种可选择性检测生物硫醇的荧光化合物，该荧光化合物可区分半胱氨酸与同型半胱氨酸和谷胱甘肽。
本发明第二个目的是提供一种可选择性检测生物硫醇的荧光化合物的制备方法。
本发明第三个目的是提供一种可应用于溶液、生物组织及细胞中半胱氨酸检测的方法。
一种用于半胱氨酸特异性检测的荧光化合物为2-（咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基）苯基丙烯酸酯，其化学结构式如式（І）所示：
式（І）。
一种用于半胱氨酸特异性检测的荧光化合物的制备方法，操作步骤如下：
（1）由1-（2-羟基苯基）乙酮、吡啶-2-胺和碘反应制备得到2-（咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基）苯酚（HPIP）；
（2）由2-（咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基）苯酚（HPIP）经过丙烯酰化反应制备得到2-（咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基）苯基丙烯酸酯。
进一步限定的制备方法的技术方案如下：
步骤（1）中，将200mg（1.47mmol）1-（2-羟基苯基）乙酮、318mg（3.38mmol）吡啶-2-胺和448mg（1.78mmol）碘混合；在温度80～130℃条件下，搅拌反应1～7小时；在温度60～80℃下搅拌12小时；加入25mL浓度45%的氢氧化钠（NaOH）水溶液，在温度100℃下搅拌1小时；冷却至室温，用25mL二氯甲烷稀释，用浓度10%的盐酸（HCl）水溶液调节pH值至中性；用10mL二氯甲烷萃取并用10mL去离子水洗涤三次；用5g无水硫酸钠（Na2SO4）干燥并减压浓缩；在温度110℃条件下搅拌反应2～6小时，在温度70℃下搅拌12小时；使用二氧化硅（SiO2）色谱柱纯化，并用体积比为3：1的二氯甲烷和正己烷混合液洗脱；在乙醇和水系统中重结晶，纯化得到橙黄色固体的2-（咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基）苯酚（HPIP）。
步骤（2）中，将500mg（2.4mmol）2-（咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基）苯酚溶于30mL无水二氯甲烷中，冷却至0℃；加入0.5g（4.8mmol）的三乙胺，并缓慢滴加入270mg（3.0mmol）丙烯酰氯；缓慢升温至室温，并搅拌12小时；通过薄层色谱硅胶板（TLC）监测反应进程，当反应完成时，将溶剂蒸发至干，通过洗脱硅胶柱分离产物，获得420mg白色固体的2-（咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基）苯基丙烯酸酯，产率为66.2%，所述洗脱液由正已烷和乙酸乙酯按体积比6:1配制成。
本发明荧光化合物作为荧光探针，用于半胱氨酸的特异性检测。
具体五种检测方法说明如下：
用于溶液体系中半胱氨酸的检测，将所述荧光化合物用缓冲液配制成浓度为10μM的荧光化合物溶液，所述缓冲液由体积比为2:8的4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）和二甲基亚砜（DMSO）配制成，缓冲液的pH值为7.4；取二十三份3mL浓度10μM的荧光化合物溶液，分别对应加入200μM半胱氨酸（Cys），200μM高半胱氨酸（Hcy），200μM谷胱甘肽（GSH），200μM脯氨酸（proline），200μM天冬氨酸（aspartic acid），200μM色氨酸（tryptophan），200μM精氨酸（arginine），200μM酪氨酸（tyrosine），200μM组氨酸（histidine），200μM谷氨酸（glutamicacid），200μM赖氨酸（lysine），200μM苏氨酸（threonine），200μM甘氨酸（glycine），200μM硝酸钾（KNO3），200μM硝酸钙（Ca(NO3)2），200μM硝酸钠（NaNO3），200μM硝酸镁（Mg(NO3)2），200μM硝酸铜（Cu(NO3)2），200μM硝酸锌（Zn(NO3)2），200μM硝酸铁（Fe(NO3)3），200μM硫氢化钠（NaHS）、200μM双氧水（H2O2）、200μM葡萄糖，反应完全，得到二十三份反应物，分别对二十三份反应物进行荧光强度测定；半胱氨酸（Cys）与高半胱氨酸（Hcy）能够提高荧光化合物溶液荧光强度；荧光化合物与半胱氨酸（Cys）的反应速率为荧光化合物与高半胱氨酸（Hcy）反应速率的10倍，即所述荧光化合物可以特异性识别半胱氨酸。
将荧光化合物用于试纸上检测半胱氨酸时，制作荧光化合物检测试纸，用二氯甲烷所述荧光化合物配制成浓度20μM的工作液，再将若干大小形状一致的滤纸浸入其中，取出滤纸并晾干；将200μM半胱氨酸（Cys），200μM高半胱氨酸（Hcy），200μM谷胱甘肽（GSH），200μM脯氨酸（proline），200μM天冬氨酸（aspartic acid），200μM色氨酸（tryptophan），200μM精氨酸（arginine），200μM酪氨酸（tyrosine），200μM组氨酸（histidine），200μM谷氨酸（glutamic acid），200μM赖氨酸（lysine），200μM苏氨酸（threonine），200μM甘氨酸（glycine），200μM硝酸钾（KNO3），200μM硝酸钙（Ca(NO3)2），200μM硝酸钠（NaNO3），200μM硝酸镁（Mg(NO3)2），200μM硝酸铜（Cu(NO3)2），200μM硝酸锌（Zn(NO3)2），200μM硝酸铁（Fe(NO3)3），200μM硫氢化钠（NaHS）、200μM双氧水（H2O2）和200μM葡萄糖的水溶液，分别滴加到滤纸上，再放入紫外灯下观察颜色变化为蓝色，即检测出半胱氨酸。
用于人体肝癌组织HepG2细胞中半胱氨酸检测时，用缓冲液将所述荧光化合物配制成浓度20μM的工作液；所述缓冲液中4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）和二甲基亚砜（DMSO）的体积比为2:8，缓冲液的pH值为7.4；取A,B,C,D,E五组实验组，
A组为空白对照组：用200μL浓度20μM的2-（咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基）苯基丙烯酸酯在含4×104个HepG2细胞的孔板中与HepG2细胞孵育20分钟
B组为阴性对照组：用200μL浓度1mM的N-乙基马来酰亚胺（NEM）在含4×104个HepG2细胞的孔板中与HepG2细胞孵育，然后与20μM 2-（咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基）苯基丙烯酸酯一起孵育20分钟；
C组为谷胱甘肽（GSH）处理对照组：含4×104个HepG2细胞的孔板用200μL浓度1.0mM N-乙基马来酰亚胺（NEM）预处理1小时，然后与200μL浓度200μΜ GSH一起孵育20分钟，再使用200μL浓度20μM 的2-（咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基）苯基丙烯酸酯孵育20分钟；
D组为半胱氨酸（Cys）处理对照组：用200μL浓度1mM的N-乙基马来酰亚胺（NEM）预处理含4×104个HepG2细胞的孔板1小时，，然后与200μL浓度200μΜ半胱氨酸（Cys）一起孵育20分钟，再使用200μL浓度20μM的2-（咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基）苯基丙烯酸酯孵育20分钟；
E组为高半胱氨酸（Hcy）处理对照组：含4×104个HepG2细胞的孔板用200μL浓度1.0mM的N-乙基马来酰亚胺（NEM）预处理1小时，然后与200μL浓度200μΜ高半胱氨酸（Hcy）一起孵育20分钟，后使用200μL浓度20μM的2-（咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基）苯基丙烯酸酯（20μM）孵育20分钟；
通过A组、B组、C组、D组、E组荧光成像结果显示2-（咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基）苯基丙烯酸酯能够进入细胞中，并与细胞中的半胱氨酸进行反应，释放出强烈的蓝色荧光。
用于斑马鱼中半胱氨酸检测时，用缓冲液所述荧光化合物配制成浓度为20μM的工作液，所述缓冲液由4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）和二甲基亚砜（DMSO）按体积比2:8配制成，缓冲液的pH值为7.4；取A，B，C三组实验组，
A组为空白对照组：未经处理过的3日龄斑马鱼；
B组为阳性对照组：用5mL浓度为20μM的2-（咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基）苯基丙烯酸酯与发育正常的3日龄斑马鱼孵育20分钟；
C组为阴性对照组：3日龄斑马鱼用5mL浓度为200 μM的N-乙基马来酰亚胺（NEM）处理15分钟，再用5mL浓度为20μM的2-（咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基）苯基丙烯酸酯与用5mL浓度为200 μM的N-乙基马来酰亚胺（NEM）处理过的3日龄斑马鱼孵育20分钟；
结果显示在28℃下用2-（咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基）苯基丙烯酸酯处理过的斑马鱼显示出明显的蓝荧光，而未处理过的斑马鱼与用N-乙基马来酰亚胺（NEM）处理过再用2-（咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基）苯基丙烯酸酯处理过的斑马鱼并未发现有荧光；荧光成像结果表明2-（咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基）苯基丙烯酸酯能够进入斑马鱼体内并与半胱氨酸反应，产生强烈的蓝色荧光，从而达到检测半胱氨酸的效果。
用于小牛血清中半胱氨酸检测时，用缓冲液将权利要求1所述荧光化合物配制成浓度10μM的工作溶液；所述缓冲液由4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）和二甲基亚砜（DMSO）按体积比2:8配制成，缓冲液的pH值为7.4；用3mL浓度0.1 mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）缓冲液配制五组不同浓度的小牛血清溶液，再设置不加小牛血清作为空白对照。用3mL浓度0.1 mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）缓冲液将小牛血清母液分别稀释成20倍（5％）、10倍（10％）、5倍（20％）、2倍（50％）和未稀释的小牛血清母液（100％）；在五份不同浓度的小牛血清溶液中分别滴加浓度10μM的工作溶液，反应20分钟，利用荧光分光光度计测定其荧光强度的变化并将其放在365nm激发下的紫外灯下观察，结果表明随着小牛血清含量的增加显示出明显的蓝色荧光，即2-（咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基）苯基丙烯酸酯可以定性和定量的检测小牛血清中的半胱氨酸。
本发明的有益技术效果体现在以下方面：
1 .本发明所述荧光化合物制作步骤简单，易于合成，仅通过卤代和酰化两步反应完成该荧光化合物的合成，反应条件温和。
2.该荧光化合物上的丙烯酰基与氨基硫醇中的巯基通过共轭加成形成硫醚，随后Cys/Hcy与探针反应形成的硫醚环化释放荧光基团2-（咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基）苯酚，并生成七元杂环产物5-氧代-1,4-噻吩-3-羧酸和八元杂环产物5-氧代-1,4-噻唑烷-3-羧酸，产生了可识别荧光，因此可排除溶液及生物体中常见分析物的干扰；同时利用与不同氨基硫醇反应速率的快慢，能够特异性、高灵敏度检测半胱氨酸，检测限低至0.33μM，相比于多数同类型荧光化合物具有很大的优势；图2-4的结果显示该荧光化合物对半胱氨酸和高半胱氨酸有较好的选择性。而通过荧光强度与反应时间关系的研究，荧光化合物与Cys的反应速率约为Hcy的10倍。如图6所示，IPPA的荧光强度随着小牛血清含量的增加而增加，并且具有良好的线性关系（R2 = 0.95）。
3.该荧光化合物具有较好的细胞膜通透性以及较低的细胞毒性，成功应用于活细胞及斑马鱼成像中，具有良好的生物应用潜力。该荧光化合物logP = 3.26，属于亲脂性化合物，而且分子量较小，仅为264，比较容易进入细胞，具有较好的细胞膜通透性；如图7所示在浓度为40μM的IPPA存在下，HepG2细胞的存活率仍有85%以上，表明该荧光化合物具有较低的细胞毒性；如图8结果所示，未用NEM处理的HepG2细胞在用IPPA孵育20分钟后显示出显着的荧光，而在用NEM处理的HepG2细胞中未观察到荧光变化；当斑马鱼与探针（20μM）孵育30分钟时，在UV通道中观察到蓝色荧光。然而，当斑马鱼与NEM（200μM）孵育15分钟，然后与IPPA（20μM）孵育30分钟时，未观察到荧光。
附图说明
图1为2-（咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基）苯基丙烯酸酯（IPPA）与半胱氨酸反应环化产物的高分辨质谱图。
图2为2-（咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基）苯基丙烯酸酯（IPPA）与高半胱氨酸反应环化产物的高分辨质谱图。
图3为在2-（咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基）苯基丙烯酸酯（IPPA）的工作液中加入不同氨基酸、人体常见离子、双氧水以及葡萄糖等化合物反应的荧光发射光谱图。
图4为2-（咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基）苯基丙烯酸酯（IPPA）与氨基硫醇的时间依赖性荧光响应和伪一级动力学图。
图5为2-（咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基）苯基丙烯酸酯（IPPA）试纸与不同氨基酸、人体常见离子、双氧水以及葡萄糖等化合物反应的紫外发光图。
图6为2-（咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基）苯基丙烯酸酯（IPPA）与不同浓度的小牛血清的荧光柱状图。
图7为2-（咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基）苯基丙烯酸酯（IPPA）在HepG2细胞中的荧光显微成像图。
图8为2-（咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基）苯基丙烯酸酯（IPPA）在3日龄斑马鱼中孵育的荧光显微成像图。
具体实施方式
本发明公开了一种可特异性检测半胱氨酸的荧光化合物及其制备方法。该荧光化合物的特征在于它由两部分组成，其中丙烯酰基作为识别基团，2-（咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基）苯酚为信息报告基团。所报告荧光化合物上丙烯酰基能与体系中半胱氨酸巯基发生特异性反应，使荧光化合物的荧光发生变化，从而实现对半胱氨酸的特异性检测。
下面结合实施例对本发明进一步描述
实施例1 用于半胱氨酸检测的荧光化合物的制备
本发明所述荧光化合物为2-（咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基）苯基丙烯酸酯（IPPA），具体制备过程如下：
（1）将200mg（1.47mmol）1-（2-羟基苯基）乙酮、318mg（3.38mmol）吡啶-2-胺和448mg（1.78mmol）碘混合；在温度100℃条件下，搅拌反应6小时；在温度80℃下搅拌12小时；加入25mL浓度45%的氢氧化钠（NaOH）水溶液，在温度100℃下搅拌1小时；冷却至室温，用25mL二氯甲烷稀释，用浓度10%的盐酸（HCl）水溶液调节pH值至中性；用10mL二氯甲烷萃取并用10mL去离子水洗涤三次；用5g无水硫酸钠（Na2SO4）干燥并减压浓缩；在温度110℃条件下搅拌反应2～6小时，在温度70℃下搅拌12小时；使用二氧化硅（SiO2）色谱柱纯化，并用体积比为3：1的二氯甲烷和正己烷混合液洗脱；在乙醇和水系统中重结晶，纯化得到234mg橙黄色固体的2-（咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基）苯酚（HPIP），产率为60％。核磁共振氢谱测定：1HNMR (600 MHz, DMSO-d 6 ): δ 12.03 (s, 1H), 8.61-8.57 (m, 1H), 8.46 (s, 1H),7.86-7.85 (dd, J = 7.7, 1.7 Hz, 1H), 7.65-7.63 (dd, J = 9.0, 1.1 Hz, 1H),7.33-7.30 (m, 1H), 7.18-7.16 (m, 1H), 6.98-6.95 (dd, J = 6.7, 1.2 Hz, 1H),6.92-6.86 (m, 2H)。高分辨质谱：HRMS (ESI, m/z) calculated for [C13H10N2O + H]+:211.0866, found: 211.0866；
（2）将500mg（2.4mmol）2-（咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基）苯酚溶于30mL无水二氯甲烷中，冷却至0℃；加入0.5g（4.8mmol）的三乙胺，并缓慢滴加入270mg（3.0mmol）丙烯酰氯；缓慢升温至室温，并搅拌12小时；通过薄层色谱硅胶板（TLC）监测反应进程，当反应完成时，将溶剂蒸发至干，通过洗脱硅胶柱分离产物，获得420mg（66.2％）白色固体的2-（咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基）苯基丙烯酸酯，产率为66.2%；所述洗脱液由正已烷和乙酸乙酯按体积比6:1配制成。核磁共振氢谱测定：1H NMR (600 MHz, DMSO-d 6 ) δ 8.54 (dt, J = 6.8, 1.2 Hz,1H), 8.26-8.19 (m, 1H), 8.15 (s, 1H), 7.57-7.52 (m, 1H), 7.42-7.34 (m, 2H),7.23 (m, 2H), 6.87 (td, J = 6.7, 1.1 Hz, 1H), 6.59 (d, J = 1.7 Hz, 2H), 6.20(dd, J = 6.6, 5.0 Hz, 1H)。核磁共振碳谱测定：13C NMR (151 MHz, DMSO-d 6 ) δ 164.59, 147.71 , 144.52 , 139.96 , 134.26 , 129.38 , 128.91 , 128.28 , 127.48 ,127.03 , 126.76 , 125.74 , 123.78 , 117.08 , 112.73 , 111.75。高分辨质谱：HRMS(ESI, m/z) calculated for [C16H12N2O2 + H]+: 265.0972, found: 265.0971。傅里叶红外光谱：IR (KBr, cm−1): 3442.83, 3152.68, 3074.06, 1740.18, 1633.80, 1499.35,1405.49, 1368.19, 1276.49, 1244.21, 1152.40, 1072.95, 1007.07, 902.81,836.05, 755.37, 741.84, 674.33。
所述荧光化合物为2-（咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基）苯基丙烯酸酯，其化学结构式如式（І）所示：
式（І）。
本发明所述荧光化合物2-（咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基）苯基丙烯酸酯（IPPA）的检测原理如下：
本发明所述荧光化合物，2-（咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基）苯基丙烯酸酯（IPPA），荧光化合物上的丙烯酰基与生物硫醇通过共轭加成形成图1中的C和图2中的B所表示的硫醚,随后Cys/Hcy与探针反应形成的硫醚环化释放图1中的A和图2中的A中表示的荧光基团2-（咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基）苯酚，并生成图1中的B中表示的七元杂环产物5-氧代-1,4-噻吩-3-羧酸和图2中的C中表示八元杂环产物5-氧代-1,4-噻唑烷-3-羧酸。而GSH与探针形成的硫醚十分稳定不易环化，从而可以将GSH从生物硫醇中区分出来。由于在后续环化离去过程中形成七元环的活化熵低于八元环，存在反应速率及稳定性的差异，实现了对Cys和Hcy的区分识别，从而实现对Cys的特异性检。
实施例2 用于溶液体系中半胱氨酸的选择性检测
将实施例1中所制备的荧光化合物用缓冲液配制成浓度为10μM的荧光化合物溶液，所述缓冲液由体积比为2:8的4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）和二甲基亚砜（DMSO）配制成，缓冲液的pH值为7.4；用10μM的荧光化合物溶液选择性的对溶液中的半胱氨酸进行检测；具体操作过程如下：
向配制好的二十三份3mL浓度10μM的荧光化合物溶液中分别加入200μM半胱氨酸（Cys）、200μM高半胱氨酸（Hcy）、200μM谷胱甘肽（GSH）、200μM脯氨酸（proline）、200μM天冬氨酸（aspartic acid）、200μM色氨酸（tryptophan）、200μM精氨酸（arginine）、200μM酪氨酸（tyrosine）、200μM组氨酸（histidine）、200μM谷氨酸（glutamic acid）、200μM赖氨酸（lysine）、200μM苏氨酸（threonine）、200μM甘氨酸（glycine）、200μM硝酸钾（KNO3）、200μM硝酸钙（Ca(NO3)2）、200μM硝酸钠（NaNO3）、200μM硝酸镁（Mg(NO3)2）、200μM硝酸铜（Cu(NO3)2）、200μM硝酸锌（Zn(NO3)2）、200μM硝酸铁（Fe(NO3)3）、200μM硫氢化钠（NaHS）、200μM双氧水（H2O2）、200μM葡萄糖，反应完全，得到二十三份反应物，分别对二十三份反应物进行荧光强度测定；图3中的A和图3中的B分别表示荧光强度和紫外吸收强度的结果，结果显示仅半胱氨酸和高半胱氨酸的荧光强度和紫外吸收强度有了明显的增强，即2-（咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基）苯基丙烯酸酯对半胱氨酸和高半胱氨酸有较好的选择性；图4中的A表示的是荧光强度随时间的变化，图4中的B、图4中的C和图4中的D分别表示的是半胱氨酸、高半胱氨酸以及谷胱甘肽与荧光化合物反应速率的线性关系；通过荧光强度与反应时间关系的研究，荧光化合物与Cys的反应速率约为Hcy的10倍，即所述荧光化合物可以特异性识别半胱氨酸。
实施例3 荧光化合物试纸显色
用于滤纸上生物硫醇检测时，用二氯甲烷和荧光化合物配制成浓度20μM的工作液；具体操作过程如下：
制作所述荧光化合物检测试纸，用二甲基亚砜将本发明所述的荧光化合物配制成浓度20μM的工作液，将若干大小形状一致的滤纸浸入其中，取出滤纸并晾干，将200μM半胱氨酸（Cys），200μM高半胱氨酸（Hcy），200μM谷胱甘肽（GSH），200μM脯氨酸（proline），200μM天冬氨酸（aspartic acid），200μM色氨酸（tryptophan），200μM精氨酸（arginine），200μM酪氨酸（tyrosine），200μM组氨酸（histidine），200μM谷氨酸（glutamic acid），200μM赖氨酸（lysine），200μM苏氨酸（threonine），200μM甘氨酸（glycine），200μM硝酸钾（KNO3），200μM硝酸钙（Ca(NO3)2），200μM硝酸钠（NaNO3），200μM硝酸镁（Mg(NO3)2），200μM硝酸铜（Cu(NO3)2），200μM硝酸锌（Zn(NO3)2），200μM硝酸铁（Fe(NO3)3），200μM硫氢化钠（NaHS）、200μM双氧水（H2O2）和200μM葡萄糖的水溶液，分别滴加到滤纸上，图5显示在紫外灯下滴加半胱氨酸的滤纸颜色变为蓝色，即所述荧光化合物试纸可应用于溶液中半胱氨酸的检测。
实施例4 应用于小牛血清中的半胱氨酸的检测
用于小牛血清中半胱氨酸检测时，用体积比为2:8的4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）和二甲基亚砜（DMSO）缓冲液与本发明所述荧光化合物配制成浓度为10μM的工作溶液，工作溶液pH为7.4；具体操作过程如下：
设置五组不同浓度的小牛血清，加一组空白对照，用3mL浓度0.1 mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）缓冲液配制五组不同浓度的小牛血清溶液，再设置不加小牛血清作为空白对照。用3mL浓度0.1 mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）缓冲液将小牛血清母液分别稀释成20倍（5％）、10倍（10％）、5倍（20％）、2倍（50％）和未稀释的小牛血清母液（100％），将上述配制完成的10μM荧光化合物与不同浓度的小牛血清反应20分钟后，通过荧光分光光度计测定其荧光强度的变化并将其放在365nm激发下的紫外灯下观察，图6中的A显示随着小牛血清含量的增加显示出明显的蓝色荧光；图6中的B显示小牛血清含量与荧光强度表现较好的线性关系，R2=0.95；即2-（咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基）苯基丙烯酸酯可以对小牛血清中的半胱氨酸进行定量检测及显色。
实施例5 HepG2细胞内荧光成像
用于人体肝癌组织HepG2细胞中半胱氨酸检测时，用体积比为2:8的4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）和二甲基亚砜（DMSO）缓冲液与本发明所述荧光化合物配制成浓度为20μM的工作溶液，工作溶液的pH值为7.4；具体操作过程如下：
取A、B、C、D、E五组，A组为空白对照组：用200μL浓度20μM的2-（咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基）苯基丙烯酸酯孵育HepG2细胞20分钟；
B组为阴性对照组：用200μL浓度1mM NEM预处理含4×104个HepG2细胞的孔板1小时，然后与20μM 2-（咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基）苯基丙烯酸酯一起孵育20分钟；
C组为GSH处理对照组：含4×104个HepG2细胞的孔板用200μL浓度1.0mM NEM预处理1小时，然后与200μL浓度200μΜ GSH一起孵育20分钟，再使用200μL浓度20μM 的2-（咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基）苯基丙烯酸酯孵育20分钟；
D组为Cys处理对照组：用200μL浓度1mM NEM预处理含4×104个HepG2细胞的孔板1小时，然后与200μL浓度200μΜ Cys一起孵育20分钟，再使用200μL浓度20μM的2-（咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基）苯基丙烯酸酯孵育20分钟；
E组为Hcy处理对照组：含4×104个HepG2细胞的孔板用200μL浓度1.0mM NEM预处理1小时，然后与200μL浓度200μΜ Hcy一起孵育20分钟，后使用200μL浓度20μM的2-（咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基）苯基丙烯酸酯（20μM）孵育20分钟；
图7中的B、图7中的C和图7中的E中HepG2细胞并未出现明显的蓝色荧光；图7中的A和图7中的D中HepG2细胞表现出强烈的蓝色荧光，即当2-（咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基）苯基丙烯酸酯与半胱氨酸同时存在下HepG2细胞能够表现出强烈的蓝色荧光；表明2-（咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基）苯基丙烯酸酯能够进入细胞中，并与细胞中的半胱氨酸进行反应，释放出强烈的蓝色荧光。
实施例6 斑马鱼的荧光成像
用于斑马鱼体内半胱氨酸检测时，用体积比为2:8的4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）和二甲基亚砜（DMSO）缓冲液与本发明所述荧光化合物配制成浓度为20μM的工作溶液；
具体操作过程如下：取A，B，C三组，
A组为空白对照组：未经处理过的3日龄斑马鱼；
B组为阳性对照组：用5mL浓度为20μM的2-（咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基）苯基丙烯酸酯处理过的3日龄斑马鱼；
C组为阴性对照组：3日龄斑马鱼用5mL浓度为200 μM的NEM处理15分钟，再用5mL浓度为20μM的2-（咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基）苯基丙烯酸酯与用5mL浓度为200 μMNEM处理过的3日龄斑马鱼孵育20分钟；
图8中的B所示在28℃下用2-（咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基）苯基丙烯酸酯处理过的斑马鱼显示出明显的蓝色荧光；而图8中的A中未经处理的斑马鱼与图8中的C中用NEM处理过再用2-（咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基）苯基丙烯酸酯处理过的斑马鱼并未发现有荧光，即表明2-（咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基）苯基丙烯酸酯能够进入斑马鱼体内并与半胱氨酸反应，产生强烈的蓝色荧光，从而达到检测的效果。
Claims (8)
1.一种用于半胱氨酸特异性检测的荧光化合物的制备方法，其特征在于：所述荧光化合物为2-（咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基）苯基丙烯酸酯，其化学结构式如式（І）所示：
式（І）；
具体制备操作步骤如下：
（1）由1-（2-羟基苯基）乙酮、吡啶-2-胺和碘反应制备得到2-（咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基）苯酚（HPIP）；
（2）由2-（咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基）苯酚（HPIP）经过丙烯酰化反应制备得到2-（咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基）苯基丙烯酸酯。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，将200mg（1.47mmol）1-（2-羟基苯基）乙酮、318mg（3.38mmol）吡啶-2-胺和448mg（1.78mmol）碘混合；在温度80～130℃条件下，搅拌反应1～7小时；在温度60～80℃下搅拌12小时；加入25mL浓度45%的氢氧化钠（NaOH）水溶液，在温度100℃下搅拌1小时；冷却至室温，用25mL二氯甲烷稀释，用浓度10%的盐酸（HCl）水溶液调节pH值至中性；用10mL二氯甲烷萃取并用10mL去离子水洗涤三次；用5g无水硫酸钠（Na2SO4）干燥并减压浓缩；使用二氧化硅（SiO2）色谱柱纯化，并用体积比为3：1的二氯甲烷和正己烷混合液洗脱；在乙醇和水系统中重结晶，纯化得到橙黄色固体的2-（咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基）苯酚（HPIP）。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，将500mg（2.4mmol）2-（咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基）苯酚溶于30mL无水二氯甲烷中，冷却至0℃；加入0.5g（4.8mmol）的三乙胺，并缓慢滴加入270mg（3.0mmol）丙烯酰氯；缓慢升温至室温，并搅拌12小时；通过薄层色谱硅胶板（TLC）监测反应进程，当反应完成时，将溶剂蒸发至干，通过洗脱硅胶柱分离产物，获得420mg白色固体的2-（咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基）苯基丙烯酸酯，产率为66.2%；所述洗脱液由正己 烷和乙酸乙酯按体积比6:1配制成。
4.一种2-（咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基）苯基丙烯酸酯在半胱氨酸特异性检测中的应用，其特征在于：用于溶液体系中半胱氨酸的检测，将所述2-（咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基）苯基丙烯酸酯用缓冲液配制成浓度为10μM的荧光化合物溶液，所述缓冲液由体积比为2:8的4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）和二甲基亚砜（DMSO）配制成，缓冲液的pH值为7.4；取二十三份3mL浓度10μM的荧光化合物溶液，分别对应加入200μM半胱氨酸（Cys），200μM高半胱氨酸（Hcy），200μM谷胱甘肽（GSH），200μM脯氨酸（proline），200μM天冬氨酸（aspartic acid），200μM色氨酸（tryptophan），200μM精氨酸（arginine），200μM酪氨酸（tyrosine），200μM组氨酸（histidine），200μM谷氨酸（glutamic acid），200μM赖氨酸（lysine），200μM苏氨酸（threonine），200μM甘氨酸（glycine），200μM硝酸钾（KNO3），200μM硝酸钙（Ca(NO3)2），200μM硝酸钠（NaNO3），200μM硝酸镁（Mg(NO3)2），200μM硝酸铜（Cu(NO3)2），200μM硝酸锌（Zn(NO3)2），200μM硝酸铁（Fe(NO3)3），200μM硫氢化钠（NaHS）、200μM双氧水（H2O2）、200μM葡萄糖，反应完全，得到二十三份反应物，分别对二十三份反应物进行荧光强度测定；半胱氨酸（Cys）与高半胱氨酸（Hcy）能够提高荧光化合物溶液荧光强度；荧光化合物与半胱氨酸（Cys）的反应速率为荧光化合物与高半胱氨酸（Hcy）反应速率的10倍，即所述荧光化合物可以特异性识别半胱氨酸。
5.一种2-（咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基）苯基丙烯酸酯在半胱氨酸特异性检测中的应用，其特征在于：将荧光化合物用于试纸上检测半胱氨酸，制作所述荧光化合物检测试纸，用二氯甲烷将所述2-（咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基）苯基丙烯酸酯配制成浓度20μM的工作液，再将若干大小形状一致的滤纸浸入其中，取出滤纸并晾干；将200μM半胱氨酸（Cys），200μM高半胱氨酸（Hcy），200μM谷胱甘肽（GSH），200μM脯氨酸（proline），200μM天冬氨酸（asparticacid），200μM色氨酸（tryptophan），200μM精氨酸（arginine），200μM酪氨酸（tyrosine），200μM组氨酸（histidine），200μM谷氨酸（glutamic acid），200μM赖氨酸（lysine），200μM苏氨酸（threonine），200μM甘氨酸（glycine），200μM硝酸钾（KNO3），200μM硝酸钙（Ca(NO3)2），200μM硝酸钠（NaNO3），200μM硝酸镁（Mg(NO3)2），200μM硝酸铜（Cu(NO3)2），200μM硝酸锌（Zn(NO3)2），200μM硝酸铁（Fe(NO3)3），200μM硫氢化钠（NaHS）、200μM双氧水（H2O2）和200μM葡萄糖的水溶液，分别滴加到滤纸上，再放入紫外灯下观察颜色变化为蓝色，即检测出半胱氨酸。
6.一种2-（咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基）苯基丙烯酸酯在半胱氨酸特异性检测中的应用，其特征在于：用于人体肝癌组织HepG2细胞中半胱氨酸检测，用缓冲液将所述2-（咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基）苯基丙烯酸酯配制成浓度20μM的工作液；所述缓冲液中4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）和二甲基亚砜（DMSO）的体积比为2:8，缓冲液的pH值为7.4；取A,B,C,D,E五组实验组，
A组为空白对照组：用200μL浓度20μM的2-（咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基）苯基丙烯酸酯在含4×104个HepG2细胞的孔板中与HepG2细胞孵育20分钟；
B组为阴性对照组：用200μL浓度1mM N-乙基马来酰亚胺（NEM）在含4×104个HepG2细胞的孔板中与HepG2细胞孵育1小时，然后与20μM 2-（咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基）苯基丙烯酸酯一起孵育20分钟；
C组为谷胱甘肽（GSH）处理对照组：含4×104个HepG2细胞的孔板用200μL浓度1.0mM N-乙基马来酰亚胺（NEM）预处理1小时，然后与200μL浓度200μΜ GSH一起孵育20分钟，再使用200μL浓度20μM 的2-（咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基）苯基丙烯酸酯孵育20分钟；
D组为半胱氨酸（Cys）处理对照组：用200μL浓度1mM N-乙基马来酰亚胺（NEM）预处理含4×104个HepG2细胞的孔板1小时，然后与200μL浓度200μΜ半胱氨酸（Cys）一起孵育20分钟，再使用200μL浓度20μM的2-（咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基）苯基丙烯酸酯孵育20分钟；
E组为高半胱氨酸（Hcy）处理对照组：含4×104个HepG2细胞的孔板用200μL浓度1.0mMN-乙基马来酰亚胺（NEM）预处理1小时，然后与200μL浓度200μΜ高半胱氨酸（Hcy）一起孵育20分钟，后使用200μL浓度20μM的2-（咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基）苯基丙烯酸酯（20μM）孵育20分钟；
通过A组、B组、C组、D组、E组荧光成像结果显示2-（咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基）苯基丙烯酸酯能够进入细胞中，并与细胞中的半胱氨酸进行反应，释放出强烈的蓝色荧光。
7.一种2-（咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基）苯基丙烯酸酯在半胱氨酸特异性检测中的应用，其特征在于：用于斑马鱼中半胱氨酸检测，用缓冲液将所述2-（咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基）苯基丙烯酸酯配制成浓度为20μM的工作液，所述缓冲液由4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）和二甲基亚砜（DMSO）按体积比2:8配制成，缓冲液的pH值为7.4；取A，B，C三组实验组，
A组为空白对照组：未经处理过的3日龄斑马鱼；
B组为阳性对照组：用5mL浓度为20μM的2-（咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基）苯基丙烯酸酯与发育正常的3日龄斑马鱼孵育20分钟；
C组为阴性对照组：3日龄斑马鱼用5mL浓度为200 μM的N-乙基马来酰亚胺（NEM）处理15分钟，再用5mL浓度为20μM的2-（咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基）苯基丙烯酸酯与用5mL浓度为200 μMN-乙基马来酰亚胺（NEM）处理过的3日龄斑马鱼孵育20分钟；
结果显示在28℃下用2-（咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基）苯基丙烯酸酯处理过的斑马鱼显示出明显的蓝荧光，而未处理过的斑马鱼与用N-乙基马来酰亚胺（NEM）处理过再用2-（咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基）苯基丙烯酸酯处理过的斑马鱼并未发现有荧光；荧光成像结果表明2-（咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基）苯基丙烯酸酯能够进入斑马鱼体内并与半胱氨酸反应，产生强烈的蓝色荧光，从而达到检测半胱氨酸的效果。
8.一种2-（咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基）苯基丙烯酸酯在半胱氨酸特异性检测中的应用，其特征在于：用于小牛血清中半胱氨酸检测，用缓冲液将所述2-（咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基）苯基丙烯酸酯配制成浓度10μM的工作溶液；所述缓冲液由4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）和二甲基亚砜（DMSO）按体积比2:8配制成，缓冲液的pH值为7.4；用3mL浓度0.1 mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）缓冲液配制五组不同浓度的小牛血清溶液，再设置不加小牛血清作为空白对照；
用3mL浓度0.1 mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）缓冲液将小牛血清母液分别稀释成20倍（5％）、10倍（10％）、5倍（20％）、2倍（50％）和未稀释的小牛血清母液（100％）；在五份不同浓度的小牛血清溶液中分别滴加浓度10μM的工作溶液，反应20分钟，利用荧光分光光度计测定其荧光强度的变化并将其放在365nm激发下的紫外灯下观察，结果表明随着小牛血清含量的增加显示出明显的蓝色荧光，即2-（咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基）苯基丙烯酸酯可以定性和定量的检测小牛血清中的半胱氨酸。
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