CN112255208B - 一种检测酪氨酸酶的化合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明利用萤火虫体内具有生物体系内稳定性好、生物兼容性优良的发光物质虫萤光素Luciferin与酪氨酸酶的催化氧化特性，设计一种检测酪氨酸酶的化合物，以虫萤光素衍生物为母体结构，邻二酚羟基为响应基团，二者之间以烷基链共价键合。该化合物具有良好的生物兼容性和荧光性能，最大发射峰位于535nm，滴加Tyr后，其荧光在2min内迅速降低。作用机理为邻二酚羟基基团与萤光素结构之间存在光致电子转移过程(PET)，在体系中加入Tyr后，邻二酚羟基被氧化为醌结构，体系内电子云排布改变后光致电子转移过程被抑制，荧光被淬灭。根据FluotyLu的剂量依赖性荧光光谱变化计算得到了检测极限为0.06087M(PBS中)。在金属离子对FluotyLu检测Tyr的干扰能力中发现，化合物具有检测Fe3+的价值。

Description

一种检测酪氨酸酶的化合物及其应用
技术领域
本发明涉及荧光探针技术领域，涉及一种检测酪氨酸酶的化合物及其应用，具体涉及一种基于萤火虫荧光素的酪氨酸酶荧光探针分子化合物。
背景技术
酪氨酸酶(EC 1.14.18.1，tyrosinase，Tyr)是含铜氧化还原酶，广泛存在于微生物、动植物和哺乳动物体内，特别是在人体组织内，可促进黑色素的产生，使皮肤及头发显示正常黑色。同时，Tyr的活性失调与恶性黑色素瘤、在I型眼皮肤白化病、帕金森病及其他神经变性相关疾病有紧密关系。研究也表明Tyr的含量也是影响水果和蔬菜营养价值的重要因素。因此，Tyr的检测不仅可提供丰富的医学诊断信息，也为食品科学的发展方面提供保障；设计合成高灵敏探针简单快速的检测Tyr已是研究者一直追求的目标。
近年来，反应型荧光探针检测Tyr的方法得到了快速的发展，因具有高专一性、高灵敏度、操作简便的特点而被人们持续关注，尽管已有文献报道了反应型的Tyr探针分子，但多是基于BODIPY、Cyanine及酰亚胺等化学染料或无机纳米材料进行化学修饰得到，生物兼容性并不优越。
发明内容
本发明的目的在于利用萤火虫体内具有生物体系内稳定性好、生物兼容性优良的发光物质萤火虫萤光素Luciferin与Tyr的催化氧化特性，设计合成一种检测酪氨酸酶的化合物，该化合物以萤火虫萤光素为母体结构，邻二酚羟基为响应基团，二者之间以烷基链共价键和，用以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种检测酪氨酸酶的化合物，其结构通式如下：
Figure BDA0002716427490000021
其中，X为NH、COO或O；n＝1～10。
作为本技术方案的进一步优选的：所述化合物结构如下：
Figure BDA0002716427490000022
作为本技术方案的进一步优选的：所述化合物结构如下：
Figure BDA0002716427490000023
本发明第二个目的，提供了一种检测酪氨酸酶的化合物的制备方法，包括如下步骤；
S1：
Figure BDA0002716427490000024
S2：
Figure BDA0002716427490000025
其中，Y1为Br、CHO或COOH；Y2为OH或NH2；X为NH、COO或O；n＝1～10。
本发明第三个目的在于上述检测酪氨酸酶的化合物作为荧光探针用于酪氨酸酶的检测。
作为本技术方案的进一步优选的：检测酪氨酸酶的化合物作为荧光探针用于酪氨酸酶的检测的方法，包括如下步骤：
S1检测溶液配制：将1～5μM FluotyLu溶于PBS溶液或磷酸钠缓冲液中，pH为5.8～8；
S2标准曲线绘制：在S1所配制的检测溶液中滴加不同浓度的Tyr标准物溶液，在37℃条件下孵育时间3～5min，测定荧光发射光谱，绘制标准曲线；
S3 Tyr定量检测：将样品滴加至S1所配制的检测溶液，在37℃条件下孵育后测定荧光发射光谱，根据标准曲线进行计算Tyr含量。
作为本技术方案的进一步优选的：所述磷酸钠缓冲液(NaPi缓冲液)为0.1M，pH为6.8。
作为本技术方案的进一步优选的：所述S1中，pH为6～7。
作为本技术方案的更进一步优选的：所述S1中，pH为6.8。
作为本技术方案的进一步优选的：所述孵育时间应一致。
本发明第四个目的为一种检测酪氨酸酶的化合物作为荧光探针用于Fe3+的检测。
作为本技术方案的进一步优选的：用于Fe3+定性测定。
检测方法为将金属离子加入pH为5.8～8的FluotyLu的PBS溶液中，发生显著荧光淬灭的有Fe3+金属离子。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明利用萤火虫体内具有生物体系内稳定性好、生物兼容性优良的发光物质虫荧光素Luciferin与Tyr的催化氧化特性，设计合成了一种新型的检测酪氨酸酶的化合物FluotyLu，该化合物以虫荧光素为母体结构，邻二酚羟基为响应基团，二者之间以烷基链共价键合。
本发明提供的FluotyLu化合物有良好的稳定性。未添加Tyr的FluotyLu溶液在37℃孵育60min后，仅有约5％被降解或被氧化。
本发明提供的FluotyLu化合物具有检测Fe3+的价值。Tyr是含铜酶，在验证常见金属离子(Zn2+，Fe3+，Na+，K+，Ca2+，Mg2+)对FluotyLu检测Tyr的干扰能力中，除Fe3+外，FluotyLu化合物荧光性能无明显变化，加入Fe3+后荧光被显著淬灭，证明了Fe3+的良好的氧化性，也使得该化合物具有检测Fe3+的价值，然后在上述含有金属离子的混合物中加入Tyr，其特征荧光可以被显著淬灭。
附图说明
图1不同pH值的FluotyLu1溶液对Tyr检测活性的时间依赖的荧光光谱；
图2 Tyr添加前后FluotyLu1的荧光光谱及荧光快照图；
图3 5.7U Tyr和不同浓度的抑制剂(苯甲醛)与FluotyLu1(3μM,pH＝6.8)不同孵育时间在536nm处的抑制效果；
图4 FluotyLu1识别Tyr机理示意图；
图5 FluotyLu1添加Tyr后不同孵育时间的荧光光谱；
图6金属离子对FluotyLu1检测Tyr的干扰能力。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
部分检测方法：
生物发光光谱的测：在比色皿中，含有FluotyLu(终体积为1ml，小于0.05％作为助溶剂的DMSO)的0.1M NaPi缓冲液(pH6.8,1.97ml)与11.4U Tyr一起孵育5分钟，5mM MgSO4并制备2.6mM ATP；然后加入0.43μg/ml萤光素酶，并立即测定生物发光光谱。
荧光快照：将20μM FluotuLu与5.7U Tyr孵育5min。然后用数码相机(尼康D3300)拍摄图像。
实施例1FluotyLu1的合成
Figure BDA0002716427490000051
将化合物4(154mg，0.748mmol)和6-氨基-2-氰基苯并噻唑(化合物7，131mg，0.748mmol)溶解在MeCN(8ml)中。依次加入AcOH(400μl)和NaBH3CN(100mg,1.59mmol)。将混合物在室温下搅拌。10分钟后加入NaHCO3水溶液(30ml)，全部用乙酸乙酯(200ml)萃取。合并的有机层用H2O和盐水洗涤。将有机层用Na2SO4干燥并蒸发溶剂。残余物通过快速硅胶柱色谱法通过乙酸乙酯和正己烷的混合溶剂进行纯化得到化合物9。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ＝7.88(d,1H),6.84-6.80(m,2H),6.64(d,1H),6.59-6.57(m,2H),4.151(s,1H,NH),,3.19(t,2H),2.65(t,2H),1.94(quintet,2H),1.66(s,6H).
13CNMR(500MHz,DMSO-d6),δ＝150.51,147.22,145.37,139.35,135.30,128.02,125.23,120.98,117.94,117.75,114.86,109.01,108.28,99.48,42.52,32.83,30.68,25.98,
ESI-MS:366.2(M+H)
将化合物9(36.5mg，0.10mmol)加入到在氩气下装有搅拌棒的50ml圆底烧瓶中的10ml脱气的CH2Cl2中。溶解后，加入4ml三氟乙酸，0.2ml H2O和5滴三异丙基硅烷的混合物。将混合物在室温下在氩气下搅拌2小时，然后在室温下快速旋转蒸发器除去所有溶剂，并将混合物通过冻干机冻干12h。采用该方法合成化合物10，不需进行提纯分离，直接用含有该化合物的混合物进行最后一步缩合反应得到目标化合物，将含有化合物10的混合物溶于20ml甲醇中，氩气鼓泡15分钟，此时，将D-半胱氨酸盐酸盐一水合物(53mg,0.3mmol)溶于10ml水(Ar鼓泡)中，用0.5M碳酸钾将溶液调节至8。然后将该水溶液加入到化合物10的甲醇溶液中。将混合物在室温下搅拌。然后加入TFA酸化混合物，最后用洗脱剂A(H2O，0.1％TFA)和洗脱液B(90％MeCN，10％H2O，0.1％TFA)(A/B＝90/10)纯化立即进行。产量：80％
1H NMR(500MHz,CDCl3),δ＝7.63(d,J＝9.0Hz,1H),6.86(d,J＝2.2Hz,1H),6.75(dd,2H),6.46(m,2H),6.30(d,),5.20(t,)3.57(t,2H),3.47(m,3H),2.91(t,2H),2.48(t,2H),2.20(t,2H),1.66(m,2H).
13CNMR(500MHz,DMSO-d6),δ＝171.75,164.74,153.54,149.51,145.43,144.42,143.61,138.84,132.93,124.68,119.29,116.19,115.85,99.95,78.39,42.65,34.98,32.18,30.68.
HRMS:Caculated:429.0817Founded:430.0875,452.0676
实施例2 FluotyLu 2的合成
Figure BDA0002716427490000061
将2-氰基-6-羟基苯并噻唑(化合物6，市售，150mg，0.85mmol)置于DMF中，并将作为碱的K2CO3(352.4mg，2.55mol)加入到反应溶液中。在室温下搅拌混合物15分钟后，添加化合物11(1.15g，4.26mmol)，并将混合物温度加热至70℃过夜。在TLC监控下反应完成时，将反应混合物冷却后用乙酸乙酯稀释，并用饱和盐水洗涤3次。有机相用无水硫酸镁干燥，然后减压除去溶剂，并将粗固体产物通过快速硅胶柱色谱法通过乙酸乙酯和石油醚的混合溶剂进行纯化得到化合物12。
将化合物12(0.10mmol)加入到在氩气下装有搅拌棒的50ml圆底烧瓶中的10ml脱气的CH2Cl2中。溶解后，加入4ml三氟乙酸，0.2ml H2O和5滴三异丙基硅烷的混合物。将混合物在室温下在氩气下搅拌2小时，然后在室温下快速旋转蒸发器除去所有溶剂，并将混合物通过冻干机冻干12h。化合物13未进行分离，直接用含有该化合物的混合物进行最后一步缩合反应得到目标化合物，将含有化合物13的混合物溶于20ml甲醇中，氩气鼓泡15分钟，此时，将D-半胱氨酸盐酸盐一水合物(53mg,0.3mmol)溶于10ml水(Ar鼓泡)中，用0.5M碳酸钾将溶液调节至8。然后将该水溶液加入到化合物13的甲醇溶液中。将混合物在室温下搅拌。然后加入TFA酸化混合物，最后用洗脱剂A(H2O，0.1％TFA)和洗脱液B(90％MeCN，10％H2O，0.1％TFA)(A/B＝90/10)纯化立即进行。
实施例3FluotyLu1的性能
图1测定了不同pH值的FluotyLu1溶液对Tyr检测活性的时间依赖的荧光光谱。结果显示FluotyLu1在pH＝5.8的条件下其检测活性会被严重抑制；在pH＝8.0的条件下检测略有抑制影响，在pH值为6.8的PBS中的展现出良好的检测活性。
图2测定了FluotyLu1最大发射峰位于535nm，呈现特征的绿色荧光(荧光快照图中左侧比色皿)；滴加Tyr后，其荧光在2min内迅速降低并最终消失(荧光快照图中右侧比色皿)。可以推测邻二酚羟基基团(给电子基团)与荧光素结构之间存在光致电子转移过程(Photoinduced Electron Transfer(PET)Process)，在体系中加入Tyr后，其可特异性地将邻二酚羟基氧化为醌结构(吸电子基团)，体系内电子云排布改变后光致电子转移过程被抑制，荧光被淬灭，机理示意图见图4。为了进一步验证机理，进行了MBTH(3-甲基-2-苯并噻唑酮肼，与醌基团形成有色物质)颜色实验。结果表明FluotyLu1与MBTH混合孵育后颜色不发生变化，仍然显示FluotyLu1溶液的颜色淡黄色，MBTH与Tyr混合后显示的还是两者的无色透明溶液，FluotyLu1和Tyr混合后孵育5min后其溶液颜色从淡黄色变为淡紫色，FluotyLu1、Tyr和MBTH在室温下混合后孵育5分钟后溶液的颜色由淡黄色变为深桃红色。颜色的变化是由醌基团与MBTH之间的迈克尔加成形成引起的，证明了含醌结构的中间体的形成。
为了研究FluotyLu1筛选Tyr抑制剂的特性，将Tyr与抑制剂苯甲醛在室温下预孵育15分钟，然后与FluotyLu1(0-30min)孵育不同时间。如图3所示，5μM苯甲醛可显着抑制Tyr的催化作用；当与10uM苯甲醛预温育时，观察到几乎完全的抑制效果。结果再次证实FluotyLu1是Tyr检测的潜在探针。
将FluotyLu1与不同浓度Tyr(0U-0.57U)在37℃孵育60min，每间隔5min测定FluotyLu1荧光发射光谱。FluotyLu1与0.57U Tyr一起孵育，随着时间增加，其在535nm处的特征发射峰的荧光强度逐渐降低，60min后，约95％荧光被淬灭(见图5)。Tyr浓度增加，荧光淬灭速率增加，但其淬灭不是线性降低，未添加Tyr的FluotyLu1溶液在37℃孵育60min后，仅有约5％被降解或被氧化，表明FluotyLu1有良好的稳定性，添加Tyr后FluotyLu1的荧光淬灭是由于Tyr的加入导致而非其自身不稳定导致。根据FluotyLu1的剂量依赖性荧光光谱变化，计算得到了检测极限为0.06087M(PBS中)。
由于Tyr是含铜酶，为验证其他常见(Zn2+，Fe3+，Na+，K+，Ca2+，Mg2+)金属离子对FluotyLu1检测Tyr的干扰能力。从图6中可以看出，将上述金属离子加入到FluotyLu1的PBS溶液中，除Fe3+外，在535nm处的荧光强度不会发生任何变化。也就是说，加入Fe3+后荧光被显著淬灭，证明了Fe3+的良好的氧化性，也使得该化合物具有检测Fe3+的价值，然后在上述含有金属离子的混合物中加入Tyr，其特征荧光也可以被显著淬灭。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.一种检测酪氨酸酶的化合物，其结构通式如下：
Figure FDA0002716427480000011
其中，X为NH、COO或O；n＝1～10。
2.根据权利要求1所述的一种检测酪氨酸酶的化合物，其特征在于：所述化合物结构如下：
Figure FDA0002716427480000012
3.根据权利要求1所述的一种检测酪氨酸酶的化合物，其特征在于：所述化合物结构如下：
Figure FDA0002716427480000013
4.根据权利要求1所述的一种检测酪氨酸酶的化合物的制备方法，其特征在于：包括如下步骤；
S1：
Figure FDA0002716427480000014
S2：
Figure FDA0002716427480000015
其中，Y1为Br、CHO或COOH；Y2为OH或NH2；X为NH、COO或O；n＝1～10。
5.根据权利要求1所述的一种检测酪氨酸酶的化合物作为荧光探针用于酪氨酸酶的检测。
6.一种根据权利要求1所述的一种检测酪氨酸酶的化合物作为荧光探针用于酪氨酸酶的检测的方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1检测溶液配制：将1～5μM FluotyLu溶于PBS溶液或磷酸钠缓冲液中，pH为5.8～8；
S2标准曲线绘制：在S1所配制的检测溶液中滴加不同浓度的Tyr标准物溶液，在37℃条件下孵育时间3～5min，测定荧光发射光谱，绘制标准曲线；
S3 Tyr定量检测：将样品滴加至S1所配制的检测溶液，在37℃条件下孵育后测定荧光发射光谱，根据标准曲线进行计算Tyr含量。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于：所述S1中，pH为6.8。
8.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于：所述孵育时间应一致。
9.根据权利要求1所述的一种检测酪氨酸酶的化合物作为荧光探针用于Fe3+的检测。
10.一种根据权利要求1所述的一种检测酪氨酸酶的化合物作为荧光探针用于Fe3+的检测的方法，其特征在于：用于定性测定：将金属离子加入pH为5.8～8的FluotyLu的PBS溶液中，发生显著荧光淬灭的有Fe3+金属离子。
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