CN104804725A - 一种检测溶酶体中h2s的荧光探针、其合成方法及应用 - Google Patents
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Abstract
一种检测溶酶体中H2S的荧光探针、其合成方法及应用，该探针通过4-溴-1,8-萘酐与N-(2-氨基乙基）吗啉、叠氮化钠等反应得到。其合成方法简单、产率高，在不同pH条件有较好的化学稳定性，在与H2S反应后其荧光增强46余倍（～535nm）。与现有H2S探针相比，该探针不仅能够在细胞等复杂环境达到对H2S的特异性识别，同时能够大大降低副产物对细胞的损伤。本发明实现了在活细胞溶酶体内对H2S的检测，在生物及医学领域有极其重要的应用价值。
Description
技术领域
本本发明属于生物分析检测领域，具体涉及一种检测溶酶体中H2S的荧光探针、其合成方法及应用。
背景技术
近年来，活细胞荧光成像已经成为一种研究生物系统的有力工具。通过对亚细胞器的定位，荧光探针能够检测亚细胞器中的目标分析物，并能够在细胞特定区域揭示其不同的物理和化学性质。溶酶体是一种进行分解代谢的球形酸性细胞器。它们在通过吞噬、胞吞和自噬获得的生物大分子的降解和再循环过程中起着至关重要的作用。在很长一段时间里，溶酶体只是被视为细胞内的垃圾站。然而，现在溶酶体已经被公认为是参与了许多细胞内生理过程的高等细胞器。此外，他们还能够调控细胞内平衡。证据表明，溶酶体与很多疾病的发病机制息息相关，例如存储障碍、癌症、神经退行性疾病和心血管疾病。所以，实时地对溶酶体内分析物的检测与成像将帮助科研工作者更好地理解细胞内的反应动力学和机理等问题，从而进一步促进诊断和治疗相关疾病的发展。
硫化氢（H2S）现在被认为是继一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)之后，用来调控神经、心血管、免疫、内分泌、消化等系统的第三种气体递质。在哺乳动物中，硫化氢是在两种5’磷酸吡哆醛类的酶（胱硫醚-合成酶(CBS)and胱硫醚-裂解酶(CSE)）的作用下由L-半胱氨酸产生的。作为一种信号分子，它能够调节神经传导、放松平滑肌、调控胰岛素的释放，并能够参与炎症的调节。内源性硫化氢（H2S）也被认为与阿尔兹海默症、唐氏综合症、糖尿病和肝硬化等疾病有很大关系。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测溶酶体中H2S的荧光探针、其合成方法及应用，该探针在复杂环境下能够达到对硫化氢的特异性识别，其合成方法具有原料廉价易得、合成步骤简单、无需纯化、反应收率高等优点。
本发明提供了一种检测溶酶体中H2S的荧光探针，该荧光探针以1,8-萘酰亚胺为母体，叠氮为识别基团，吗啉环为定位基团，此化合物第一次由Shiyong Liu等合成,该荧光探针具有如下结构：
本发明还提供了一种所述荧光探针的合成方法，该方法具体步骤如下：
（1）中间体N-吗啉乙基4-溴-1,8-萘酰亚胺的合成：
4-溴-1,8-萘酐3g（10.8mmol）置于100mL单口瓶中，加入60mL乙醇，滴加N-(2-氨基乙基)吗啉2.5mL（19.0mmol），加热回流1-3h，重结晶得到灰白色固体3.23g，即为N-吗啉乙基4-溴-1,8-萘酰亚胺，产率77%；
（2）荧光探针的合成：
氩气保护下，在100mL单口瓶中加入N-吗啉乙基4-溴-1,8-萘酰亚胺2g(5.14mmol)与叠氮化钠350mg(5.38mmol)，加入N,N-二甲基甲酰胺（DMF）30mL，加热回流8h，反应液置于冰水中，析出大量固体，过滤得到土黄色固体1.7g，产率90%。
具体合成路线如下：
本发明提供的荧光探针应用于活细胞内H2S的检测及其在医学中对H2S的检测。
本发明具有以下特征：
本发明探针通过4-溴-1,8-萘酐与N-(2-氨基乙基）吗啉、叠氮化钠等反应得到。其合成方法简单、产率高，在不同pH条件有较好的化学稳定性，在与H2S反应后其荧光增强46倍（～535nm）。与现有H2S探针相比，该探针不仅能够在细胞等复杂环境达到对H2S的特异性识别，同时能够大大降低副产物对细胞的损伤。本发明实现了在活细胞溶酶体内对H2S的检测，在生物及医学领域有极其重要的应用价值。
附图说明
图1本发明荧光探针的结构式；
图2本发明荧光探针合成路线图；
图3本发明荧光探针核磁谱图氢谱；
图4本发明荧光探针核磁谱图碳谱；
图5为该荧光探针与不同浓度的NaHS作用后的荧光光谱图，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度，荧光探针的浓度为10μm，NaHS浓度为0-30eq；
图6为该荧光探针与20eq NaHS作用不同时间后的荧光光谱图，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度，荧光探针的浓度为10μm；
图7为该荧光探针（10μm）再加入不同离子（20eq）后的荧光变化情况，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度；（其中，(1)Blank;(2)Ag+;(3)K+;(4)Na+;(5)Mg2+;(6)Ca2+;(7)Zn2+;(8)F-;(9)Cl-;(10)Br-;(11)CH3COO-;(12)ClO4 -;(13)CO3 2-;(14)HCO3 -;(15)NO3 -;(16)NO2 -;(17)PO4 3-;(18)HPO4 2-;(19)H2PO4 -;(20)P2O74-;(21)SO42-;(22)HSO4 -;(23)SO3 2-;(24)S2O3 2-;(25)S2O4 2-;(26)S2O5 2-;(27)S2O8 2-;(28)SCN-;(29)N3 -;(30)Citrate;(31)Hydrogencitrate;(32)Dihydrogen citrate;(33)Ascorbic acid;(34)L-Cysteine;(35)Homocysteine;(36)L-Glutathione;(37)N-Acetyl-L-Cysteine;(38)HS-）；
图8为Hela细胞的共聚焦荧光成像图（*60）；在加入该荧光探针（5μm）孵育30分钟后，加入10eq NaHS，0，4，8，16，20（a,b,c,d,e）分钟后的荧光成像图，f为白场叠加图；
图9为Hela细胞的共聚焦荧光成像图（*60）；在加入该荧光探针（5μm）孵育30分钟后，再加入10eq NaHS与商业化Lyso-tracker后孵育20分钟后的荧光成像图；a为本探针荧光成像图，b为Lyso-tracker荧光成像图，c为a与b叠加图，d为细胞白场图，e为本探针与Lyso-tracker荧光强度剖面图，f为本探针与Lyso-tracker荧光强度相关系数图。
具体实施方式
下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。
实施例1：定位于溶酶体的H2S荧光探针的合成方法
(1)中间体N-吗啉乙基4-溴-1,8-萘酰亚胺的合成：
4-溴-1,8-萘酐3g（10.8mmol）置于100mL单口瓶中，加入60mL乙醇，滴加N-(2-氨基乙基)吗啉2.5mL（19.0mmol），加热回流1-3h，重结晶得到灰白色固体3.23g，产率77%。
(2)探针分子的合成：
氩气保护下，在100mL单口瓶中加入N-吗啉乙基4-溴-1,8-萘酰亚胺2g(5.14mmol)与叠氮化钠350mg(5.38mmol)，加入N,N-二甲基甲酰胺（DMF）30mL，加热回流8h，反应液置于冰水中，析出大量固体，过滤得到土黄色固体1.7g，产率90%。
该探针的氢谱和碳谱数据如下：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.63(d,J=12.0Hz,1H),8.57(d,J=8.0Hz,1H),8.44(d,J=8.0Hz,1H),7.74(d,J=8.0Hz,1H),7.47(t,J=8.0Hz,1H),4.33(t,J=6.0Hz,2H),3.68(t,J=4.0Hz,4H),2.70(t,J=6.0Hz,2H),2.59(4.0Hz,4H).
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ163.97,163.55,143.50,132.20,131.70,129.24,128.79,126.87,124.42,122.64,118.93,114.68,67.07,56.16,53.84,37.28.
将该探针溶于CH3CN溶液中，加入到CH3CN:HEPES（pH=7.4）(5:5)混合溶剂中，制配成10-6M的溶液，测试其荧光光谱变化。
实施例2：荧光探针对不同浓度硫化氢的响应情况
图5-图7中的各种数据都是在CH3CN和HEPES（pH=7.4）混合溶液（体积比5：5）中测试所得，激发波长为426nm。
图5中荧光探针浓度为10μm，当NaHS的浓度为0，10，20，30，40，50，60，70，80，90，100，120,140,160,180,200,250,300μm依次增加时，其荧光强度明显增加，增强了10倍。
实施例3：荧光探针对硫化氢在不同时间点的响应。
图6中荧光探针浓度为10μm，加入NaHS200μm后测量其0,2,4,6,8,10,12,14,16,18,20,25,30分钟后的荧光变化。随着时间的增加其荧光强度逐渐增加且当到20分钟荧光强度基本不再变化。
实施例4：荧光探针对硫化氢的选择性
图7中荧光探针浓度为10μm，加入其它离子（200μm）后荧光变化。结果显示只有当加入NaHS后其荧光强度明显增加，说明本探针能够对硫化氢进行特异性识别。（(1)Blank;(2)Ag+;(3)K+;(4)Na+;(5)Mg2+;(6)Ca2+;(7)Zn2+;(8)F-;(9)Cl-;(10)Br-;(11)CH3COO-;(12)ClO4 -;(13)CO3 2-;(14)HCO3 -;(15)NO3 -;(16)NO2 -;(17)PO4 3-;(18)HPO4 2-;(19)H2PO4 -;(20)P2O74-;(21)SO42-;(22)HSO4 -;(23)SO3 2-;(24)S2O3 2-;(25)S2O4 2-;(26)S2O5 2-;(27)S2O8 2-;(28)SCN-;(29)N3 -;(30)Citrate;(31)Hydrogen citrate;(32)Dihydrogencitrate;(33)Ascorbic acid;(34)L-Cysteine;(35)Homocysteine;(36)L-Glutathione;(37)N-Acetyl-L-Cysteine;(38)HS-）。
实施例5：荧光探针在细胞中对NaHS的时间响应。
图8中将Hela细胞（人类宫颈癌细胞）铺在培养皿中，皿中含有10%胎牛血清的DMEM培养基，在37℃和5%二氧化碳条件下培养48小时，向其中分别加入5μm的探针，孵育30分钟后，用吸管吸掉培养基，用PBS缓冲液洗涤细胞3次，加入2mL PBS缓冲液，再加入50μm的NaHS，在0,4,8,16,20分钟的共聚焦成像图显示，荧光强度逐渐增强，20分钟后强度基本不变。
实施例6：荧光探针与商业化Lyso-tracker在细胞中的共定位成像。
图9中将Hela细胞（人类宫颈癌细胞）铺在培养皿中，皿中含有10%胎牛血清的DMEM培养基，在37℃和5%二氧化碳条件下培养48小时，向其中分别加入5μm的探针，孵育20分钟后，再加入Lyso-tracker共同孵育10分钟，用吸管吸掉培养基，用PBS缓冲液洗涤细胞3次，加入2mL PBS缓冲液，再加入50μm的NaHS孵育20分钟。共聚焦显微镜采取510-559nm与561-610nm双通道采集，405/458nm与559nm激发。共聚焦成像图显示本探针与商业化的Lyso-tracker能够较好重叠，皮尔森系数达0.970。
Claims (3)
1.一种检测溶酶体中H2S的荧光探针，其特征在于：该荧光探针的结构如下：
2.一种权利要求1所述荧光探针的合成方法，其特征在于：该方法步骤如下：
（1）中间体N-吗啉乙基4-溴-1,8-萘酰亚胺的合成：
4-溴-1,8-萘酐3g置于单口瓶中，加入60mL乙醇，滴加N-(2-氨基乙基)吗啉2.5mL，加热回流1-3h，重结晶得到灰白色固体，即为N-吗啉乙基4-溴-1,8-萘酰亚胺；
（2）荧光探针的合成：
氩气保护下，在单口瓶中加入N-吗啉乙基4-溴-1,8-萘酰亚胺2g与叠氮化钠350mg，加入N,N-二甲基甲酰胺30mL，加热回流8h，反应液置于冰水中，析出大量固体，过滤得到土黄色固体，即为该荧光探针。
3.权利要求1所述荧光探针应用于活细胞内H2S的检测及其在医学中对H2S的检测。
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