CN109265429A - 萘衍生物类荧光染料及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
萘衍生物类荧光染料及其制备方法和用途,所述的萘衍生物类荧光染料具有通式I的结构。该类荧光染料在活细胞内具有较低的荧光背景,在与药物发生click反应后的活细胞中线粒体区域内具有较强的荧光信号,对活细胞内的含可发生click反应基团的具有很强的专一性标记。这类化合物具有一定水平的水溶性,同时具有良好的细胞膜通透性。本发明的这类化合物同时还具有较低的生物毒性、光毒性、光漂白性。其光谱范围与生物样品的光谱范围有足够大的差异。
Description
技术领域
本发明涉及一类含叠氮click反应基团的萘衍生物类荧光染料、其制备方法,以及利用该类荧光染料对活细胞或组织中药物的药效发挥、作用过程进行动态可视化检测。
背景技术
药物发现过程包括许多阶段,由于当前药物的研发成本居高不下,故此,新药研发迫切需要新技术、新理论。点击化学(Click chemistry),是通过小单元的拼接,来快速可靠地完成形形色色分子的化学合成。尤其强调开辟以碳-杂原子键(C-X-C)合成为基础的组合化学新方法,并借助这些反应(click反应)来简单高效地获得分子多样性。点击化学的概念对化学合成领域有很大的贡献,在药物开发和生物医用材料等的诸多领域中,它已经成为目前最为有用和吸引人的合成理念之一。反应原料易得,反应非常可靠,对氧气、水不敏感,产物立体选择性好、产率高,反应后处理及产物分离简单方便,一般不需要柱层析,反应副产物对环境友好;是click反应的最大优点。近年来,Click在药物发现的许多方面己得到实际的应用:运用“click”反应基团快速合成小分子化合物库,从中筛选出先导化合物、进行靶标导向的活性小分子合成以及在生物祸联技术等方面的应用。当前有两种类型的click”反应(click reaction)对药物发现的影响最大,受到人们特别的关注,这两种反应都是以叠氮基(azide)作为其中的反应官能团之一。
迄今为止,在生物体中“click”反应的应用系统主要限于细胞外靶标。其原因可能有几个:除了满足“click”化学物质的稳定性,毒性和化学选择性要求之外,细胞内活细胞标记需要能够通过生物膜和动力学的试剂,这些试剂能够快速标记,即使使用低浓度药剂。此外,实际的细胞内生物正交偶联方案需要结合荧光标签在共价反应时荧光标签增加的机制,以避免使累积但未反应的成像剂可视化(即“背景”)。这种可激活的“启动”探针将显着增加信号背景比,这与活细胞内靶成像特别相关。叠氮化物和炔烃基团之间的“click”反应最近已被用于标记细胞甚至动物体内的各种生物分子。叠氮化物和炔烃基团的小尺寸使得它们能够“结合”一些天然的合成酶,并因此被修饰已经报道的具有叠氮或炔反应性基团的氨基酸,核苷和单糖作为蛋白质,核酸和碳水化合物的标记残基。
发明内容
本发明的目的首先在于提供一类含有叠氮click反应基团的新的荧光染料化合物,所述的萘衍生物类荧光染料,具有通式I的结构
通式I中:
所述的M选自M1,M2和M3:
所述的R1和R2各自独立地选自:-CN、-NH2、-CH3、-OH、-(CH2)pCH3、-(CH2)pCOOH、-(CH2)pOH、-(CH2OCH2)pCOOH、-(CH2)pNH2、-(CH2OCH2)pOH、-CH[(CH2)pCOOH]2、-CH[(CH2)pOH]2、-CH[(CH2OCH2)pCOOH]2和-CH[(CH2OCH2)pOH]2,其中p是1-8的整数;
所述的R4和R5各自独立地选自:O、N、S和C;
所述的L1选自-(CH2)z-、-O(CH2)x-、-(CH2)xO-、-O(CH2)xO-、-O(CH2)xO(CH2)y-、-O(CH2)xO(CH2)yO-、-NH(CH2)x-、-(CH2)xNH-、-NH(CH2)xNH-、-NH(CH2)xNHC(O)-、-NH(CH2)xC(O)NH-、-NH(CH2)xNH(CH2)y-、-O(CH2)xNH-、-NH(CH2)xO-、-O(CH2)xO(CH2)yNH-、-NH(CH2)xO(CH2)yNH-和-O(CH2)xNH(CH2)yO-,其中z选自0-8的整数、x和y各自独立地选自1-8的整数;
所述的L2选自:-H、-C1-8烷基、-O(CH2)nCH3、-OH、-H、-Br、-Cl、-NH2、-O(CH2)nOH、-O(CH2)nNH2、-O(CH2)nNHCH3、-O(CH2)nN(CH3)2、-NH(CH2)nCH3、-NH(CH2)nNH2和-NH(CH2)nOH,其中n是1-8的整数。
本发明另一方面的目的在于提供上述本发明的萘衍生物类荧光染料的制备方法,该方法包括如下步骤:
1)4-溴苊醌与H-L1-N3及L2-Br按摩尔比1:1:1-1:6:6反应,制备化合物i;
反应温度为0-200℃,反应时间为1-36小时,反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、N,N-二甲基甲酰胺、丙酮、1,4-二氧六环、丙三醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物;
2)①当M=M1时,化合物i与化合物R1=C=R2按摩尔比1:1-1:5反应,制备化合物ii-1;
反应温度为0-150℃,反应时间为1-16小时,反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙酮、1,4-二氧六环、丙三醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物;
化合物ii-1与K2CO3按摩尔比10:1-1:1反应,制备化合物iii-1;
反应温度25-160℃,搅拌反应时间0.1-3h,反应溶剂选自二氯甲烷、无水乙醇、甲醇、丙酮、乙腈、1,4-二氧六环、丙三醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物;
②当M=M2时,化合物i与KHSO4、R5=C=R5按摩尔比5:1:10-5:1:5反应,制备化合物ii-2;
反应温度15-160℃,搅拌反应时间3-7h,反应溶剂选自二氯甲烷、无水乙醇、甲醇、丙酮、乙腈、1,4-二氧六环、丙三醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物。
③当M=M3时,化合物i与化合物R5=CH2按摩尔比1:2-1:10反应,制备化合物ii-3;
反应温度25-150℃,搅拌反应时间2-8h,反应溶剂选自二氯甲烷、无水乙醇、甲醇、丙酮、乙腈、1,4-二氧六环、丙三醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物。
上述关于本发明的萘衍生物类荧光染料的制备方法的描述中,各个取代基的定义,即对R1、R2、R3、R4、R5、L1、L2、和M的定义,均与上述对化合物的描述中的定义相同。
本发明所述的萘衍生物类荧光染料可以在细胞和组织内对能发生click反应的药物有强的荧光响应信号,可用于特异专一性的比例标记和定量、实时动态检测活细胞活组织中药物发挥作用过程的小分子荧光染料。并且这类荧光染料具有良好的水溶性,以及优秀的细胞膜通透性。同时还具有较低的生物毒性、光毒性、光漂白性。其光谱范围与生物样品的光谱范围有足够大的差异,可以避免生物自发荧光的产生。
因此,本发明再一方面的目的在于提供所述的含有叠氮click反应基团的萘衍生物类荧光染料在制备生物检测与标记试剂中的用途。尤其是应用于目标物为活细胞或肿瘤组织中的能发生click反应的药物活动的实时动态监测与标记试剂。
附图说明
本发明附图11幅:
图1是本发明的萘衍生物类荧光染料结构通式I。
图2是化合物A1的水溶性检测试验结果。
图3是化合物A1活细胞内成像试验的测定结果。
图4是化合物A1在对正常及肿瘤细胞内成像对比试验。
图5是化合物A2活细胞内成像试验的测定结果。
图6是化合物A2和已发生click反应的染料体系在活细胞内对比成像结果。
图7是荧光染料化合物A3的水溶性检测试验结果。
图8是化合物A3活细胞内成像试验的测定结果。
图9是化合物A3和已发生click反应的染料体系在活细胞内对比成像结果。。
图10是化合物A4的水溶性检测试验结果。
图11是化合物A4在对正常及肿瘤细胞内成像对比试验。
具体实施方式
除另有说明外,本文中使用的术语具有以下含义。
本文中使用的术语“烷基”包括直链烷基、支链烷基和环烷基。如提及具体烷基名称,如“丙基”、“异丙基”或“环丙基”,特指具体碳原子数目的直连烷基、支链烷基和环烷基。如概括形式的描述,如“C1-8烷基”,则包括碳原子数满足要求的所有基团,“C1-8烷基”包括但不限于C1-6烷基、C1-5烷基、甲基、乙基、正丙基、异丙基、叔丁基、环丙基、环丁基、甲基环丙基等。类似的规则也适用于本说明书中使用的其它基团。
本发明首先提供的是一类含有叠氮click反应基团的萘衍生物类荧光染料,所述的萘衍生物类荧光染料具有通式I的结构
所述通式I中的M选自M1,M2和M3,M通过虚线键与通式I相连,优选M是M1或者M2
上述M1~M3中,所述及的R1和R2各自独立地选自-CN、-NH2、-CH3、-OH、-(CH2)pCH3、-(CH2)pCOOH、-(CH2)pOH、-(CH2OCH2)pCOOH、-(CH2)pNH2、-(CH2OCH2)pOH、-CH[(CH2)pCOOH]2、-CH[(CH2)pOH]2、-CH[(CH2OCH2)pCOOH]2和-CH[(CH2OCH2)pOH]2;优选的实施方式中,所述的R1和R2各自独立地选自-CN、-CH3、-OH、-NH2、-(CH2)nCH3、-(CH2)pCOOH、-(CH2)pOH、-(CH2OCH2)pCOOH、-(CH2)pNH2、-(CH2OCH2)pOH、-CH[(CH2)pCOOH]2、-CH[(CH2)pOH]2和-CH[(CH2OCH2)pCOOH]2;更加优选地,所述的R1和R2各自独立地选自-CN、-NH2、-CH3、-OH、-(CH2)nCH3、-(CH2)pCOOH、-(CH2)pOH、-(CH2OCH2)pCOOH、-(CH2)pNH2和-(CH2OCH2)pOH;最优选地,所述的R1和R2各自独立地选自-CN、-NH2、-CH3、-OH和-(CH2)pCOOH;上述基团中,所述的p是1-8的整数,优选P是1-4的整数。
上述M1~M3中,所述的R4和R5各自独立地选自O、N、S。作为优选的实施方式,所述的R4和R5各自独立地是O或S;最优选R4和R5均为O。
上述通式I中,所述的L1优选自-(CH2)z-、-O(CH2)x-、-(CH2)xO-、-O(CH2)xO-、-O(CH2)xO(CH2)y-、-O(CH2)xO(CH2)yO-、-NH(CH2)x-、-(CH2)xNH-、-NH(CH2)xNH-、-NH(CH2)xNHC(O)-、-NH(CH2)xC(O)NH-、-NH(CH2)xNH(CH2)y-、-O(CH2)xNH-、-NH(CH2)xO-和-O(CH2)xO(CH2)yNH-;更为优选地,所述的L1选自-(CH2)z-、-O(CH2)x-、-O(CH2)xNH-、-O(CH2)xO-、-O(CH2)xO(CH2)y-、-O(CH2)xO(CH2)yO-、-NH(CH2)x-、-(CH2)xNH-、-NH(CH2)xNH-、-NH(CH2)xNHC(O)-和-NH(CH2)xC(O)NH-;最为优选地,所述的L1选自-(CH2)z-、-O(CH2)x-、-NH(CH2)x-、-O(CH2)xO-、-O(CH2)xNH-和-NH(CH2)xNH-;在上述关于L1的基团描述中,所述的z选自0-8的整数,优选0-4的整数,最优选0-2的整数;所述的x选自1-8的整数,优选1-4的整数,最优选1-2的整数;所述的y选自1-8的整数,优选1-4的整数,最优选1-2的整数。
上述通式I中,所述的L2优选自-H、-C1-8烷基、-O(CH2)nCH3、-OH、-H、-Br、-Cl、-NH2、-O(CH2)nOH、-O(CH2)nNH2、-O(CH2)nNHCH3、-O(CH2)nN(CH3)2、-NH(CH2)nCH3和-NH(CH2)nNH2;更为优选地,所述的L2选自-H、-C1-4烷基、-O(CH2)nCH3、-OH、-H、-Br、-Cl、-NH2、-O(CH2)nOH、-O(CH2)nNH2、-O(CH2)nNHCH3和-O(CH2)nN(CH3)2;最优选地,所述的L2选自-H、-C1-2烷基、-O(CH2)nCH3、-OH、-H、-Br、-Cl和-NH2。上述关于L2的基团描述中,所述的n是1-8的整数,优选1-4的整数,最优选1-2的整数。
以上所描述的各优选技术特征可以相互组合,所得技术方案应当完全包括于本发明所述及的范围。可举例的技术方案之一,关于本发明所述的萘衍生物类荧光染料,其仍然具有通式I的结构,其中:
所述的M选自M1或M2;
所述的R1和R2各自独立地选自-CN、-NH2、-CH3、-OH和-(CH2)pCOOH;p是1-4的整数;
所述的R4和R5各自独立地是O或S;
所述的L1选自-(CH2)z-、-O(CH2)x-、-NH(CH2)x-、-O(CH2)xO-、-O(CH2)xNH-和-NH(CH2)xNH-,其中z是0、1或2,x和y各自独立地选自1或2;
所述的L2选自-H、-C1-2烷基、-O(CH2)nCH3、-OH、-H、-Br、-Cl和-NH2,n是1或2。
更为具体的事实方式中,本发明所述的萘衍生物类荧光染料选自A1、A2、A3和A4:
本发明另一方面,本发明提供了上述本发明含叠氮click反应基团的萘类衍生荧光染料的制备方法,包括如下步骤:
1)4-溴苊醌与H-L1-N3及L2-Br按摩尔比1:1:1-1:6:6反应,制备化合物i;
反应温度为0-200℃,反应时间为1-36小时,反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、N,N-二甲基甲酰胺、丙酮、1,4-二氧六环、丙三醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物;
具体实施方式中,所述步骤1)的反应温度优选15-180℃,更优选20-180℃,最优选25-130℃;所述的反应时间优选1-23小时,更优选1-22小时,最优选1-20小时;所述的反应溶剂优选二氯甲烷、乙醇、N,N-二甲基甲酰胺、丙酮、1,4-二氧六环、丙三醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物,更优选二氯甲烷、乙醇、N,N-二甲基甲酰胺、1,4-二氧六环、丙三醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物,最优选乙醇、N,N-二甲基甲酰胺、丙三醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物;
2)①-1当M=M1时化合物i与化合物R1=C=R2按摩尔比1:1-1:5反应,制备化合物ii-1;
反应温度为0-150℃,反应时间为1-16小时,反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙酮、1,4-二氧六环、丙三醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物;
具体实施方式中,所述步骤①-1的反应温度优选5-100℃,更优选10-80℃,最优选15-50℃;所述的反应时间优选1-16小时,更优选1-11小时,最优选1-5小时;所述的反应溶剂优选二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙酮、丙三醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物,更优选二氯甲烷、甲醇、丙酮、丙三醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物,最优选二氯甲烷、甲醇、丙酮、丙三醇、乙酸乙酯;化合物i与化合物R1=C=R2进行反应优选摩尔比1:1-1:4.5,更优选1:1-1:4,最优选1:1-1:3。
①-2化合物ii-1与化合物K2CO3按摩尔比10:1-1:1反应,制备化合物iii-1;
反应温度25-160℃,搅拌反应时间0.1-3h,反应溶剂选自二氯甲烷、无水乙醇、甲醇、丙酮、乙腈、1,4-二氧六环、丙三醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物。
具体实施方式中,所述步骤①-2的反应温度优选30-160℃,更优选30-150℃,最优选30-140℃;所述的反应时间优选0.1-2.5小时,更优选0.2-2小时,最优选0.4-1小时;所述的反应溶剂优选二氯甲烷、无水乙醇、甲醇、丙酮、乙腈、1,4-二氧六环、丙三醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物,更优选二氯甲烷、无水乙醇、甲醇、丙酮、乙腈、1,4-二氧六环,最优选无水乙醇、甲醇、丙酮、乙腈;化合物ii与化合物K2CO3进行反应优选摩尔比8:1-1.5:1,更优选7.5:1-2:1,最优选7:1-2:1。
②当M=M2时化合物i与化合物KHSO4、R5=C=R5按摩尔比5:1:10-5:1:5反应,制备化合物ii-2;
反应温度15-160℃,搅拌反应时间3-7h,反应溶剂选自二氯甲烷、无水乙醇、甲醇、丙酮、乙腈、1,4-二氧六环、丙三醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物。
具体实施方式中,所述步骤②的反应温度优选25-100℃,更优选30-80℃,最优选35-50℃;所述的反应时间优选3.2-6小时,更优选3.5-5小时,最优选4-5小时;所述的反应溶剂优选二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙酮、丙三醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物,更优选二氯甲烷、甲醇、丙酮、丙三醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物,最优选二氯甲烷、甲醇、丙酮、丙三醇、乙酸乙酯;化合物i与KHSO4、R5=C=R5进行反应优选摩尔比5:1:8-5:1:7,更优选5:1:6.8-5:1:5.9,最优选5:1:5.8-5:1:5。
③当M=M3时,化合物i与化合物R5=C-H按摩尔比1:2-1:10反应,制备化合物ii-3:
反应温度20-240℃,搅拌反应时间2-17h,反应溶剂选自二氯甲烷、无水乙醇、甲醇、丙酮、乙腈、1,4-二氧六环、丙三醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物。
具体实施方式中,所述步骤③的反应温度优选35-200℃,更优选50-180℃,最优选75-150℃;所述的反应时间优选2.3-16小时,更优选3-14小时,最优选5-11小时;所述的反应溶剂优选二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙酮、丙三醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物,更优选二氯甲烷、甲醇、丙酮、丙三醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物,最优选二氯甲烷、甲醇、丙酮、丙三醇、乙酸乙酯;化合物i与化合物R5=C-H进行反应优选摩尔比1:1-1:8,更优选1:2-1:6,最优选1:3-1:5。
对本发明采用上述方法合成的萘衍生物类荧光染料化合物,采用核磁共振谱图或质谱来确认其结构。
本发明所述的含叠氮click反应基团的萘衍生物类荧光染料具备以下优点:所述染料化合物引入了能发生click反应的结合位点,提高了染料对活细胞和组织中有click反应结合位点的药物的检测和识别的专一性、特异性。
所述染料化合物具有优异的光学性能,应用于生物样品成像时具有低的生物光漂白、光损伤和生物毒性。
所述染料化合物毒副性小,原料易得,结构简单,易于制备,易产业化。
鉴于此,本发明所述的荧光染料可用于活细胞中特定药物的标记。除了以本文中所述的形式直接用于活细胞中特定药物的标记,含有本发明的荧光染料化合物的组合物也可以用于活细胞中特定药物的标记和实时动态监测。所述组合物中应当包含有效量的本发明所提供的荧光染料化合物之一。另外,还可以包含生物样品染色所需要的其它组分,例如溶剂、pH调节剂等。这些组分都是本行业内已知的。上述组合物可以以水溶液形式存在,或者可以以临用前用水配制为溶液的其它合适形式存在。
本发明还提供使用上述本发明的荧光染料化合物标记和动态实时监测活细胞中特定药物的方法,该方法包括使所述化合物与生物样品接触的步骤。本文中使用的术语“接触”可包括在溶液或固相中接触。
下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明,但不以任何方式限制本发明。
实施例1
制备化合物A1,采用如下合成路线:
(1)化合物1-2的合成
将20mmol化合物1-1和10mmolKHSO4加入到含有10ml乙醇溶液的圆底烧瓶中。反应加热回流持续反应18h后停止得化合物1-2粗产品,收率63%。
(2)化合物A1的合成
将20mmol化合物1-2、30mmol乙醇胺和30mmol叠氮钠加入到含有10mlDMF的圆底烧瓶,梯度温度25℃到60℃,反应16h后停止,倒入装有冰水的烧杯中,抽滤得析出物,为化合物A1,产率59%。1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.85(t,2H),7.45–7.39(m,2H),7.34–7.27(m,2H),5.36(m,1H),3,16(m,2H)。
实施例2
化合物A1的水溶性检测试验
使用上述实施例合成的化合物A1加入到水中,测定在不同浓度(1,3,5.8,6.7,7.8,8.9,9.6μM)A1水溶液的最大吸收波长下吸光度。测试结果为图2,结果显示:当化合物A1浓度为8.9μM时,吸光度值未发生偏移,即化合物A1在水中的溶解度为8.9μM。图2为不同浓度条件下化合物A1的最大吸收波长下吸光度。所用仪器分别是Agilent 8453紫外分光光度计
实施例3
化合物A1活细胞内成像试验
使用上述实施例合成的化合物A1,以终浓度为27.0μM的A1孵育CHO细胞,在37℃,5%CO2孵育1.5小时。然后,激光共聚焦成像。选取代表性区域,用油镜(60×)观察,重复三次。结果如图3所示,表明:化合物A1在CHO细胞胞质中的有强荧光信号,图3的荧光采集波段为560-650nm。
实施例4
化合物A1对正常及肿瘤细胞内成像对比试验
使用上述实施例合成的化合物A1,以终浓度为27.0μM的A1孵育HPEG2/CHO细胞,在37℃,5%CO2孵育1.5小时。然后,激光共聚焦成像。选取代表性区域,用油镜(60×)观察,重复三次。实验结果(如图4)表明:化合物A1在CHO细胞胞质中的有强荧光信号(实验组图4a),在HPEG2中荧光较弱且扩散在整个细胞内(实验组图4b),图4的荧光采集波段为570-650nm。
实施例5
制备化合物A2:
(1)化合物2-2的合成
将30mmol化合物2-1、30mmol乙二胺和30mmol叠氮钠加入到含有10ml DMF的圆底烧瓶中。反应加热回流持续反应18h后停止。混合物倒入冰水中,沉淀析出,抽滤得黄褐色粉末粗产品,化合物2-2,收率70%。
(2)化合物A2的合成
将20mmol化合物2-2和40mmol溴液加入到圆底烧瓶中,梯度温度从30℃升到60℃,60℃下反应2h,将水加入反应体系中,减压蒸馏后抽滤。得亮黄色粉末状粗产品,化合物3,收率50%。1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.87-7.89(m,2H),7.74(s,1H),7.68(s,1H),3.16(m,2H)。
实施例6
荧光染料化合物A2活细胞内成像试验
使用上述实施例合成的荧光染料化合物A2,以终浓度为27.0μM的A2孵育CHO细胞,在37℃,5%CO2孵育1.5小时。然后,激光共聚焦成像。选取代表性区域,用油镜(60×)观察,重复三次。实验结果(如图5)表明:荧光染料化合物A2在CHO细胞胞质中的有强荧光信号,图5的荧光采集波段为560-650nm。
实施例7
荧光染料化合物A2和已发生click反应的染料体系在活细胞内对比成像试验
分别使用上述实施例合成的荧光染料化合物A2及A2与药物进行click结合的染料体系,以终浓度为30.0μM的A2及染料体系孵育HepG2细胞,在37℃,5%CO2孵育30分钟激光共聚焦成像。选取代表性区域,用油镜(60×)观察,重复三次。荧光采集波段为565-620nm和570-685nm。激发波长为567nm和572nm。
实验结果如图6所示,表明:荧光染料化合物A2对照组HepG2细胞胞质中在565-620nm(对照组图6a)处有荧光信号但荧光弱且扩散范围较广。实验组与药物进行click结合的染料体系HepG2细胞胞质中在570-685nm(实验组图6b)处的有明显且强度较大的荧光,且线粒体处荧光及其明显。此实验结果表明已进行click反应的A2染料体系在活细胞内对比荧光染料化合物A2有较大的荧光变化,且A2的确能够和含有click反应基团的药物结合且进行示踪。
实施例8
制备探针化合物A3:
(1)化合物3-2的合成
将20mmol化合物1和30mmol叠氮钠加入到含有10ml DMF的圆底烧瓶中,反应加热回流持续反应18h后停止。混合物倒入冰水中,沉淀析出,抽滤得黄褐色粉末粗产品,化合物2,收率70%。
(2)化合物3-3的合成
将20mmol化合物2和20mmol丙二腈,在烧杯中用二氯甲烷溶解。通过柱层析法进行反应,反应物烘干得橘红色固体粗产品化合物3,收率为85%。
(3)化合物A3的合成
将20mmol化合物3和4mmol无水碳酸钾加入到含有10ml乙腈的圆底烧瓶中,反应加热回流持续反应0.2-1h后停止。旋干得紫红色结晶粗产品,化合物A3,收率45%。1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.87-7.89(m,2H),7.74(s,1H),7.68(s,1H),7.49(s,1H)
实施例9
化合物A3的水溶性检测试验
使用上述实施例合成的化合物A3加入到水中,测定在不同浓度(1,2,3,3.9,4.8,5.9,6.6μM)A3水溶液的最大吸收波长下吸光度。测试结果为图7,结果显示:当化合物A3浓度为5.9μM时,吸光度值未发生偏移,即化合物A3在水中的溶解度为5.9μM。图7为不同化合物A3浓度的最大吸收波长下吸光度。所用仪器分别是Agilent 8453紫外分光光度计
实施例10
化合物A3活细胞内成像试验
使用上述实施例合成的化合物A3,以终浓度为30.0μM的A3分别孵育HepG2细胞,在37℃,5%CO2孵育1.5小时。然后,激光共聚焦成像。选取代表性区域,用油镜(60×)观察,重复三次。实验结果如图8,表明:荧光染料化合物A3在HepG2细胞胞质中的有强荧光信号。图8的荧光采集波段为560-650nm。
实施例11
化合物A3和已发生click反应的染料体系在活细胞内对比成像试验
分别使用上述实施例合成的化合物A3及A3与药物进行click结合的染料体系,以终浓度为30.0μM的A3及染料体系孵育HepG2细胞,在37℃,5%CO2孵育30分钟激光共聚焦成像。选取代表性区域,用油镜(60×)观察,重复三次。荧光采集波段为565-620nm和570-685nm。激发波长为567nm和572nm。
实验结果如图6所示,表明:荧光染料化合物A3对照组HepG2细胞胞质中在565-620nm(对照组图9a)处有荧光信号但荧光弱且扩散范围较广。实验组与药物进行click结合的染料体系HepG2细胞胞质中在570-685nm(实验组图9b)处的有明显且强度较大的荧光,且线粒体处荧光及其明显。此实验结果表明已进行click反应的A3染料体系在活细胞内对比化合物A3有较大的荧光变化,且A3的确能够和含有click反应基团的药物结合且进行示踪。
实施例12
制备化合物A4:
(1)化合物4-2的合成
将20mmol化合物4-1和30mmol叠氮钠加入到含有10ml DMF的圆底烧瓶中,反应加热回流持续反应18h后停止。混合物倒入冰水中,沉淀析出,抽滤得黄褐色粉末粗产品,化合物4-2,收率70%。
(2)化合物A4的合成
将20mmol化合物4-2和20mmol过氧化氢,加入到含有10ml无水乙醇的圆底烧瓶中,反应加热回流持续反应6h后停止。过滤,收集滤液干燥后,得有金属光泽的结晶状固体,化合物A4,收率39%。1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.49(s,1H)7.87-7.89(m,2H),7.74(s,1H),7.68(s,1H),5.17(s,1H),2.45(m,3H)。
实施例13
化合物A4的水溶性检测试验
使用上述实施例合成的荧光染料化合物A4加入到水中,测定在不同浓度(9,10,10.8,11.7,12.8μM)A4水溶液的最大吸收波长下吸光度。测试结果为图10,结果显示:当化合物A4浓度为11.7μM时,吸光度值未发生偏移,即荧光染料化合物A4在水中的溶解度为11.7μM。图10为不同探针A4浓度的最大吸收波长下吸光度。所用仪器分别是Agilent 8453紫外分光光度计。
实施例14
化合物A4对正常及肿瘤细胞内成像对比试验
使用上述实施例合成的化合物A4,以终浓度为30.0μM的A4孵育HPEG2/CHO细胞,在37℃,5%CO2孵育1.5小时。然后,激光共聚焦成像。选取代表性区域,用油镜(60×)观察,重复三次。实验结果表明:荧光染料化合物A4在CHO细胞胞质中的有强荧光信号(实验组图11a),在HPEG2中荧光较弱且扩散在整个细胞内(实验组图11b),图11的荧光采集波段为570-650nm。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明,不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干简单推演或替换,都应当视为属于本发明的保护范围。作为荧光染料是本发明新化合物的一种用途,不能认定本发明的化合物仅用于荧光染料,对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说,在基于本发明化合物用作荧光染料的相同作用机理的考虑下,还可以做出若干简单推理,得出本发明的化合物的其他应用用途,都应当视为属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.萘衍生物类荧光染料,具有通式I的结构
通式I中:
所述的M选自M1,M2和M3:
所述的R1和R2各自独立地选自:-CN、-NH2、-CH3、-OH、-(CH2)pCH3、-(CH2)pCOOH、-(CH2)pOH、-(CH2OCH2)pCOOH、-(CH2)pNH2、-(CH2OCH2)pOH、-CH[(CH2)pCOOH]2、-CH[(CH2)pOH]2、-CH[(CH2OCH2)pCOOH]2和-CH[(CH2OCH2)pOH]2,其中p是1-8的整数;
所述的R4和R5各自独立地选自:O、N、S和C;
所述的L1选自-(CH2)z-、-O(CH2)x-、-(CH2)xO-、-O(CH2)xO-、-O(CH2)xO(CH2)y-、-O(CH2)xO(CH2)yO-、-NH(CH2)x-、-(CH2)xNH-、-NH(CH2)xNH-、-NH(CH2)xNHC(O)-、-NH(CH2)xC(O)NH-、-NH(CH2)xNH(CH2)y-、-O(CH2)xNH-、-NH(CH2)xO-、-O(CH2)xO(CH2)yNH-、-NH(CH2)xO(CH2)yNH-和-O(CH2)xNH(CH2)yO-,其中z选自0-8的整数、x和y各自独立地选自1-8的整数;
所述的L2选自-H、-C1-8烷基、-O(CH2)nCH3、-OH、-H、-Br、-Cl、-NH2、-O(CH2)nOH、-O(CH2)nNH2、-O(CH2)nNHCH3、-O(CH2)nN(CH3)2、-NH(CH2)nCH3、-NH(CH2)nNH2和-NH(CH2)nOH,其中n是1-8的整数。
2.根据权利要求1所述的萘衍生物类荧光染料,其特征在于,所述的L1选自:-(CH2)z-、-O(CH2)x-、-O(CH2)xNH-、-O(CH2)xO-、-O(CH2)xO(CH2)y-、-O(CH2)xO(CH2)yO-、-NH(CH2)x-、-(CH2)xNH-、-NH(CH2)xNH-、-NH(CH2)xNHC(O)-和-NH(CH2)xC(O)NH-;其中z选自0-4的整数、x和y各自独立地选自1-4的整数。
3.根据权利要求1所述的萘衍生物类荧光染料,其特征在于,所述的L2选自-H、-C1-8烷基、-O(CH2)nCH3、-OH、-H、-Br、-Cl、-NH2、-O(CH2)nOH、-O(CH2)nNH2、-O(CH2)nNHCH3、-O(CH2)nN(CH3)2、-NH(CH2)nCH3和-NH(CH2)nNH2,其中n是1-8的整数。
4.根据权利要求1所述的萘衍生物类荧光染料,其特征在于,所述的R1和R2各自独立地选自-CN、-CH3、-OH、-NH2、-(CH2)nCH3、-(CH2)pCOOH、-(CH2)pOH、-(CH2OCH2)pCOOH、-(CH2)pNH2、-(CH2OCH2)pOH、-CH[(CH2)pCOOH]2、-CH[(CH2)pOH]2和-CH[(CH2OCH2)pCOOH]2,其中p是1-8的整数。
5.根据权利要求4所述的萘衍生物类荧光染料,其特征在于,所述的R1和R2各自独立地选自-CN、-NH2、-CH3、-OH、-(CH2)nCH3、-(CH2)pCOOH、-(CH2)pOH、-(CH2OCH2)pCOOH、-(CH2)pNH2和-(CH2OCH2)pOH,其中p是1-4的整数。
6.根据权利要求1所述的萘衍生物类荧光染料,其特征在于,所述的R4和R5各自独立地选自O、N和S。
7.根据权利要求1所述的萘衍生物类荧光染料,其特征在于:
所述的M选自M1或M2;
所述的R1和R2各自独立地选自-CN、-NH2、-CH3、-OH和-(CH2)pCOOH;p是1-4的整数;
所述的R4和R5各自独立地是O或S;
所述的L1选自-(CH2)z-、-O(CH2)x-、-NH(CH2)x-、-O(CH2)xO-、-O(CH2)xNH-和-NH(CH2)xNH-,其中z是0、1或2,x和y各自独立地选自1或2;
所述的L2选自-H、-C1-2烷基、-O(CH2)nCH3、-OH、-H、-Br、-Cl和-NH2,其中n是1或2。
8.权利要求1所述的萘衍生物类荧光染料,选自A1、A2、A3和A4:
9.权利要求1所述的萘衍生物类荧光染料的制备方法,包括如下步骤:
1)4-溴苊醌与H-L1-N3及L2-Br按摩尔比1:1:1-1:6:6反应,制备化合物i;
反应温度为0-200℃,反应时间为1-36小时,反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、N,N-二甲基甲酰胺、丙酮、1,4-二氧六环、丙三醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物;
2)①当M=M1时,化合物i与化合物R1=C=R2按摩尔比1:1-1:5反应,制备化合物ii-1;
反应温度为0-150℃,反应时间为1-16小时,反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、甲醇、丙酮、1,4-二氧六环、丙三醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物;
化合物ii-1与K2CO3按摩尔比10:1-1:1反应,制备化合物iii-1;
反应温度25-160℃,搅拌反应时间0.1-3h,反应溶剂选自二氯甲烷、无水乙醇、甲醇、丙酮、乙腈、1,4-二氧六环、丙三醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物;
②当M=M2时,化合物i与KHSO4、R5=C=R5按摩尔比5:1:10-5:1:5反应,制备化合物ii-2;
反应温度15-160℃,搅拌反应时间3-7h,反应溶剂选自二氯甲烷、无水乙醇、甲醇、丙酮、乙腈、1,4-二氧六环、丙三醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物;
③当M=M3时,化合物i与化合物R5=CH2按摩尔比1:2-1:10反应,制备化合物ii-3;
反应温度25-150℃,搅拌反应时间2-8h,反应溶剂选自二氯甲烷、无水乙醇、甲醇、丙酮、乙腈、1,4-二氧六环、丙三醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物。
10.权利要求1所述的萘衍生物类荧光染料在制备生物检测与标记试剂中的用途。
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