CN103435625B - 红光发射罗丹明类离子荧光探针及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一类红光发射罗丹明类离子荧光探针，其为通式（Ⅰ）化合物或为通式（Ⅱ）化合物。此外，本发明还公开了该荧光探针的应用。其可以用来对体系、细胞以及组织内的离子浓度进行测定，特别是用来对体系、细胞及组织内的钙离子或镁离子浓度进行测定。

Description

红光发射罗丹明类离子荧光探针及其应用

技术领域

本发明涉及一类新化合物，具体涉及荧光染料领域，特别涉及一类红光发射罗丹明类离子荧光探针及其应用，特别是其在生物体系内的应用。

背景技术

钙离子在细胞的生命活动中起着重要作用，是机体各项生理活动不可缺少的重要离子，许多生理生化过程如信号传递、肌肉收缩、物质代谢、细胞正常代谢、细胞分化和增殖等都必须有Ca²⁺参与。随着人们对于钙代谢、钙通道、钙受体及其调控，钙的转运和利用以及某些疾病发生和发展关系的认识越来越深入，细胞内Ca²⁺浓度在时间和/或空间的变化已经成为细胞学、细胞生物学、神经科学研究的共同课题。因此，需要对钙离子浓度在细胞或亚细胞空间上进行更加准确的测定和获得更加合适的响应时间，而这些都是在不影响系统的生物学过程的情况下进行的。目前为止，所谓的荧光钙离子探针可以很好的满足这种需求，有一系列经过特殊设计的荧光染料，这些荧光染料通过螯合钙离子的同时产生荧光光谱性质的变化，这些变化可以是染料荧光强度或波长的改变，也可以是二者的同时改变。典型的，光谱的改变与钙离子浓度呈线性关系，因此可以对钙离子的浓度进行定量。

得益于Tsien及其合作者的开创性工作，目前已经产生了一系列具有不同荧光性质和钙离子解离常数的荧光探针。到目前已有三代钙荧光探针：第一代是20世纪80年代初合成的quin-2（Biochemistry,19:2396-2404）；后又合成了能用于双波长比率测定的第二代探针，即Indo-1和Fura-2(J.Biol.Chem.260:3440-3450；U.S.Pat.No.4,603,209)，这两代钙离子探针均需要紫外光激发；后来又合成了由可见光激发的第三代荧光探针，即Fluo-3(J.Biol.Chem.264:8179-8184)；后来又合成了Rhod-2(U.S.Pat.No.5,049,673)，以及分子探针公司的钙绿-1和钙绿-2(U.S.Pat.No.5,453,517)，这几种荧光探针的发射波长大多位于蓝光，绿光到黄光区域。

目前商业化的荧光探针仍然具有缺点：最主要的问题是它们的激发和发射波长相对较短。当使用短波长光（例如紫外光）进行激发时，许多细胞组分会发射蓝色荧光，这要归咎于所谓的自发荧光或背景荧光。紫外光激发还有可能引起细胞损伤，例如对DNA的破坏，因此对于活细胞探测，紫外光激发的染料并不合适。而可见光激发Ca²⁺荧光探针与紫外激发的Ca²⁺荧光探针相比，具有很多优点：可以被大多数基于激光的设备有效激发，包括激光扫描共聚焦显微镜和流式细胞仪；可以有效避免由于紫外光激发而引起的对细胞的损伤和细胞自发荧光的干扰；细胞光损伤小，光散射较弱；当染料吸收很强时，可以减少染料的浓度，因此可以减少对活细胞的毒性；与光活化探针（锁笼）和其他UV光吸收的探针具有很好的相容性，可以增加多参数测定的选择性；随着钙离子浓度增加，荧光强度显著增加，可以更敏锐的检测Ca²⁺浓度的瞬间变化，在很多情况下，随着钙离子浓度增加，荧光强度变化越大，越有利于钙离子瞬变的检测。基于以上几点，可见光类的钙离子荧光探针Fluo-3和Rhod-2是对Indo-1和Fura-2的重大改进。其后开发的CalciumOrange和CalciumCrimson更是将Fluo-3和Rhod-2的光谱扩展到橙色光到红色光区域(U.S.Pat.No.5,453,517)。U.S.Pat.No.5,453,517描述的CalciumOrange，CalciumCrimson和其他类似的钙离子荧光探针与以前的钙离子荧光探针（例如Fura-2,Indo-1,Fluo-3和Rhod-2）具有根本的不同，在以前的钙离子荧光探针设计中，钙离子螯合剂部分直接与发色团部分相连。离子螯合剂部分与发色团直接相连的结果是对离子的螯合产生非常好的光谱响应。然而，CalciumOrange和CalciumCrimson的设计是将钙离子螯合剂部分与发色团通过共价连接基团相连。金属离子螯合剂与发色团的非直接相连使光谱对钙离子的螯合响应较低。

总之，虽然钙离子荧光探针的开发已走过了30年的历程，但仍然需要开发出具有高度灵敏性同时具有长波吸收和长波发射的新型钙离子荧光探针，同时需要开发出一系列具有不同钙离子解离常数的荧光探针，从而满足体系、细胞以及组织内钙离子测定的需求。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一是提供一种新型化合物（即通式（Ⅰ）化合物），此化合物可作为非透膜荧光探针；

本发明要解决的技术问题之二是提供另一种新型化合物（即通式（Ⅱ）化合物），此化合物可作为透膜荧光探针；

本发明要解决的技术问题之三是提供通式（Ⅰ）化合物的应用，即其作为荧光探针探测样品中钙离子或镁离子的方法。

本发明要解决的技术问题之四是提供通式（Ⅱ）化合物的应用，即其作为荧光探针探测活细胞样品内钙离子或者镁离子的方法。

本发明提供一类可作为远红外激发，远红外发射的荧光探针，此荧光探针以BAPTA或APTRA为螯合部分，以扩展的罗丹明环为发色团；本发明提供具有不同解离常数的离子荧光探针以满足体系、细胞以及组织内离子测定的需求；本发明提供一种用于细胞内离子水平测定的可透膜的离子荧光探针；本发明提供一种水溶性较好的离子荧光探针以很好的改善在细胞内离子测定时存在的区室化问题；本发明提供一种简便快速合成此类荧光探针的方法以满足商业化的需求。

在详细描述本发明之前，描述各种术语用来帮助理解：

术语“共价连接基团”或“L”此处是指单一共价键或者由1-30个非氢原子（可以选择C,N,O,S和P）组成的一系列稳定的共价键，且含有一个化学活性基团与目标分子相连。共价连接基团可以与其他成分组成结合物，例如目标部分为抗体、配体、生物分子、药物和其类似物。

术语“载体分子”或“W”此处指本发明化合物与生物活性成分或非生物活性成分之间形成共价键。这些成分包括但不仅限于：氨基酸，多肽，蛋白质，多糖，核苷，核苷酸，寡核苷酸，核酸，半抗原，脂素，药物，激素，脂质，脂质体，葡聚糖，合成聚合物，聚合微粒，生物细胞，病毒或者其组合形式。

术语“亲和力”此处是指两个分子之间的结合力，例如螯合剂与金属离子之间或者阳离子和阴离子之间的结合力。

术语“体系”此处是指以水为主要成分并且保留水的特性的溶液体系，此处，水溶液体系可以是指在水中加入其他一些溶剂，但水仍是主要成分。

术语“细胞透膜性”是指可以穿过活细胞的细胞壁，可以在本发明化合物上连接亲脂性基团，从而穿过细胞膜而进入活细胞。一旦进入细胞内，亲脂性基团被水解形成带电基团从而使本发明化合物保留在活细胞内。特别有用的亲脂性基团包括乙酰氧甲基（AM）酯和乙酸乙酯，一旦进入细胞内，他们就会被非特异性酯酶水解成为带电分子。

术语“探测响应”此处指检测样品中由于金属离子的存在而引起的可被肉眼或仪器检测到的直接或间接的信号。典型的，探测响应为光学信号，可以是波长的分布变化，吸收或荧光强度，光散射变化，荧光量子产率，荧光寿命，荧光偏振，激发或发射波长的位移或者是以上参数的混合变化。然而荧光强度增强和/或荧光激发或发射的变化是最有用的。基于离子结合而引起荧光探针的荧光改变一般是由于荧光团的基态或激发态变化，在离子结合位点的电子密度变化，与目标金属离子结合后产生荧光淬灭，或有这些或其他因素的组合引起的。

术语“荧光团”此处是指化合物固有荧光或与生物活性成分或金属离子或经酶新陈代谢后与产物（例如隐色团）结合而产生的荧光变化。可以对荧光团进行修饰从而改变其溶解性，光谱性质或物理性质。大部分已知的荧光团包括但不仅限于香豆素，吖啶，呋喃，1-二甲氨基萘-5-磺酰，菁，芘，萘，苯并呋喃，喹啉，喹唑啉酮，吲哚，苯并恶唑，和呫吨（包括荧光素，罗丹明等）等。荧光团可以进行修饰从而增强溶解性，活细胞透膜性，改变吸收和发射光谱。

术语”金属螯合离子”或“目标金属离子”此处是指可以与现有的BAPTA或APTRA及其类似物，衍生物结合的任何金属离子。典型的，这些金属离子都具有相对的生理学或营养学意义，例如：Na⁺，K⁺,Zn²⁺，Mg²⁺，Fe²⁺和Ca²+。条目所述金属离子也可以是Ga³⁺，Tb³⁺，La³⁺，Pb^{2 +}，Hg²⁺，Cd²⁺，Cu²⁺，Ni²⁺，Co²⁺，Mn²⁺，Ba²⁺和Sr²⁺。

术语“活性基团”此处是指可以与其他化学基团反应形成共价键的基团，例如在合成的反应条件下具有共价活性，一般代表可以与其它底物连接的点。活性基团只是一部分，例如羧酸或者琥珀酰亚胺酯，本发明中所指活性基团是可以与其他不同化合物形成共价连接的官能团。活性基团一般包括亲核，亲电和光活化基团。

术语“样品”此处是指包含金属离子的任何材料。典型的，样品是活细胞或者由内生主细胞蛋白构成的生物流体或者食品或者环境样品（例如水样品）。样品可以为水溶液，细胞培养物，固体或半固体表面的固着物，例如聚丙烯酰胺凝胶，模印迹或微矩阵。

本发明描述了一类新型化合物，这类新型化合物可作为离子浓度测定的荧光探针使用，此荧光探针包含与金属离子选择性结合的配体部分(金属离子螯合剂)和荧光团两部分，并且直接将配体部分与荧光团部分相连，当探针的配体部分与某种金属离子结合时，引起荧光团的荧光参数的探测响应，依据这种关联，可以获得待测离子的信息。因此，本发明荧光探针可以用来对金属离子进行检测，定性和定量。与目前存在的类似探针相比，本发明探针的一个显著优点是具有更长的吸收波长和荧光发射波长，典型的，本发明探针发射红色到深红色荧光；本发明具有更长波长的探针可以使生物体系的自发荧光最小化；另外，红色或深红色荧光可以与其它更短波长的荧光探针联合使用，例如与绿色或蓝色荧光探针联合使用用于多色荧光显影。

本发明也描述了此类荧光探针的合成和使用方法。

金属离子螯合剂

本发明描述了金属离子螯合剂，是可以与金属离子结合或螯合的任何部分。典型的，结合或螯合的结果是引起荧光信号的变化。本发明所描述的金属离子是指但并不仅限于Zn²⁺，Mg²⁺，Fe²⁺和Ca²⁺，Ga³⁺，Tb³⁺，La³⁺，Pb²⁺，Hg²⁺，Cd²⁺，Cu²⁺，Ni²⁺，Co²⁺，Mn²⁺，Ba²⁺和Sr²⁺。一般而言，此金属离子一般是具有生理学意义的金属离子，包括Zn²⁺，Mg²⁺，Fe²⁺和Ca²⁺。更进一步而言，此金属离子为Ca²⁺。目前钙离子测定中最值得信赖的螯合剂均为多聚羧酸类螯合剂，BAPTA或APTRA及其类似物均为多聚羧酸类螯合剂，因此可以使用BAPTA或APTRA及其类似物作为金属离子螯合部分，BAPTA或APTRA及其类似物也可以用来螯合上述其它离子。

此处作为金属螯合部分的”BAPTA”为1，2-双（2-氨基苯氧基）乙烷-N,N,N′,N′-四乙酸或其类似物，衍生物（例如酯，酰胺，氨基甲酸等），变体和结合物，所有金属或非金属盐，部分成盐和水合物。其基本结构如下：

此处作为金属螯合部分的”APTRA”为2-氨基苯酚-N,N,O-三乙酸或其类似物，衍生物（例如酯，酰胺，氨基甲酸等），变体和结合物，所有金属或非金属盐，部分成盐和水合物。其基本结构如下：

此外，作为金属螯合部分也可以具有如下结构：

也可以是其类似物，衍生物（例如酯，酰胺，氨基甲酸等），变体和结合物，所有金属或非金属盐，部分成盐和水合物。

此处BAPTA或APTRA上的苯环可以被一个或多个基团取代，从而改变化合物与金属离子的亲和力，溶解性，化学活性，光谱性质或其他物理性质，但至少在一个位置上被发色团取代。典型的，一般选取N的对位作为发色团的取代位置，发色团可以是直接或间接对苯环进行取代；而乙烯基二氧（-OCH₂CH₂O-）上的氢原子也可以被取代，取代基可以是共价连接剂L（L中可以含有活性基团）L-活性基团或L-W,“W”此处指本发明化合物与生物活性成分或非生物活性成分之间形成共价键。这些成分包括但不仅限于：氨基酸，多肽，蛋白质，多糖，核苷，核苷酸，寡核苷酸，核酸，半抗原，脂素，药物，激素，脂质，脂质体，葡聚糖，合成聚合物，聚合微粒，生物细胞，病毒或者其组合形式。

多聚羧酸化合物可以透膜酯的形式进入细胞，在细胞内，酯被酶水解为多聚羧酸，也可以通过显微注射的方式将多聚羧酸导入细胞，多聚羧酸是无法透膜的，因此，一旦进入细胞内，多聚羧酸离子无法透膜。当多聚羧酸与钙离子结合后，羧基部分与钙结合后会使C-N键发生旋转，从而使氮原子上的孤对电子与共轭结构脱离，就会导致荧光团强度和/或光谱发生改变。依据此种关联，就可以测定细胞内钙离子的浓度。

荧光团

本发明的荧光团部分是与目标金属离子相关可以产生直接或间接探测信号的报告分子，其结果是可以用来探测，监控和定量样品中的目标金属离子。具体而言，本发明采用5环或7环罗丹明类化合物作为荧光团。

因此，从一方面而言，本发明非透膜荧光探针可以用结构通式（Ⅰ）表示：

其中，R₂,R₃,R₄互相独立，R₂,R₃,R₄为氢，氟，氯，溴，碘，氰基，羟基，硝基,SO₃ ^-，C₁-C₁₈的烷基，或C₁-C₁₈的烷氧基；或者R₂,R₃,R₄为被氟，氯，溴，碘，羧酸，羧酸盐，SO₃ ^-，羧酸酯取代的C₁-C₁₈的烷基或C₁-C₁₈的烷氧基；

R₅为甲基,-CH₂CO₂ ^-,-L-W或

或-CH₂CONR¹R²,其中R¹，R²互相独立，R¹，R²是氢，C₁-C₁₈烷基，C₁-C₁₈烷氧基，或者是被氟，氯，溴，碘，羧酸，羧酸盐，SO₃ ^-，羧酸酯取代的C₁-C₁₈烷基或C₁-C₁₈烷氧基，或者R¹，R²互相连接，直接相连或通过氧，氮，硫，硅相连形成饱和或者不饱和五元环或六元环；

R₉-R₁₂互相独立，R₉-R₁₂为氢，氟，氯，溴，碘，氰基，羟基，硝基,磺酸基，C₁-C₁₈的烷基，或C₁-C₁₈的烷氧基；或者R₉-R₁₂为被氟，氯，溴，碘，羧酸，羧酸盐，磺酸基，羧酸酯取代的C₁-C₁₈的烷基或C₁-C₁₈的烷氧基;或R₉-R₁₂中的任意一个为-L-W;

R₆为甲基或–CH₂SO₃ ^-;

R₇为氢，甲基，乙基，或者与R₈连接形成饱和或者不饱和的五元环或六元环或为-L-W；

R₈为氢，氟，氯，溴，碘，氰基，SO₃ ^-，C₁-C₁₈烷基，或C₁-C₁₈烷氧基；或者，R₈为被氟，氯，溴，碘，羧酸，羧酸盐，SO₃ ^-或者羧酸C₁-C₆酯取代的C₁-C₁₈烷基或C₁-C₁₈烷氧基；或者R₈为与R₇连接形成饱和或者不饱和五元环或六元环；

L为共价连接基团；

W为载体分子，优选葡聚糖；

每个M均为互相独立的阳离子，选自氢，钾，钠，铵，锂或铯，d用以平衡化合物所带负电荷所需M的数目。

上述C₁-C₁₈的烷基是指具有1-18个碳原子的直链或支链的烷基，例如：甲基、乙基、丙基、异丙基、叔丁基、庚基、辛基等等。

上述C₁-C₁₈的烷氧基是指具有1-18个碳原子的直链或支链的烷氧基，例如：甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、叔丁氧基、庚氧基、辛氧基等等。

上述氰基，分子式为：-CN。

上述羟基，分子式为：-OH。

上述硝基，又称为硝酰基，分子式为：-NO₂。

上述磺酸基,也称为磺基,分子式为-SO₃H。

上述羧酸，分子式为：-COOH。

上述羧酸盐，例如：-COOK。

上述羧酸C₁-C₆酯，具有1-6个碳原子的羧酸酯（羧酸酯的分子式为：RCOOR’），例如：COOEt。

作为优选的技术方案，R₂,R₃,R₄全部为氢;

R₅为甲基，-CH₂CO₂ ^-或

或

此处，R₉,R₁₁,R₁₂互相独立，R₉,R₁₁,R₁₂为氢，氟或氯，R₁₀为氢，甲基，硝基，氟或氯。

作为优选的技术方案，R₇为甲基或乙基，R₈为氢。

作为优选的技术方案，R₇和R₈连接在一起形成六元环。

细胞非透膜的荧光探针以这种方式存在，可以用来检测环境中的金属离子浓度，比用来检测活细胞内金属离子的浓度要方便很多，细胞非透膜性的荧光探针也可以是细胞透膜性荧光探针负载进入细胞然后经细胞内非特异性酯酶水解后的结果。细胞透膜性的荧光探针经过此种方式转化为细胞非透膜性的荧光探针，因此可以保留在细胞内而用来测定细胞内金属离子的浓度。

另一方面，本发明透膜的可用于活细胞中离子浓度检测的荧光探针具有如下结构通式（Ⅱ）：

其中，取代的R₂,R₃,R₄互相独立，R₂,R₃,R₄为氢，氟，氯，溴，碘，氰基，羟基，硝基，C₁-C₁₈的烷基，或C₁-C₁₈的烷氧基，或者R₂,R₃,R₄为被氟，氯，溴，碘，羧酸，羧酸盐，羧酸酯取代的C₁-C₁₈的烷基或C₁-C₁₈的烷氧基;

R₅为甲基，-CH₂CO₂R₁或

或-CH₂CONR¹R²,其中R¹，R²互相独立，是氢原子，C₁-C₁₈烷基，C₁-C₁₈烷氧基，被氟，氯，溴，碘，羧酸，羧酸盐，羧酸酯取代的C₁-C₁₈烷基或C₁-C₁₈烷氧基；或者R¹，R²互相连接，直接相连或者通过氧，氮，硫，硅相连形成饱和或者不饱和五元环或六元环；

R₉-R₁₂互相独立，为氢，氟，氯，溴，碘，氰基，羟基，硝基，C₁-C₁₈的烷基，或C₁-C₁₈的烷氧基，或者R₉-R₁₂为被氟，氯，溴，碘，羧酸，羧酸盐，羧酸酯取代的C₁-C₁₈的烷基或C₁-C₁₈的烷氧基;

R₆为甲基;

R₇为氢，甲基，乙基，或者与R₈连接形成饱和或者不饱和的五元环或六元环；

R₈为氢，氟，氯，溴，碘，氰基，C₁-C₁₈烷基，或C₁-C₁₈烷氧基；或者R₈为被氟，氯，溴，或碘取代的C₁-C₁₈的烷基或C₁-C₁₈的烷氧基；或者R₈为与R₇连接形成饱和或者不饱和五元环或六元环；

R₁选自甲基、乙基或乙酰氧甲基；

Ψ为阴离子，用以平衡化合物所带正电荷。

上述C₁-C₁₈的烷基是指具有1-18个碳原子的直链或支链的烷基，例如：甲基、乙基、丙基、异丙基、叔丁基、庚基、辛基等等。

上述C₁-C₁₈的烷氧基是指具有1-18个碳原子的直链或支链的烷氧基，例如：甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、叔丁氧基、庚氧基、辛氧基等等。

上述氰基，分子式为：-CN。

上述羟基，分子式为：-OH。

上述硝基，又称为硝酰基，分子式为：-NO₂。

上述磺酸基,也称为磺基,分子式为-SO₃H。

上述羧酸，分子式为：-COOH。

上述羧酸盐，例如：-COOK。

上述羧酸C₁-C₆酯，具有1-6个碳原子的羧酸酯（羧酸酯的分子式为：RCOOR’），例如：COOEt。

此处羧酸可以使用乙酰氧甲基（AM）进行修饰，使羧基部分不含电荷，从而可以使本发明荧光探针穿透细胞膜进入细胞，即R₁为-CH₂OCOCH₃，R₁也可以为甲基,乙基。

对于金属离子螯合剂APTRA及其类似物而言，苯环上的取代R₂,R₃,R₄互相独立，可以为氢原子，卤素（此处卤素是指氟原子，氯原子，溴原子，碘原子），氰基，羟基，硝基，亚硝基，硫醚，磺酰氯；C₁-C₁₈的烷基，C₁-C₁₈的烷氧基，或者被为卤素，羧酸，羧酸盐，羧酸酯取代的C₁-C₁₈的烷基或C₁-C₁₈的烷氧基，-L,-L-活性基团，-L-W。典型的，R₂,R₃,R₄为卤素或氢原子，进一步而言，R₂,R₃,R₄优选为氢。

R₅优选为甲基，-CH₂CO₂R₁或

或

此处，R₉,R₁₁,R₁₂互相独立，为氢，氟或氯，R₁₀为氢，甲基，硝基，氟或氯；

R₁为乙酰氧甲基。

对于金属离子螯合剂BAPTA及其类似物而言，苯环上的取代R₂,R₃,R₄在APTRA中已经做过定义，进一步而言，R₉-R₁₂互相独立，可以为氢原子，磺酸基，磺酰基，氨基，氰基，羟基，硝基，烷基或卤素（此处卤素是指氟原子，氯原子，溴原子，碘原子），C₁-C₁₈的烷基，C₁-C₁₈的烷氧基，或者被卤素，羧酸，羧酸盐，羧酸酯取代的C₁-C₁₈的烷基或C₁-C₁₈的烷氧基，-L,-L-活性基团，-L-W。典型的，R₉,R₁₁,R₁₂优选氢原子或烷基，更进一步而言，R₉,R₁₁,R₁₂优选氢原子；R₁₀优选为卤素，硝基，氨基，氢原子,烷基,-L-活性基团，或-L-W，更进一步而言，烷基优选甲基，卤素优选氟原子，氯原子。

本发明的荧光团为5环或者7环罗丹明类化合物，如结构通式（Ⅰ）和结构通式（Ⅱ）中所显示，其中R₆为烷基，取代烷基或–CH₂SO₃ ^-，进一步讲，当螯合剂部分为非透膜性自由酸时，R₆为烷基，取代烷基或–CH₂SO₃ ^-，典型的，R₆优选烷基或–CH₂SO₃ ^-，烷基优选为甲基；而当螯合剂部分为透膜酯时，R₆为烷基，烷基优选甲基；

R₇为氢原子，烷基或者与R₈连接形成饱和或者不饱和的五元环或六元环或为-L-W；进一步而言，R₇优选氢原子，甲基，乙基或与R₈连接形成饱和或者不饱和的五元环或六元环；R₇更优选为甲基或乙基。

R₈可以为氢原子，氟原子，氯原子，溴原子，碘原子，氰基，SO₃ ^-，或是C₁-C₁₈烷基，C₁-C₁₈烷氧基，此处C₁-C₁₈烷基，C₁-C₁₈烷氧基可进一步被氟原子，氯原子，溴原子，碘原子，羧酸，羧酸盐，SO₃ ^-或羧酸C₁-C₆酯取代；或者与R₇连接形成饱和或者不饱和五元环或六元环；进一步来讲，R₈优选为氢原子，或者与R₇连接形成饱和或者不饱和五元环或六元环；

对于整个荧光探针分子而言，结构通式（Ⅰ）中的dM，其中每个M均为互相独立的阳离子，选自氢，钾，钠，铵，锂或铯，d用以平衡化合物所带负电荷所需M的数目。结构通式（Ⅱ）中的，Ψ是阴离子，用于平衡染料所带正电荷的阴离子。Ψ是具有生物学相容性的，合适的阴离子包括但不限于:卤素离子、硫酸根、磷酸根、高氯酸根、四氟硼酸根和六氟磷酸根。典型的，阴离子是氯离子或碘离子（只是举例）。

合成

本发明提供一种合成本发明化合物的方法，本发明化合物的制备方法大致分为两个部分。首先需要形成金属离子螯合剂部分，然后需要对金属离子螯合剂部分进行修饰从而形成活性官能团，活性官能团与发色团部分连接从而形成整个化合物。

如结构通式（Ⅰ）和结构通式（Ⅱ）所述的金属离子螯合剂部分，苯环氮和氧的不同性质的取代对最终螯合剂的螯合能力具有重要影响，因此，对于不同的目标金属离子，选择合适的取代基很有必要。BAPTA具有很好的钙离子选择性，其苯环氮原子被溴乙酸甲酯取代，而APTRA具有很好的镁离子选择性，其氮原子和氧原子均被溴乙酸甲酯取代。选择合适的取代前体对于制备得到具有不同解离常数的目标化合物非常重要。

很多文献对不同金属离子的螯合剂的选择及合成均有描述，U.S.Pat.No.4,603,209;U.S.Pat.No.5,049,673;U.S.Pat.No.4,849,362;U.S.Pat.No.5,453,517;U.S.Pat.No.5,501,980;U.S.Pat.No.5,459,276;U.S.Pat.No.5,501,980;U.S.Pat.No.5,459,276;U.S.Pat.No.5,516,911;这些专利中描述的方法可能适合用来合成本发明化合物中的螯合部分中间体。

金属离子螯合剂BAPTA四甲酯的合成在文献（G.Grynkiewicz，M.Poenie和R.Y.Tsien1985，J.Biol.Chem.260,3440-3450）中已经有过描述，可以再此基础上进行适当修饰而用来合成本发明中的螯合剂BAPTA部分;金属离子螯合剂APTRA三甲酯的合成在文献（BertMetten，MarioSmet,NoelBoens，WimDehaen，synthesis2005，11，1838-1844）中已经有过描述，可以在此基础上进行适当修饰而用来合成本发明中的螯合剂APTRA部分。

咕吨类染料（例如荧光素和罗丹明）的合成的通用方法是将2当量间苯二酚（用于荧光素类的合成）和间氨基酚（用于罗丹明合成）与含羰基部分例如邻苯二甲酸衍生物缩合得到相应的咕吨类染料。或者，以前文献报道中合成咕吨类染料的方法是2当量间苯二酚（用于荧光素类的合成）和间氨基酚（用于罗丹明合成）与1当量的醛基化合物在强酸性环境下缩合，例如可以在70%硫酸溶液中回流得到二氢咕吨染料中间体，然后接着氧化得到最后染料，不幸的是，本方法在制备本发明化合物时无法制备得到最终产物。传统的基于咕吨染料的钙离子探针是通过咕吨酮与溴取代BAPTA叔丁酯使用丁基锂在低温下缩合制备得到，同样的，此种方法无法适用本发明化合物，因为具有不同取代的咕吨酮很难制备得到。因此，本发明开发出一种新的制备此种染料的方法。

荧光团前体与甲酰基取代的螯合中间体缩合后一般要经过氧化步骤。得到的二氢缩合产物可以先经过分离或者直接用于氧化过程，可以选择空气氧化或使用典型的化学氧化剂（例如DDQ或四氯苯醌）氧化，对于一些发色团而言，在酸性条件下氧化会得到加强。这些温和的氧化条件适用于不同取代的荧光探针。

缩合后金属离子螯合部分的修饰与已知荧光探针的修饰方法类似。例如将硝基还原为氨基，氨基可以独立存在也可以直接或间接与载体分子相连，例如将葡聚糖通过共价连接基团与氨基相连，或者将羰基转化为氰基，或者将羧酸转化为酯，包括乙酰氧甲基酯。本发明荧光探针得到的盐或平衡离子也可以通过离子交换树脂，选择析出和碱化这些已知方法转化为其他盐。

缩合后罗丹明环的修饰也有很多已知方法，例如磺化，磺酰氯化，磺酰氯化后也可以与L，L-活性基团，L-W连接，或者使用合适的卤化剂进行卤化，例如使用液溴进行溴化。罗丹明不饱和的环也可以进行氢化而得到饱和环衍生物。

罗丹明类荧光探针合成中可能使用氧化剂或还原剂。合适的还原剂包括硼氢化合物，氢化铝化合物，氢气/催化剂，连二亚硫酸盐。还原剂或氧化剂的选择必须考虑螯合部分的相关取代基。适合二氢罗丹明的氧化剂包括氧气/催化剂，一氧化氮，过亚硝酸盐，重铬酸盐，三苯基碳正离子，DDQ和四氯苯醌。二氢罗丹明也可以通过电化学或酶氧化，包括过氧化物酶与过氧化物或一氧化氮的联合氧化。

应用

本发明描述的荧光探针包括了对样品中离子浓度的探测和/或定量。可以用于监测生物体系内与钙离子脉冲相关的信号传导。一般而言，本发明探针螯合剂部分含有游离酸或以盐形式，可用于细胞外空间，细胞浆，植物和动物的脉管组织，生物学流体例如血液和尿，发酵介质，环境样品例如水，土壤，废水和海水以及化学反应中离子水平的测定。另一方面，本发明探针螯合剂部分以酯形式存在，例如AM酯，可以用来监测细胞内钙离子或镁离子。光学探针对于金属离子的定性或定量具有重要作用，特别对于活细胞而言。荧光探针可以连续或者间断检测活细胞或者含有金属离子的溶液的光学信号。

在本发明的另一方面，提供一种应用上述通式（Ⅰ）化合物作为荧光探针探测样品中钙离子或镁离子的方法，包含以下步骤：

1)样品与权利要求1所述的通式（Ⅰ）化合物接触；

2)用合适波长的光源激发样品，并且；

3)探测样品的荧光发射。

作为优选的技术方案，所述通式（Ⅰ）化合物，通式（Ⅰ）中，R₂,R₃,R₄全部为氢;R₅为甲基，-CH₂CO₂ ^-或

或

此处，R₉,R₁₁,R₁₂互相独立，为氢，氟或氯，R₁₀为氢，甲基，硝基，氟或氯。

作为优选的技术方案，步骤1）中，如果钙离子或镁离子位于样品的细胞内，则所述通式（Ⅰ）化合物通过显微注射导入细胞。

作为优选的技术方案，步骤1）中，如果钙离子或镁离子位于样品的细胞外，通式（Ⅰ）化合物直接与样品接触。

作为优选的技术方案，步骤3）中，所述探测是在荧光显微镜，酶标仪或流式细胞仪设备上进行的。

在本发明的另一方面，提供一种应用上述通式（Ⅱ）化合物作为荧光探针探测活细胞样品内钙离子或者镁离子的方法，包含以下步骤：

1)使细胞样品与权利要求5所述通式（Ⅱ）化合物接触；

2)培养细胞样品至少5分钟；

3)使用合适波长的光源激发样品，并且；

4)探测样品的荧光发射。

作为优选的技术方案，所述通式（Ⅱ）化合物，通式（Ⅱ）中，R₂,R₃,R₄全为氢；

R₅为甲基，-CH₂CO₂R₁或

或

此处，R₉,R₁₁,R₁₂互相独立，为氢，氟或氯，R₁₀为氢，甲基，硝基，氟或氯；

R₁为乙酰氧甲基。

作为优选的技术方案，所述细胞样品为细胞培养物，或细胞组织培养物。

作为优选的技术方案，步骤4）中，所述探测是在荧光显微镜，酶标仪或流式细胞仪设备上进行的。

使用本发明所述荧光探针，根据细胞内金属离子的变化来检测荧光强度的变化是较为灵敏的方案。因此，应该选用合适的激发波长来观测离子浓度变化而引起荧光读数的变化情况。一般而言，探针需要在其吸收峰波长附近进行激发并且其荧光需要控制在最大发射峰波长附近。许多生物学组织，例如植物组织和脑组织，倾向于具有固有或背景荧光或者叫做自发荧光。典型的自发荧光在蓝色到绿色波长区域或者从400nm到500nm的波长范围。因为本发明探针具有红色和深红色荧光区域，因此可以是自发荧光的干扰最小化。

具体而言，本发明化合物如结构通式（Ⅰ）所述的荧光探针可直接与目标样品接触或通过显微注射入细胞从而形成标记混合物；然后将标记混合物培养足够长的时间从而使目标离子与本发明化合物充分结合，从而形成培养混合物；使用合适的光源对培养混合物进行激发，得到激发混合物；记录激发混合物的荧光发射，通过记录荧光发射与此化合物光谱性质的比较，以及与离子浓度之间的关联，就可以计算出离子浓度的相关信息。

本发明化合物如结构通式（Ⅱ）所述的钙离子荧光探针，可以使用已知的方法见Tsienetal.,J.CELLBiol.94,925(1982)和Tsienetal.,Nature,295,68(1982)。大体而言，细胞用本发明荧光探针的乙酰氧甲酯进行培养，然后洗涤。典型的，荧光探针的负载效率一般在10%-30%，最终荧光探针的负载水平大约为10-50μM。细胞用本发明所述荧光探针负载以后，细胞内钙离子的浓度就可以确定。

探测钙离子方法的选择，是随着荧光探针性质和体系、组织和细胞的性质而变化的，优选的探测技术是在诸如荧光显微镜，酶标仪和流式细胞仪设备上进行的。

附图说明

图1为本发明实施例3制得的化合物3在各种钙离子浓度下的荧光光谱图；

图2为本发明实施例3制得的化合物3的钙离子滴定实验数据示意图；

图3为本发明实施例2制得的化合物2在各种钙离子浓度下的荧光光谱图；

图4为本发明实施例2制得的化合物2的钙离子滴定实验数据示意图；

图5为本发明实施例6制得的化合物6在各种钙离子浓度下的荧光光谱图；

图6为本发明实施例6制得的化合物6的钙离子滴定实验数据示意图；

图7为本发明实施例5制得的化合物5在各种钙离子浓度下的荧光光谱图；

图8为本发明实施例5制得的化合物5的钙离子滴定实验数据示意图；

图9为本发明实施例13的实验结果示意图，其中A-C为Rhod-2，化合物2b染料和化合物12染料在HeLa细胞内的显影示意图。D-F为使用毛地黄皂苷处理后Rhod-2，化合物2b染料和化合物12染料在HeLa细胞内的显影示意图。G-I为使用TritonX-100处理后，Rhod-2，化合物2b染料和化合物12染料在HeLa细胞内的显影示意图（插入图片显示在同样显影区域内细胞的相衬荧光显影)。

具体实施方式

下面的实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

下面结合实例进一步描述本发明罗丹明类荧光探针的合成方法。

实施例1：化合物1的合成：

5.75g（0.01mol）5-甲基-5′-甲酰基-BAPTA四甲酯（GrzegorzGrynikiewicz,MartinPoenie,RogerY.Tsien.Thejournalofbiologicalchemistry,1985,260(6)3440-3450）与4.35g（0.02mol）7-羟基-1-乙基-2，2，4-三甲基-1，2-二氢喹啉（US5750409）溶解在25ml1，4-二氧六环中，加入2.73g（0.02mol）无水氯化锌，氮气保护下室温反应5小时，使用乙酸乙酯和水进行萃取，稀盐酸洗涤，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋蒸后将产品溶于20ml甲醇中，加入4.91g（0.02mol）四氯苯醌（P-Chloranil）进行氧化，过夜后，直接用中性氧化铝吸附，以中性氧化铝为固定相，以二氯甲烷：甲醇=95：5为流动相，进行柱层析，得产品2.3g，将2.3g柱层析产品溶解入20ml甲醇中，加入1.5eq的碘化钠，搅拌1-2h后，有固体析出，过滤得1.95g化合物1。

化合物1：¹HNMR:1.1-1.45(m,6H),1.63/1.65/1.69/1.17(s,12H),1.91/1.93(s,6H),2.26(s,3H),3.4-4.1(m,4H),3.62(s,12H),4.31(s,8H),4.5(m,4H),5.75/6.12/6.32/7.51/6.14/6.16/6.66/7.31(s,8H),6.67-7.35(m,4H)。

实施例2：化合物2，2a，2b的合成：

化合物1（100mg，由实施例1制得）悬浮在1：1甲醇/水（V/V）（10mL）中,冰浴冷却下缓慢向悬浮液中加入200mgKOH，在室温下搅拌12-24小时，水溶液用50mL水稀释，用2-3mL浓盐酸中和到pH=3-5，对析出的固体进行过滤，得到游离酸化合物2。

化合物2：¹HNMR:1.1-1.45(m,6H),1.17/1.46/1.97/2.21(s,18H),2.26(s,3H),3.4-4.1(m,4H),4.31(s,8H),4.5(t,4H),5.45/5.56/6.12/6.32/6.75/6.83/7.51(s,8H),6.67-7.35(m,4H),11(s,4H)。

将100mg化合物2用KOH水溶液转化为钾盐，然后通过色谱在SephadexLH-20上用水洗脱，经过冻干后得到30mg化合物2a。

化合物2a：¹HNMR:1.1-1.45(m,6H),1.17/1.46/1.97/2.21(s,18H),2.26(s,3H),3.4-4.1(m,4H),4.31(s,8H),4.5(t,4H),5.45/5.56/6.12/6.32/6.75/6.83/7.51(s,8H),6.67-7.35(m,4H)。

化合物2（60mg）在室温下溶解在3mL无水DMF中，70μLBrCH₂OCOMe溶解在2mLDMF中，并将其在水浴搅拌下缓慢加入化合物10的溶液中。然后将130μLN,N-二异丙基乙胺（iPrNEt）缓慢加入上述混合物中。加入完毕后，混合物在室温下搅拌24-36小时。反应混合物倒入冰水中，有沉淀析出，将沉淀进行过滤并用水洗涤，将固体干燥后用硅胶经柱层析得纯品，即得化合物2b。

化合物2b：¹HNMR:1.1-1.45(m,6H),1.17/1.46/1.97/2.21(s,18H),2.2(s,12H),2.26(s,3H),3.4-4.1(m,4H),4.31(s,8H),4.5(t,4H),5.45/5.56/6.12/6.32/6.75/6.83/7.51(s,8H),6.87(s,8H),6.67-7.35(m,4H)。

实施例3：化合物3的合成：

以5-甲基-5′-甲酰基-BAPTA四甲酯和7-羟基-1-甲基-2，2，4-三甲基-1，2-二氢喹啉（US6372907，US5750409）为原料，按照实施例1的合成方法，得到化合物3，收率：23%。

化合物3：¹HNMR:0.9/1.1/1.46/2.26/3.06(s,21H),1.91/1.93(s,6H),4.31(s,8H),4.5(t,4H),5.45/5.75/6.12/6.32/7.38(s,6H),6.75/6.83(s,2H),6.67-7.35(m,4H),11(s,4H）。

实施例4：5′-甲酰基-5-硝基-BAPTA四甲酯（化合物4）的合成

2.31g（4.00mmol）5-硝基BAPTA四甲酸酯（R.Pethig，M.Kuhn，R.Payne，E.Adler，T.-H.Chen，L.F.Jaffe.CellCalcium，1989，10，491-498）（4.00mmol）,吡啶388mg（0.4mL）溶解在4.0mL(50mmol)DMF中，冷却到0℃，滴加POCl₃3mL(32mmol)，滴加完毕后，保持在0℃5-10分钟，然后在65℃下加热1-2小时，用TLC板检测反应至到原料消失。反应结束后，将反应混合物倒入水中。用乙酸乙酯萃取，有机层用水及饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，旋蒸可得白色固体，即化合物4。

化合物4：¹HNMR:3.68(s,12H),4.2(s,8H),4.56(t,4H),6.4-7.7(d,4H),7.26(s,lH),7.9(d,lH),9.61(s,1H)。

实施例5：化合物5的合成

以化合物4（实施例4制得）和7-羟基-1-乙基-2，2，4-三甲基-1，2-二氢喹啉（US5750409）为原料，按照实施例1的合成方法，得到化合物5，收率：15%。

化合物5：¹HNMR:1.1-1.45(m,6H),1.63/1.65/1.69/1.17(s,12H),1.91/1.93(s,6H),3.4-4.1(m,4H),4.31(s,8H),4.5(m,4H),5.43/5.75/6.12/6.32/6.75/7.51/7.62(s,8H),6.8-7.7(d,4H)，11（s,4H）。

实施例6：化合物6的合成

以5-氟-5′-甲酰基–BAPTA四甲酯（Barathbiosciences,Inc.，CA,BBS1306）和7-羟基-1-乙基-2，2，4-三甲基-1，2-二氢喹啉（US5750409）为原料，按照实施例1的合成方法，得到化合物6，收率：10%。

化合物6：¹HNMR:1.1-1.45(m,6H),1.63/1.65/1.69/1.17(s,12H),1.91/1.93(s,6H),3.4-4.1(m,4H),4.31(s,8H),4.5(m,4H),5.43/5.75/6.12/6.32/6.75/6.96/7.51(s,8H),6.67-7.35(d,4H)，11（s,4H）。

实施例7：化合物7的合成

以4-甲酰基-2-乙氧羰基甲氧基-N,N-双（乙氧羰基甲基）苯胺（BertMetten,MarioSmet,WimDehaen,Synthesis,2005,11,1838-1844）和1,3,3-三甲基-6,7-二氢-3H,5H-吡啶并[3,2,1-ij]喹啉-8-醇为原料，按照实施例1的合成方法，得到化合物7。

化合物7：¹HNMR:1/1.41(s,12H),1.4-4.19(m,12H),1.97(s,3H),2.21(s,3H),4.29(s,4H),4.68(s,2H),5.43(s,2H),6.15/6.75/7.38(s,3H),6.76/7.24(d,2H),13.03（s,3H）。

实施例8：化合物8的合成

以4-甲酰基-2-甲氧基-N,N-双（乙氧羰基甲基）苯胺（Bacci,JamesP.;Kearney,AaronM.;VanVranken,DavidL.JournalofOrganicChemistry,2005,vol.70,#22p.9051-9053）和1,3,3-三甲基-6,7-二氢-3H,5H-吡啶并[3,2,1-ij]喹啉-8-醇为原料，按照实施例1的合成方法，得到化合物8。

化合物8：¹HNMR:1.1(s,6H),1.46(s,6H),1.97(s,3H),2.21(s,3H),1.4-4.19(m,12H),3.84(s,3H),4.29(s,4H),5.43(s,2H),6.15/6.75/7.38(s,3H),6.76-7.24(d,2H),11(s,2H)。

实施例9：化合物9的合成

将8ml浓硫酸冷却到0℃，1mmol原料（化合物1，由实施例1制得）分批加入浓硫酸中，混合物在0℃下搅拌2h然后逐渐升温到室温继续搅拌2天，将其滴入10ml二氧六环和300ml乙醚中，析出的固体经过过滤，滤饼分散于水中，用固体碳酸氢钠中和，经过过滤后，滤液旋蒸后用硅胶进行柱层析，流动相为乙腈：水=80:20,得到的产品用KOH水溶液转化为钾盐，然后用LH-20过柱，用水洗脱，得到的产品冻干后得到化合物9。

化合物9：¹HNMR:1.15(t,6H),1.3(s,6H),1.46(s,6H),2.34(s,3H),2.4(m,4H),4.07(s,4H),4.29(s,8H),4.56(t,4H),5.45(s,2H),6.17/6.33/6.99/7.38/6.75/6.83(s,6H),6.33-7.4(t,4H)。

实施例10：化合物10和化合物11的制备

化合物10的制备：

1.77mmol化合物5的前体（即四甲酯形式）溶解在20mlHOAc中，加热到回流，分5批加入1g还原铁粉进行还原，还原结束，使用硅藻土进行过滤，滤液使用乙酸乙酯和水进行萃取。饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，悬蒸得到产品。将上述反应得到的产品0.13mmol悬浮于10ml丙酮（acetone）中，在30℃下加入10μl（0.14mmo）硫光气（CSCl₂）搅拌30min，反应结束后悬蒸后放入石油醚中搅拌得到产品，即化合物10。

化合物10：¹HNMR:1.1-1.45(m,6H),1.1/1.46(s,12H),1.91/1.93(s,6H),3.4-4.1(m,4H),3.62(s,12H),4.31(s,8H),4.5(t,4H),5.75/6.12/6.32/7.51(s,4H),6.14/6.16(s,2H),6.66/6.75(s,2H),6.67-7.35(m,4H)。

化合物11的制备：

0.028mmolBAPTA异硫氰酸酯（化合物10）溶解在1mlDMF中，将此溶液倒入0.18g（2.6μmol）70，000MW的氨基葡聚糖的2mlDMSO溶液（NH₂-dextran/DMSO）中，随着升温葡聚糖会变为透明溶液，将上述异硫氰酸酯加入其中，异硫氰酸酯会与葡聚糖反应，室温下搅拌过夜。此结合物加入100ml快速搅拌的丙酮中，过滤得到固体，将此固体重新溶解在10ml去离子水中。

将上述甲酯用1：1（V/V）的甲醇和水进行溶解，加入10eq的KOH水解，将葡聚糖溶液调节其pH到12.0搅拌14小时。然后使用HCl中和到pH为8.0，使用12-14，000MW的透析膜用去离子水对水解产物进行透析，需要3天左右。然后将溶液冻干得到固体产物，即化合物11。

化合物11：¹HNMR:1.1-2.21(m,-CH₃),3.3-4.1(m,dextranHC₂-C₆,)，4.5(m,-OCH₂-,),5.01(m,dextranHC₁),5.45(m,),6.67-7.35(m,ArH)。

实施例11：化合物12的制备

化合物3（30mg，0.034mmol）在室温下溶解在2mlDMF中，加入120μL（0.68mmol）N,N-二异丙基乙胺和70μL（0.68mmol）溴甲基乙酸酯。混合物在室温下搅拌过夜，对溶剂进行真空浓缩。剩余物用硅胶柱层析，使用乙酸乙酯和石油醚体系进行层析得到产品12为紫色固体12mg，即化合物12。

化合物12：¹HNMR:0.9-1.4(s,12H),0.9(s,3H),1.97(s,3H),2.21(s,3H),2.19(s,12H)，2.28(s,3H),3.02（s,3H）,4.5(m,4H),4.31(s,8H),5.69/6.66/6.12/6.32(s,4H),6.66-7.4(d,4H),6.87(s,8H),5.43/5.45/6.17/6.85（s,4H）。

实施例12：染料的钙离子滴定和解离常数（Kd）方法

1）测试溶液的制备：以“零钙离子缓冲液”和“高钙离子缓冲液”使用互相稀释的方法制备包含0.5μM钙离子指示染料的各种测试溶液。对于低Kd染料（例如化合物2，3，6），零钙离子缓冲液和高钙离子缓冲液是可以在市场上购买到钙离子标准缓冲液试剂盒（Biotium，CA;Cat#59100）。每种染料均制备得到11种不同钙离子浓度的测试溶液。对于化合物5，首先需要制备的零钙离子缓冲液包含10mMpH7.2MOPS,100mMKCl和0.5μM染料而高钙离子缓冲液包含10mMpH7.2MOPS,100mMKCl,0.5μM染料和1mMCaCl₂，然后这两种缓冲液进行互相稀释。因为这两种缓冲液中不含有钙离子螯合剂（例如：EGTA）来对钙离子浓度进行缓冲，它们仅仅用来制备具有较高钙离子浓度(≥50μM)的最终测试溶液，用来对具有较高Kd的染料进行研究。总共制备了化合物16的8种最终测试溶液。

2）光谱测试：荧光光谱是在HitachiF-4500上在室温下进行测试的，本发明化合物2，3的荧光光谱使用分别制备的溶液在每种钙离子浓度下分别重复进行了3次实验。类似的，化合物5和化合物6重复进行了2次实验。

不同染料在不同钙离子浓度下的荧光光谱测试结果如图1，3，5，7所示。Kd的计算是根据方程Log[(F–F_min)/(F_max–F)]=Log[Ca⁺⁺]–LogK_d中Log[(F–F_min)/(F_max–F)]vs.Log[Ca⁺⁺]的线性来进行计算的。此处F是在给定钙离子浓度[Ca⁺⁺]下的荧光强度，F_min是在[Ca⁺⁺]=0时的荧光强度;F_max是在染料被钙离子饱和下的荧光强度。染料的典型的线性图如图2，4，6，8中所示。本发明化合物几种典型的Kd值在表1下方列出：

表1

化合物	Kd值
		化合物2	663nM
化合物3	560nM
		化合物5	672μM
化合物6	1.29μM

实施例13：

在黑色的96孔细胞培养板中培养HeLa细胞24小时，根据“APracticalGuidetotheStudyofCalciuminLivingCells”(1994)RichardNuccitelli,Ed,p165.和Castroetal.(2004).CellDeathandDifferentiation11,468-78中的描述用本发明染料AM酯的形式对细胞进行负载。离子指示剂AM酯用无水DMSO制备得到10mM浓度的储备液；1μL的10mMAM酯的储备液与1μL20%PluronicF-127（溶于DMSO）的混合，然后再混合物中加入1mLKrebs-Ringer-HEPES(KRH)缓冲液(136mMNaCl,10mMHEPES,4.7mMKCl,1.25mMMgSO₄,1.25mMCaCl₂)再补充加入25mM葡萄糖和5%牛血清白蛋白。细胞用含有AM酯的缓冲液在室温下培养30分钟。细胞用KRH缓冲液洗涤数次。加入培养基然后将细胞在37℃下培养30分钟以使细胞内的AM酯发生水解。细胞用KRH缓冲液洗涤数次，并且在HRH缓冲液中使用OlympusIX71落射荧光显微镜和Q-ImagingRetiga2000R数码相机显影，对于Rhod-2（现有的一种钙离子指示剂）的显影，使用罗丹明滤光片组，或者使用TexasRed滤光片组对化合物2b和化合物12进行显影。

在对每个孔进行显影之前，在每个孔的缓冲液中快速加入10μL的20μM钙离子载体KRH缓冲液。对于染料消耗实验，需要对细胞在含有2.8mMEGTA的KRH缓冲液中对细胞进行显影。不需要其它处理就可以对细胞进行显影，或者加入20μM毛地黄皂苷来解离染料在细胞质中的区域定位后进行显影，或者在加入1%Triton-X100来对细胞器中的染料区室化进行解离后直接进行显影。每个孔中的荧光使用SpectraMaxGemini荧光酶标仪(AppliedBiosystems)在每个染料的激发/最大发射处测量。染料区室化（%）可以通过公式((Fd-Fb)/(Fi-Fb))(100)来进行计算，此处Fd是用毛地黄皂苷处理过的细胞的荧光，Fb是用TritonX-100处理过的细胞的荧光，Fi是未处理细胞的荧光。

如图9所示，荧光显影显示2b染料和12染料与钙离子指示剂Rhod-2在HeLa细胞内的定位是相似的（见图9的A-C）。使用毛地黄皂苷处理的细胞显影揭示在细胞内细胞器中，染料与线粒体之间存在显著的区室化效应（见图9的D-F）。使用TritonX-100处理的染料完全被去除(TX100，见图9的G-I，插入图片显示在同样显影区域内细胞的相衬荧光显影)。

表2中显示每个孔中的相对荧光测量数据用来计算染料区室化率。显示出染料化合物2b和化合物12与Rhod-2（大约30%）相比具有较高的区室化率（90%或更高）,在线粒体中的区室化在图9中可以看出来。从表2及图2的实验结果来看，说明本发明化合物在线粒体中存在明显的区室化。

表2

Claims (17)

1.下述通式(Ⅰ)化合物：

其中，R₂,R₃,R₄互相独立，R₂,R₃,R₄为氢，甲基或乙基；

R₅为

R₉-R₁₂互相独立，R₉、R₁₁、R₁₂为氢，甲基或乙基；R₁₀为氢，甲基，硝基，氟,氯；

R₆为甲基或–CH₂SO₃ ^-；

R₇为氢，甲基，乙基，或者与R₈连接形成饱和或者不饱和的五元环或六元环；

R₈为氢，或者R₈为与R₇连接形成饱和或者不饱和五元环或六元环；

每个M均为互相独立的阳离子，选自氢，钾，钠，铵，锂或铯，d用以平衡化合物所带负电荷所需M的数目。

2.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，

R₂,R₃,R₄全部为氢；

R₅为

此处，R₉,R₁₁,R₁₂互相独立，R₉,R₁₁,R₁₂为氢；R₁₀为氢，甲基，硝基，氟或氯。

3.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，R₇为氢，甲基或乙基，R₈为氢。

4.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，R₇和R₈连接在一起形成六元环。

5.下述通式(Ⅱ)化合物：

其中，取代的R₂,R₃,R₄互相独立，R₂,R₃,R₄为氢，甲基或乙基；

R₅为

R₉-R₁₂互相独立，R₉、R₁₁、R₁₂为氢，甲基或乙基；R₁₀为氢，甲基，硝基，氟或氯；

R₆为甲基；

R₇为氢，甲基，乙基，或者与R₈连接形成饱和或者不饱和的五元环或六元环；

R₈为氢，或者R₈为与R₇连接形成饱和或者不饱和五元环或六元环；

R₁为甲基，乙基或乙酰氧甲基；

Ψ为阴离子，用以平衡化合物所带正电荷。

6.如权利要求5所述的化合物，其特征在于，

R₂,R₃,R₄全为氢；

R₅为

此处，R₉,R₁₁,R₁₂互相独立，为氢；R₁₀为氢，甲基，硝基，氟或氯；

R₁为乙酰氧甲基。

7.如权利要求5所述的化合物，其特征在于，R₇为氢，甲基或乙基，R₈为氢。

8.如权利要求5所述的化合物，其特征在于，R₇与R₈连接在一起形成六元环。

9.一种应用权利要求1所述的通式(Ⅰ)化合物作为荧光探针探测样品中钙离子或镁离子的方法，所述方法不包括疾病诊断方法，其特征在于，包含以下步骤：

1)样品与权利要求1所述的通式(Ⅰ)化合物接触；

2)用合适波长的光源激发样品，并且；

3)探测样品的荧光发射。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述通式(Ⅰ)化合物，通式(Ⅰ)中，R₂,R₃,R₄全部为氢；R₅为

此处，R₉,R₁₁,R₁₂互相独立，为氢，R₁₀为氢，甲基，硝基，氟或氯。

11.如权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤1)中，如果钙离子或镁离子位于样品的细胞内，则所述通式(Ⅰ)化合物通过显微注射导入细胞。

12.如权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤1)中，如果钙离子或镁离子位于样品的细胞外，通式(Ⅰ)化合物直接与样品接触。

13.如权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤3)中，所述探测是在荧光显微镜，酶标仪或流式细胞仪设备上进行的。

14.一种应用权利要求5所述的通式(Ⅱ)化合物作为荧光探针探测活细胞样品内钙离子或者镁离子的方法，所述方法不包括疾病诊断方法，包含以下步骤：

1)使细胞样品与权利要求5所述通式(Ⅱ)化合物接触；

2)培养细胞样品至少5分钟；

3)使用合适波长的光源激发样品，并且；

4)探测样品的荧光发射。

15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述通式(Ⅱ)化合物，通式(Ⅱ)中，R₂,R₃,R₄全为氢；

R₅为

此处，R₉,R₁₁,R₁₂互相独立，为氢，R₁₀为氢，甲基，硝基，氟或氯；

R₁为乙酰氧甲基。

16.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述细胞样品为细胞培养物，或细胞组织培养物。

17.如权利要求14所述的方法，其特征在于，步骤4)中，所述探测是在荧光显微镜，酶标仪或流式细胞仪设备上进行的。