JP6366269B2

JP6366269B2 - ケージド化合物及びその製造方法

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Publication number: JP6366269B2
Application number: JP2013269107A
Authority: JP
Inventors: 学安倍; 春郎河西; 孝嘉小林
Original assignee: Hiroshima University NUC
Current assignee: Hiroshima University NUC
Priority date: 2013-12-26
Filing date: 2013-12-26
Publication date: 2018-08-01
Anticipated expiration: 2033-12-26
Also published as: JP2015124171A

Description

本発明は、光応答性のケージド化合物及びその製造方法に関する。

従来、生物活性に重要な官能基を光解除性保護基で保護（修飾）して不活性化しておき、光を照射することにより、光解除性保護基による保護が解除されて、活性を示すケージド化合物（Caged compounds）が知られている。

より具体的には、例えば、カルシウムを保護する水溶性のエチレングリコールテトラアセテート（ＥＧＴＡ）ユニットを導入したニトロジベンゾフラン（ＮＤＢＦ）骨格を有する光解離性保護基（ＮＤＢＦ−ＥＧＴＡ）であって、カルシウムの働きを明らかにするためのカルシウムケージド化合物が開示されている（例えば、特許文献１参照）。

国際公開第２００６／１１０８０４号

しかし、上記従来のケージド化合物は、細胞内において不溶であるため、in vivoで使用する場合、ケージド化合物が細胞膜を通過するように、細胞内に電極を配置する必要があった。従って、ケージド化合物をin vivoで使用する場合に、多大な時間と労力を必要とするという問題があった。

そこで、本発明は、かかる点に鑑みてなされたものであり、電極を用いることなく、in vivoで使用することができ、光刺激により、自在かつ容易にカルシウム等の官能基を放出することができる光応答性のケージド化合物及びその製造方法を提供することを目的とする。

上記目的を達成するために、本発明のケージド化合物は、ニトロジベンゾフラン−エチレングリコールテトラアセテート（ＮＤＢＦ−ＥＧＴＡ）と、アセトキシアルキルハロゲン化物（ＣＨ_３ＣＯＯＲＸ；Ｒは、Ｃ_１〜Ｃ_３のアルキル基であり、Ｘは、ハロゲン原子である）のエステル化反応により得られることを特徴とする。

また、本発明のケージド化合物は、下記式（１）で表されることを特徴とする。

また、本発明のケージド化合物の製造方法は、ジイソプロピルエチルアミンの存在下で、下記式（２）に示すカルボン酸とアセトキシメチルブロミドとのエステル化反応を行うことにより、下記式（３）で表されるケージド化合物を製造することを特徴とする。

本発明のケージド化合物によれば、電極を使用することなく、細胞膜を通過する性質を有するため、本発明のケージド化合物を使用することにより、in vivoにおいて、多大な時間と労力をかけることなく、光刺激により、自在かつ容易にカルシウムを放出することが可能になる。

本発明の実施例に係るケージド化合物について、カルシウムのケージド化合物としての実用性を示すデータ（単離大脳神経細胞を用いた抑制性シナプス後電流の測定データ）である。

本発明のケージド化合物は、光刺激により、自在かつ容易にカルシウムを放出する機能を有し、ニトロジベンゾフラン−エチレングリコールテトラアセテート（ＮＤＢＦ−ＥＧＴＡ）と、アセトキシアルキルハロゲン化物（ＣＨ_３ＣＯＯＲＸ；Ｒは、Ｃ_１〜Ｃ_３のアルキル基であり、Ｘは、ハロゲン原子である）のエステル化反応により得られ、例えば、下記式（４）で表される光応答性のケージド化合物が挙げられる。

より具体的には、このケージド化合物は、ニトロジベンゾフラン−エチレングリコールテトラアセテート−アセトキシメチルエステル（ＮＤＢＦ−ＥＧＴＡ−ＡＭエステル）であり、細胞膜を透過する性質が付与された誘導体化合物である。

本発明のケージド化合物は、生物活性に重要な官能基、例えば、カルシウムを光解除性保護基で保護（修飾）して不活性化しておき、光を照射することにより、光解除性保護基による保護が解除されて、活性を示すものである。

また、上述のカルシウムは、生体内で重要な働きを有しており、生命活動には欠かせない必須元素である。特に、脳内においては、このカルシウムが放出されることにより、神経細胞が刺激を受け、種々の神経性生理現象が生じる。

そして、本発明のケージド化合物によれば、in vivoにおいて、このカルシウムの放出メカニズムを容易に解明することが可能になる。

即ち、本発明のケージド化合物は、電極を使用することなく、細胞膜を通過する性質を有し、本発明のケージド化合物を使用することにより、in vivoにおいて、多大な時間と労力をかけることなく、光刺激により、自在かつ容易にカルシウムを放出することが可能になる。

次に、本実施形態におけるケージド化合物の製造方法の概略を以下の反応スキーム１に示す。

＜反応スキーム１＞

式（４）で表されるケージド化合物を得るには、まず、式（５）で表されるテトラカルボン酸であるニトロジベンゾフラン−エチレングリコールテトラアセテート（ＮＤＢＦ−ＥＧＴＡ）をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）等の溶媒に溶解させた後、この溶解液に、塩基であるジイソプロピルエチルアミン（（i-Ｐｒ）_２ＮＥｔ）を加える。

次いで、この溶解液を攪拌しながら、アセトキシメチルブロミド（ＣＨ_３ＣＯＯＣＨ_２Ｂｒ）を添加（滴下）して、更に、所定期間（例えば、２４時間）攪拌する。そうすると、テトラカルボン酸であるニトロジベンゾフラン−エチレングリコールテトラアセテート（ＮＤＢＦ−ＥＧＴＡ）のエステル化反応（アセトキシメチルエステル化反応）が起こり、式（４）で表されるケージド化合物が生成される。

なお、このエステル化反応の際に生成した臭化水素は、上述のジイソプロピルエチルアミンにより除去される。

次いで、反応液に水を加えて、反応を停止（クエンチ）させ、酢酸エチル中に式（４）で表されるケージド化合物を溶出させ、酢酸エチルで抽出を行う。

次いで、得られた抽出液を、飽和食塩水で洗浄した後、硫酸ナトリウム（Ｎａ_２ＳＯ_４）を使用して乾燥処理を行う。

次いで、洗浄処理、及び乾燥処理を行った抽出液を濾過し、濾過した抽出液に対して常法により濃縮処理を施すことにより、反応混合物を得る。

次いで、上述の方法により得られた反応混合物を、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）を使用して精製することにより、上記（４）で表されるケージド化合物を得ることができる。

より具体的には、粒子充填型カラムを用いたゲル浸透クロマトグラフィーにおいて、ジクロロメタンとメタノールの混合溶媒（極性溶媒）を移動相として使用することにより精製（単離）することができる。

なお、ジクロロメタンとメタノールの混合比率は、特に限定されないが、移動相の極性を高めて、ケージド化合物の単離を容易にするとの観点から、ジクロロメタン／メタノールの混合比率をジクロロメタン：メタノール＝２０：１に設定することが好ましい。

また、粒子充填型カラムとしては、例えば、高純度シリカゲル（金属不純物が極めて少ないシリカゲル）が充填されたカラム（例えば、和光純薬工業（株）製、商品名：Ｃ３００）を使用することができる。

また、反応スキーム１において、式（５）のニトロジベンゾフラン−エチレングリコールテトラアセテート１モルに対して、アセトキシメチルブロミドを３モル以上（即ち、ニトロジベンゾフラン−エチレングリコールテトラアセテート中の１つのカルボキシル基に対して、アセトキシメチルブロミドを１．５倍モル当量以上）の割合で添加することが好ましい。

これは、アセトキシメチルブロミドの添加量が３モル未満の場合は、上述のエステル化反応に寄与するブロミドの量が少ないため、上記（４）で表されるケージド化合物の収率が低下する場合があるためである。

また、反応スキーム１において、式（５）のニトロジベンゾフラン−エチレングリコールテトラアセテート１モルに対して、ジイソプロピルエチルアミンを３モル以上（即ち、ニトロジベンゾフラン−エチレングリコールテトラアセテート中の１つのカルボキシル基に対して、ジイソプロピルエチルアミンを１．５倍モル当量以上）の割合で添加することが好ましい。

これは、ジイソプロピルエチルアミンの添加量が３モル未満の場合は、上述のエステル化反応に寄与する塩基の量が少ないため、上記（４）で表されるケージド化合物の収率が低下する場合があるためである。

また、発熱反応を避けるとの観点から、反応スキーム１において、上述のごとく、ニトロジベンゾフラン−エチレングリコールテトラアセテートをジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）等の溶媒中に、予め、溶解させておくことが好ましい。

また、反応温度の上昇に起因する不測の反応の発生を防止するとの観点から、アセトキシメチルブロミドを添加（滴下）する際に、反応温度が室温以下となるように、ゆっくりと滴下する（例えば、１ｍｌ／１０分）ことが好ましい。

また、同様の観点から、アセトキシメチルブロミドを添加（滴下）する際に、使用する反応容器を冷却（例えば、反応容器であるパイレックスガラス（パイレックスは登録商標）製の３口フラスコを冷却）して、室温以下の温度で上記エステル化反応を行うことが好ましい。

更に、酸素と水による副反応の発生を防止するとの観点から、上記エステル化反応を、窒素雰囲気下で行うことが好ましい。

以下に、本発明を実施例に基づいて説明する。なお、本発明は、これらの実施例に限定されるものではなく、これらの実施例を本発明の趣旨に基づいて変形、変更することが可能であり、それらを本発明の範囲から除外するものではない。

（アセトキシメチルエステル化反応における最適化条件の検討）
まず、アセトキシメチルエステル化反応において、カルボキシル基に対するアセトキシメチルブロミドの最適な添加量について検討した。

より具体的には、検討用のモデル化合物として、ジカルボン酸（２，２’−フェニルアザンジイル二酢酸）を使用し、このジカルボン酸のアセトキシメチルエステル化反応におけるアセトキシメチルブロミドの最適な添加量について検討した。このジカルボン酸のアセトキシメチルエステル化反応の概略を以下の反応スキーム２に示す。

＜反応スキーム２＞

（実施例１）
まず、式（６）で表される２，２’−フェニルアザンジイル二酢酸（和光純薬工業（株）製、商品名：Ｎ−フェニルイミノ二酢酸）５０．１ｍｇ（０．２４ｍｍｏｌ）を、窒素気流下でパイレックスガラス（パイレックスは登録商標）製蓋付き試験管に加え、次に、２ｍｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を加えて溶解した。次に、この溶解液に、ジイソプロピルエチルアミン（和光純薬工業（株）製、商品名：Ｎ−エチルジイソプロピルアミン）０．６３ｍｌ（３．６０ｍｍｏｌ）を加えた。

次に、冷水を使用して、反応容器を０℃に冷却しながら、０．０４６ｍｌ（０．４８ｍｍｏｌ）のアセトキシメチルブロミド（（シグマアルドリッチ（株）製、商品名：酢酸ブロモメチル）を、１滴ずつゆっくりと１０分間かけて滴下した。

次に、室温に昇温後、２４時間、攪拌し、反応液に１０ｍｌの水を加えて、反応を停止（クエンチ）させた。

次に、２０ｍｌの酢酸エチル中に式（７）で表されるエステル化合物（ビス（アセトキシメチル）２，２‘-（フェニルアザジイル）ジアセテート）を溶出させ、酢酸エチルで抽出を行った。

次に、得られた抽出液を、２０ｍｌの飽和食塩水で洗浄した後、８ｇの硫酸ナトリウム（Ｎａ_２ＳＯ_４）を使用して乾燥処理を行った。

次に、得られた抽出液を濾紙（東京濾紙（株）製、商品名：定性濾紙）を使用して濾過し、濾過した抽出液に対して、エバポレーターによる濃縮処理を施すことにより、反応混合物を得た。

次に、得られた反応混合物を、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）を使用して精製することにより、上記式（７）で表されるエステル化合物（５９．６ｍｇ）を得た。

より具体的には、高純度シリカゲルが充填されたカラム（和光純薬工業（株）製、商品名：Ｃ３００）を使用して、ゲル浸透クロマトグラフィーにより精製した。

なお、移動相として、ジクロロメタン（和光純薬工業（株）製）とメタノール（和光純薬工業（株）製）の混合溶媒を使用した。また、ジクロロメタン／メタノールの混合比率をジクロロメタン：メタノール＝２０：１に設定した。また、精製条件を流速２ｍｌ／ｍｉｎ、２０℃とし、カラム保持時間は１０分間とした。

得られたエステル化合物の収率を表１に示す。なお、収率は、未精製の混合物の^１ＨＮＭＲスペクトルから，ＡＭブロミドと目的物のプロトン比から算出した。

（実施例２）
アセトキシメチルブロミドを０．０６８ｍｌ（０．７２ｍｍｏｌ）使用したこと以外は、上述の実施例１と同様にして、式（７）で表されるエステル化合物（収量は９９．８ｍｇ）を得た。その後、上述の実施例１と同様にして、収率を算出した。以上の結果を表１に示す。

（実施例３）
アセトキシメチルブロミドを０．１１４ｍｌ（１２．０ｍｍｏｌ）使用したこと以外は、上述の実施例１と同様にして、式（７）で表されるエステル化合物（収量は１３４．４ｇ）を得た。その後、上述の実施例１と同様にして、収率を算出した。以上の結果を表１に示す。

（実施例４）
アセトキシメチルブロミドを０．２２７ｍｌ（２４．０ｍｍｏｌ）使用したこと以外は、上述の実施例１と同様にして、式（７）で表されるエステル化合物（収量は１５５．８ｇ）を得た。その後、上述の実施例１と同様にして、収率を算出した。以上の結果を表１に示す。

表１に示すように、式（６）のジカルボン酸１モルに対して、アセトキシメチルブロミドを２モルの割合で添加した実施例１においては、式（７）で表されるエステル化合物の収率は７１％であったが、式（６）のジカルボン酸１モルに対して、アセトキシメチルブロミドを３モル以上の割合で添加した実施例２〜４においては、式（７）で表されるエステル化合物の収率は９１％以上であった。

以上より、アセトキシメチルエステル化反応においては、式（６）のジカルボン酸１モルに対して、アセトキシメチルブロミドを３モル以上（即ち、１つのカルボキシル基に対して、アセトキシメチルブロミドを１．５倍モル当量以上）の割合で添加することにより、エステル化合物の収率が向上することが判る。

（実施例５）
次に、アセトキシメチルブロミドの添加量を、式（６）のジカルボン酸１モルに対して、３モルに固定して、ジイソプロピルエチルアミンの最適な添加量を検討した。

より具体的には、ジイソプロピルエチルアミンを０．３７ｍｌ（２．１ｍｍｏｌ）使用したこと以外は、上述の実施例２と同様にして、式（７）で表されるエステル化合物（収量は１１８．６ｍｇ）を得た。その後、上述の実施例１と同様にして、収率を算出した。以上の結果を表２に示す。

（実施例６）
ジイソプロピルエチルアミンを０．２９ｍｌ（１．６６ｍｍｏｌ）使用したこと以外は、上述の実施例２と同様にして、式（７）で表されるエステル化合物（収量は１４７．６ｍｇ）を得た。その後、上述の実施例１と同様にして、収率を算出した。以上の結果を表２に示す。

（実施例７）
ジイソプロピルエチルアミンを０．２１ｍｌ（１．２ｍｍｏｌ）使用したこと以外は、上述の実施例２と同様にして、式（７）で表されるエステル化合物（収量は１１７．８ｍｇ）を得た。その後、上述の実施例１と同様にして、収率を算出した。以上の結果を表２に示す。

（実施例８）
ジイソプロピルエチルアミンを０．１２ｍｌ（０．７２ｍｍｏｌ）使用したこと以外は、上述の実施例２と同様にして、式（７）で表されるエステル化合物（収量は１４２ｍｇ）を得た。その後、上述の実施例１と同様にして、収率を算出した。以上の結果を表２に示す。

（実施例９）
ジイソプロピルエチルアミンを０．０９ｍｌ（０．４８ｍｍｏｌ）使用したこと以外は、上述の実施例２と同様にして、式（７）で表されるエステル化合物（収量は７４．７ｍｇ）を得た。その後、上述の実施例１と同様にして、収率を算出した。以上の結果を表２に示す。

表２に示すように、式（６）のジカルボン酸１モルに対して、ジイソプロピルエチルアミンを２モルの割合で添加した実施例９においては、式（７）で表されるエステル化合物の収率は８９％であったが、式（６）のジカルボン酸１モルに対して、アセトキシメチルブロミドを３モル以上の割合で添加した実施例５〜８においては、式（７）で表されるエステル化合物の収率は９８％以上であった。

以上より、アセトキシメチルエステル化反応においては、式（６）のジカルボン酸１モルに対して、ジイソプロピルエチルアミンを３モル以上（即ち、１つのカルボキシル基に対して、ジイソプロピルエチルアミンを１．５倍モル当量以上）の割合で添加することにより、エステル化合物の収率が向上することが判る。

（ケージド化合物の合成）
次に、式（４）で表されるケージド化合物を合成した。この際、上述の実施例１〜９の結果に基づき、式（５）のニトロジベンゾフラン−エチレングリコールテトラアセテート１モルに対して、アセトキシメチルブロミド、及びジイソプロピルエチルアミンを６モル（即ち、ニトロジベンゾフラン−エチレングリコールテトラアセテート中の１つのカルボキシル基に対して、アセトキシメチルブロミド、及び、ジイソプロピルエチルアミンを３倍モル当量）の割合で添加した。

より具体的には、まず、式（５）のニトロジベンゾフラン−エチレングリコールテトラアセテート５２．１ｍｇ（０．０９ｍｍｏｌ）を、窒素気流下で、パイレックスガラス（パイレックスは登録商標）製の２口フラスコ（３０ｍｌ）に加え、２ｍｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を加えて溶解した。次に、この溶解液に、ジイソプロピルエチルアミン（和光純薬工業（株）製，商品名：Ｎ−エチルジイソプロピルアミン）０．０９１ｍｌ（０．５４ｍｍｏｌ）を加えた。

次に、冷水を使用して、反応容器を０℃に冷却しながら、０．０５ｍｌ（０．５４ｍｍｏｌ）のアセトキシメチルブロミド（シグマアルドリッチ（株）製、商品名：酢酸ブロモメチル）を、１０分間、ゆっくりと滴下した。

次に、室温に昇温後、２４時間攪拌した後、反応液に、１０ｍｌの水を加えて、反応を停止（クエンチ）させた。

次に、２０ｍｌの酢酸エチル中に式（４）で表されるケージド化合物を溶出させ、酢酸エチルで抽出を行った。

次に、得られた反応混合物を、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）を使用して精製することにより、上記式（４）で表されるケージド化合物を得た。

得られたケージド化合物の収量は３２．４ｍｇ（０．０３７ｍｍｏｌ）、収率は４２％であった。なお、収率は、未精製の混合物の^１ＨＮＭＲスペクトルから、ＡＭブロミドと目的物のプロトン比から算出した。

（カルシウムケージド化合物評価）
次に、合成したケージド化合物について、カルシウムのケージド化合物として使用した場合の実用性を、in vivo試験（単離大脳神経細胞を用いた抑制性シナプス後電流の測定）により評価した。

より具体的には、合成した、式（４）で表されるケージド化合物（ケージド化合物６０μｇ（０．０６８ｍｍｏｌ）を２．２７ｍｌのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ：７．４）に溶解して３０μＭの濃度に調製したもの）を細胞外に導入した。

次に、カルシウム蛍光指示薬としてＯｒｅｇｏｎＧｒｅｅｎ４８８ＢＡＴＰＡ−１，Ａｍ（ライフテクノロジー・ジャパン製、商品名：Oregon Green 488 BAPTA-1, AM, cell permeant-special Packaging）、濃度：２ｍＭ）、非イオン性界面活性剤としてクレモフォールＥＬ（メルク（株）製、商品名：Cremophor EL, Sterilized、濃度：０．０３％）を含有する培地（ｐＨ７．４）を使用して、３０分間、超音波処理を行った後、３７℃の温度で培養した。

次に、パルスレーザー照射装置（スペクトラフィジックス製、商品名：MaiTaiフェムト秒レーザー）を使用して、超短パルスレーザーの点照射（波長：７２０ｎｍ、出力：９ｍＷ、照射時間：１×１０^−２秒）を行い、抑制性シナプス後電流の検出を行うことにより、カルシウム濃度の上昇を確認した。以上の結果を図１に示す。

図１に示すように、超短パルスレーザーの点照射直後に、カルシウム濃度が上昇していることが判る。即ち、合成したケージド化合物は、７２０ｎｍの超短パルスレーザーの点照射によって、自在かつ容易にカルシウムを放出することができ、ケージド化合物を導入した細胞内において、カルシウム濃度が顕著に増大していることが判る。

本発明の活用例としては、光応答性のケージド化合物及びその製造方法が挙げられる。

Claims

ジイソプロピルエチルアミンの存在下で、下記式（１）に示すカルボン酸とアセトキシメチルブロミドとのエステル化反応を行うことにより、下記式（２）で表されるケージド化合物を製造するケージド化合物の製造方法であって、
下記式（１）に示すカルボン酸中の１つのカルボキシル基に対して、前記ジイソプロピルエチルアミンを１．５倍モル当量添加するとともに、前記アセトキシメチルブロミドを１．５倍モル当量添加することを特徴とするケージド化合物の製造方法。
室温以下の温度で、上記エステル化反応を行うことを特徴とする請求項１に記載のケージド化合物の製造方法。
前記式（１）に示すカルボン酸を溶媒に溶解した状態で、前記ジイソプロピルエチルアミン及び前記アセトキシメチルブロミドを添加することを特徴とする請求項１又は請求項２に記載のケージド化合物の製造方法。
窒素雰囲気下で、前記エステル化反応を行うことを特徴とする請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載のケージド化合物の製造方法。