CN102146215B - 一类五甲川菁荧光染料、制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

一类具有通式I结构的五甲川菁荧光染料、制备方法及其应用，通式中，X为CHO或CHCR₃R₄；R₁和R₂各自独立选自(CH₂)_nR₇等基团；R₃和R₄各自独立选自CN、COOH或COOR₁₆；R₅、R₆和R₇各自独立选自H、SO₃R₁₀或COOR₁₁；R₈为H或C_1-18烷基；R₉为H或CH₃；R₁₀为N(R₁₂R₁₃R₁₄R₁₅)；R₁₁为C_1-18烷基；R₁₂、R₁₃、R₁₄、R₁₅和R₁₆各自独立选自H、C_1-18烷基、(CH₂)_mOR₈或(CHR₉CH₂O)_pR₈；Y^-为卤素负离子或者OTs^-；n、m、p为0～18的整数。该类染料可用于灵敏地检测组织、细胞等微环境粘度。

Description

一类五甲川菁荧光染料、制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及一类五甲川菁荧光染料，尤其是甲川链的中位发生共轭取代的新型荧光染料与制备方法，以及将该荧光染料用作粘度敏感的荧光探针检测活细胞内微环境粘度的方法。

背景技术

粘度是衡量一种浓稠流体的流动性和扩散性的主要因素，同时是流体扩散速率的主要参考指标。针对宏观大体积的粘稠流体，测定流体粘度的方法和仪器已经发展的比较成熟了，比如转子粘度计、落球粘度计等，然而这一类粘度计只能用于宏观大体积流体粘度测定，需要流体体积在不小于1mL；对微观环境，比如组织、细胞水平的粘度测定，这些测试方法和仪器往往不能达到测试的目的的。而准确测定细胞水平内微环境的粘度又具有非常重要的意义：活细胞内不同位置的粘度不同，这对细胞内生物分子及胞内信号的扩散与传递起着决定性作用。根据K.Suhling小组的工作可知，正常活细胞内膜系统微环境的粘度最高可以达到140厘泊(cp)，而细胞质中的粘度仅1～2cp，相当于纯水中的粘度；当出现病变细胞逐渐死亡的时候，细胞内的粘度会显著提高，最高可以达到300cp，细胞内粘度的显著变化会导致机体出现疾病或机能失调等。因此，需要开发出能测试这些微环境粘度的方法。

近年来，有一些文献报道了利用基于分子荧光转子的粘度探针来检测细胞内微环境粘度的方法。设计这种粘度探针主要有两种方法：一种是基于荧光寿命成像的方法，另一种是基于比例荧光系成像的方法。对于荧光寿命成像的方法，前人已经做了很优秀的工作。由于荧光寿命成像的发射波长只有单一的发射峰；根据A.Theodorakis小组的工作报道的要设计双波长的粘度分子转子有两种方法，一是基于光诱导分子内电荷转移(ICT)的方法，但是基于这种机理设计的探针容易受到溶剂的极性的影响，另一种方法就是设计基于荧光共振能量转的分子转子，这种方法存在的问题就是需要作为能量供体的发射光谱与能量受体的吸收光谱有较好的重叠交盖，这些要求限制了这类探针的设计与应用。

细胞内成像的精确可靠性十分重要，虽然Suhling等和Theodorakis等小组的工作分别是采用荧光寿命成像和比例的方法来达到检测粘度变化的目的，但是现有技术中还没有荧光探针具备上述两种性能。

经典的五甲川菁类荧光染料的合成是采用季铵盐与中间共轭链的缩合剂在醋酸酐做溶剂、无水醋酸钠作为催化剂、氩气保护条件下反应生成。一般的五甲川菁类荧光染料由于具有摩尔消光吸收大(达到10⁵数量级)等优点，在蛋白标记，DNA测序，离子中性小分子识别，细胞以及活体组织成像方面得到了很广泛的应用。而到目前为止还没有文献报道，五甲川菁染料用来设计成对环境粘度敏感的分子转子来检测溶液或者细胞内环境的粘度。

发明内容

在现有技术的基础上，本发明旨在提供一类新的五甲川菁荧光染料，该染料应当对环境粘度的变化具有很灵敏的响应，荧光性能受溶剂极性的影响很小，并且具有双重性能以保证其既适用于荧光寿命成像法，也适用于荧光比例法来检测环境粘度。发明人在研究中发现，在传统五甲川菁类荧光染料化合物的甲川链中间共轭连接取代基后，染料的光谱上出现两个峰。由于取代基的转动容易形成TICT激发态，消耗掉了激发能，使得染料主要以非辐射的形式回到基态。该类化合物排除了溶剂极性的影响，对环境粘度变化具有很灵敏的响应，当染料所处环境的粘度增加时，取代基的转动受到抑制，两个发射峰处的荧光强度呈现不同幅度增加，表现出比例变化，荧光寿命也增长，并且这两种变化与粘度的变化相关。据此，可以使用该类化合物在活细胞内成像来显示不同区域的粘度，或显示细胞内粘度的变化，具有很好的生物应用前景。

因此，本发明首先提供一类五甲川菁荧光染料，该化合物具有如下结构通式I：

其中：

X为CHO或CHCR₃R₄；

R₁和R₂各自独立选自(CH₂)_nR₇、(CH₂)_mOR₈、(CHR₉CH₂O)_pR₈或CH₂C₆H₄R₇；

R₃和R₄各自独立选自CN、COOH或COOR₁₆；

R₅、R₆和R₇各自独立选自H、SO₃R₁₀或COOR₁₁；

R₈为H或C_1-18烷基；

R₉为H或CH₃；

R₁₀为N(R₁₂R₁₃R₁₄R₁₅)；

R₁₁为C_1-18烷基；

R₁₂、R₁₃、R₁₄、R₁₅和R₁₆各自独立选自H、C_1-18烷基、(CH₂)_mOR₈或(CHR₉CH₂O)_pR₈；

Y^-为卤素负离子或者OTs^-；

n、m、p为0～18的整数。

本文中使用的术语“烷基”包括直链烷基和支链烷基；术语“卤素”包括氟、氯、溴和碘；OTs^-是指对甲苯磺酸根离子。

上述本发明的化合物中，优选R₃和R₄为CN的化合物，即取代基X为醛基和丙二腈乙烯基的化合物。

本发明所述化合物的母体结构上取代基的作用是调节染料在有机溶剂或者水溶液中的溶解性，或者细胞跨膜的能力。其中优选的技术方案是R₁和R₂各自独立选自(CH₂)_nR₇和/或R₅和R₆为H。

最为优选地，R₃和R₄为CN，R₁和R₂为CH₃，R₅和R₆为H，即下述式4和式7的化合物。

本发明的另一目的是提供上述化合物的制备方法，包括如下步骤：

(1)连有取代基R₅的2，3，3-三甲基-3H-吲哚啉与R₁CH₂Z反应制得季铵盐II，其中Z是卤素或者OTs，Z^-是卤素负离子或者OTs^-；反应温度80～148℃，反应时间6～12小时，反应溶剂选自甲苯、邻二氯苯、乙醇或乙腈，吲哚化合物与R₁CH₂Z的投料摩尔比1∶1～1∶4；

该反应步骤中，如果Z是氯或者溴，在反应的过程中可以加入少量KI作为催化剂，有利于提高反应的速率，缩短反应时间。

(2)溴乙酸与三氯氧膦和DMF反应生成带多个醛基的中间体III，溴乙酸与三氯氧膦的投料摩尔比1∶4～1∶6，反应的温度70±2℃；

该反应步骤中，由于DMF是溶剂，因此其与溴乙酸的投料比例无需进行限定。

(3)将步骤(1)制得的季铵盐II和步骤(2)制得的中间体III在乙醇溶剂中，吡啶催化下回流2～6小时，制得式IV的中位醛基取代的五甲川菁荧光染料；当中间体III与季铵盐II的投料摩尔比是1∶3时，产物是对称的中位醛基取代的五甲川菁荧光染料；当使用两种不同的季铵盐，并且中间体III、第一季铵盐及第二季铵盐的投料摩尔比是1∶0.8～1∶1～3时，产物是非对称的中位醛基取代的五甲川菁荧光染料；

(4)以甲醇为溶剂，使步骤(3)中制得的化合物IV与硼氢化钠反应得化合物V

该步反应中，加入硼氢化钠的量要尽可能的少，最好是刚好将染料的正电荷还原，避免中位的醛基被还原。可通过反应溶液的颜色变化来灵敏地控制，化合物溶液颜色呈深蓝色，向里面缓慢的加入硼氢化钠，边加边搅拌直到溶液中蓝色刚好消失，变为黄色，即停止加入硼氢化钠。

(5)步骤(4)制得的化合物V与R₃CH₂R₄在碱性试剂存在条件下反应制备化合物VI；反应溶剂是无水甲醇，反应温度25～40℃，化合物V与R₃CH₂R₄的投料摩尔比1∶2～1∶4；其中的碱性试剂优选哌嗪；

(6)步骤(5)制得的化合物VI常温下氧化脱氢制备化合物VII，溶剂是二氯甲烷或氯仿，氧化脱氢试剂是2，3，5，6-四氯-1，4-对苯二醌或2，3-二氯-5，6-二氰基-1，4-对苯二醌，化合物V与氧化脱氢试剂的投料摩尔比1∶0.5～1∶1；

(7)将化合物IV和化合物VII与含Y^-阴离子的钠盐或钾盐进行负离子置换，得到式I的化合物。

本发明的再一目的是提供利用上述五甲川菁荧光染料检测流体粘度的方法，尤其是用于检测组织、细胞水平流体粘度的方法。

本发明所公开的中位取代五甲川菁染料具有双吸收和发射峰；该类化合物的荧光性能对溶液粘度非常敏感，随着溶剂粘度的增加，染料的发射强度迅速增加，而且符合

-Hoffmann关系式，在各发射峰处的强度的比例值，荧光寿命与粘度的对数值呈线性变化，也符合

-Hoffmann关系式，能同时使用两种方法测试化合物所处溶液环境或者生物环境的粘度。利用此类染料，可同时用比例成像和荧光寿命成像两种方法来对细胞进行研究，并可以借此采用比例成像法来检测细胞内粘度的变化。

附图说明

本发明附图11幅，其中：

图1是化合物4在不同溶剂中的吸收和发射光谱(λ_ex＝600nm和400nm，1μM)以及荧光增强倍数；

图1A是：化合物4在不同溶剂中的吸收光谱，其中(1)二氯甲烷；(2)乙腈；(3)二甲基亚砜；(4)乙醇；(5)甲醇；(6)水。

图1B是：化合物4在不同溶剂中的发射光谱，其中(1)二氯甲烷；(2)乙腈；(3)二甲基亚砜；(4)乙醇；(5)甲醇；(6)水。

图2A是化合物4(1μM)在不同粘度溶液中的吸收光谱的变化(λ_ex＝410nm和600nm)以及在各发射峰处的荧光增加倍数；

图2B是化合物4(1μM)在不同粘度溶液中发射光谱的变化(λ_ex＝600nm)

图2C是化合物4(1μM)在不同粘度溶液中发射光谱的变化(λ_ex＝410nm)

图2D是化合物4(1μM)在410nm处激发的时候在460nm和650nm发射峰处的荧光增加倍数。

图3A是化合物4的荧光强度的对数与溶剂粘度的对数的线性关系；

图3B是化合物4在两发射峰强度处比值的对数与粘度对数之间的线性关系；

图4是化合物7在不同粘度溶液中紫外吸收和荧光发射光谱的变化以及荧光强度比值的对数与溶液粘度对数之间的线性关系，其中，

图4A是化合物7(1μM)在不同粘度溶液中的吸收光谱的变化；

图4B是化合物7(1μM)在不同粘度溶液中发射光谱的变化(λ_ex＝510nm)；

图4C是化合物7(1μM)的在665nm和565nm处荧光强度比值的对数与溶液粘度对数之间的线性关系；

图5是化合物7在不同粘度溶液中的荧光寿命变化，其中：

图5A是染料7(1μM)在不同体积比例(粘度)的甘油-乙醇混合溶剂中的荧光寿命曲线，激发波长460nm，检测波长665nm；

图5B是化合物7荧光寿命的对数与粘度对数之间的线性关系，所采用荧光寿命仪的型号：Horiba Jobin Yvon Fluoromax-4p。

图6是化合物4(5μM)在MCF-7细胞中的荧光成像，Leica激光共聚焦荧光显微镜×100objective lens，激发波长800nm，其中：

图6A是蓝色通道荧光图片；

图6B是红色通道荧光图片；

图6C是蓝色与红色通道的叠加图片；

图6D是图4B与图4A的荧光比例图片。

图7是化合物4在不同粘度的甘油-乙醇混合溶液中的荧光寿命谱图以及荧光寿命的对数与粘度对数之间的线性关系，所采用荧光寿命仪的型号：HoribaJobin Yvon Fluoromax-4p；激发波长376nm，其中：

图7A是化合物4(1μM)在不同比例甘油-乙醇混合溶剂中的荧光寿命谱图，激发波长376nm，检测波长650nm；

图7B是化合物4的荧光寿命的对数与溶液粘度对数之间的线性关系；

图8是化合物4(5μM)在MCF-7细胞中的荧光强度以及荧光寿命成像，其中：

图8A是化合物4在MCF-7细胞中的荧光强度成像；

图8B是化合物4在MCF-7细胞中的荧光寿命成像，激发波长800nm；

图9是化合物7在MCF-7细胞中的荧光图。λex＝514nm，Leica TCS-SP2激光共聚焦显微镜。放大倍数100×物镜；其中：

图9A：化合物7(5uM)与MCF-7细胞一起孵育30分钟；

图9B：MCF-7细胞先用H₂O₂(1mM)处理30分钟促使细胞凋亡，然后用磷酸缓冲夜清洗后再与化合物7(5uM)一起孵育30分钟；

图9C：MCF-7细胞先用乙醇固定30分钟后用磷酸缓冲夜清洗，再与化合物7(5uM)一起孵育30分钟；

图9D：化合物7(5uM)与MCF-7细胞一起孵育30分钟后，再在室温下放置4小时后的荧光相片。

图10是化合物7在MCF-7细胞中的比例荧光成像。λex＝514nm，LeicaTCS-SP2激光共聚焦显微镜。放大倍数100×物镜；其中：

图10A：化合物7(5uM)与MCF-7细胞一起孵育30分钟(分别是绿色通道荧光相片，红色通道荧光相片，白光细胞图以及前三者的叠加图)；

图10B：MCF-7细胞先用H₂O₂(1mM)处理30分钟促使细胞凋亡，然后用磷酸缓冲夜清洗后再与化合物7(5uM)一起孵育30分钟(分别是绿色通道荧光相片，红色通道荧光相片，白光细胞图以及前三者的叠加图)；

图10C：MCF-7细胞先用乙醇固定30分钟后用磷酸缓冲夜清洗，再与化合物7(5uM)一起孵育30分钟(分别是绿色通道荧光相片，红色通道荧光相片，白光细胞图以及前三者的叠加图)；

图10D：化合物7(5uM)与MCF-7细胞一起孵育30分钟后，再在室温下放置4小时后的荧光成像(分别是绿色通道荧光相片，红色通道荧光相片，白光细胞图以及前三者的叠加图)。

图11是化合物4和化合物7的合成流程简图。

具体实施方式

下面的实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1

化合物4和化合物7的合成

化合物4和化合物7的合成流程简图如附图11所示。

(1)2，3，3-三甲基-3H-吲哚啉(化合物1)的合成按照fisher吲哚合成方法：

称量苯肼54g(0.5mol)加入到250mL两口瓶中，搅拌下缓慢滴加3-甲基-2-丁酮43g(0.5mol)加热到70～80℃，反应4小时，分去水层，水层用乙醚萃取，与乙醚层合并后用无水硫酸镁干燥过滤，减压蒸出溶剂，即得到粗制的腙70g，收率80％。

将上步粗制的腙70g(0.4mol)与150mL冰醋酸混合，在90℃油浴中反应3小时，冷却至室温，用饱和碳酸钠水溶液中和水层至中性，分离水相和有机相，水相用乙醚萃取，萃取液与有机相合并，无水硫酸钠干燥过滤后蒸出乙醚，再减压蒸馏，收集130～140℃(0.08～0.09Mp)沸程的馏分。产品为单换色油状液体52g(收率82％)。

(2)碘化N-乙基-2，3，3-三甲基-3H-吲哚啉季铵盐(化合物2)的合成

将3.2g(20mmol)的2，3，3-三甲基-3H-吲哚啉和4.7g碘乙烷混合于100mL圆底烧瓶中，加入约30mL甲苯，于氮气保护下加热回流7小时，停止加热冷却至室温，过滤生成的固体，用乙醚洗涤得到粉红色固体季铵盐5.4g(收率86％)。

(3)2-甲酰基-1，3-丙二醛(化合物3)的合成

冰浴条件下，将三氯氧磷(13.8mL，147mmol)逐滴滴入DMF(40mL，518mmol)，1小时内滴完，控制滴加速度保证在滴加过程中温度不要超过5℃，刚开始溶液呈绿色滴加完毕颜色变成橙色，移去冰浴，粘稠的混合物在室温下继续搅拌1小时。将溴乙酸(7.15g，51mmol)分批加入，混合物在70℃下反应24小时，棕色反应液用约200mL水分解，小心用Na₂CO₃中和至pH为8左右，加入2L无水乙醇，过滤掉无机盐，残余有机相溶液用空气流缓慢蒸干得到黄白色残余物，用硫酸(50％，10mL)中和，然后用氯仿萃取(3×200mL)无水MgSO₄干燥得到的残余物进一步升华得到纯的黄色晶体1.9g，产率37％。

(4)氯化1，5-二(1-N-乙基-3，3-二甲基-2-3氢-吲哚啉基)-3-甲酰基-1，3，5-戊三烯季铵盐菁染料(化合物4)的合成

取碘化1-乙基-2，3，3-三甲基-3H吲哚啉盐(1.3g，4mmol)，丁三醛(3)(0.2g，2mmol)于50ml圆底烧瓶中，依次向其中加入无水乙醇20mL和几滴吡啶，氮气保护下加热回流1小时，溶液变成深蓝色，冷却至室温，减压蒸干溶剂，先用水洗涤产物，二氯甲烷萃取(3×20mL)，无水Na₂SO₄干燥，旋转蒸发除去溶剂，硅胶色谱层析分离纯化，用无水甲醇/二氯甲烷(1/400，v/v)展开剂冲洗，收集蓝色组分，得到产物0.45g，产率约51％。产物结构鉴定的核磁和质谱数据如下：

¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)：1.56(t，6H，CH₃，J＝7.2Hz)，1.86(s，6H，CH₃)，4.51(q，4H，CH₂，J＝7.2Hz)，7.22(bp，2H，CH)，7.33(d，2H，ArH，J＝8.4Hz)，7.38(t，2H，ArH，J＝7.6Hz)，7.46(d，2H，ArH，J＝7.6Hz)，7.49(t，2H，ArH，J＝8.0Hz)，8.26(d，2H，CH，J＝14.4Hz)，9.76(s，1H，CH，)

¹³C-NMR(100MHz，CDCl₃)：12.86，28.39，41.83，50.93，102.38，112.14，120.32，122.83，127.09，129.18，141.33，142.25，177.85，189.74

HRMS-ESI：m/z calcd M⁺ for C₃₀H₃₅N₂O⁺，439.2749；found，439.2764

(5)还原的氯化1，5-二(1-N-乙基-3，3-二甲基-2-3氢-吲哚啉基)-3-甲酰基-1，3，5-戊三烯季铵盐菁染料(化合物5)的合成

取氯化1，5-二(1-N-乙基-3，3-二甲基-2-3氢-吲哚啉基)-3-甲酰基-1，3，5-戊三烯季铵盐菁染料(化合物4)(0.566g，1mmol)溶于15mL的甲醇中得到深蓝色溶液，然后将硼氢化钠(10mg，0.25mmol)加入上述溶液中，磁力搅拌，室温下搅拌溶液直到溶液变成黄色，减压蒸馏除掉溶剂，采用硅胶柱色谱简单纯化产品，用二氯甲烷作为洗脱剂，得到浅黄色产品约0.41g，产率93.2％。产物结构鉴定的核磁数据如下：

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：1.10(t，3H，CH₃，J＝6.4Hz)，1.14(s，3H，CH₃)，1.27(t，3H，CH₃，J＝6.4Hz)，1.34(s，3H，CH₃)，1.68(s，6H，CH₃)，3.17(q，1H，CH₂，J＝6.8Hz)，3.33(q，1H，CH₂，J＝6.8Hz)，3.75(q，2H，CH₂，J＝6.8Hz)，5.99(d，1H，CH，J＝12.8Hz)，6.43(d，1H，ArH，J＝8.4Hz)，6.49(d，1H，ArH，J＝7.6Hz)，6.57(d，1H，CH，J＝16.0Hz)，6.68(t，1H，ArH，J＝7.2Hz)，6.78(d，1H，ArH，J＝7.6Hz)，7.01(t，2H，ArH，J＝6.8Hz)，7.08(t，1H，ArH，J＝7.2Hz)，7.24(t，2H，ArH，J＝7.2Hz)，7.49(d，1H，CH，J＝13.2Hz)，9.41(s，1H，CHO)

(6)还原的氯化1，5-二(1-N-乙基-3，3-二甲基-2-3氢-吲哚啉基)-3-(2，2-二氰基乙烯基)-1，3，5-戊三烯季铵盐菁染料(化合物6)的合成

取中间体(化合物5)(1.33g，3mmol)，丙二腈(0.66g，10mmol)和无水哌嗪(0.86g，10mmol)，一起溶于30mL的无水甲醇中，氮气保护下室温搅拌过夜，反应液变成粉红色，减压蒸馏除掉溶剂，得到的残余物通过硅胶柱色谱分离纯化，二氯甲烷作为洗脱剂，得到具有金属光泽粉末1.3g，产率89％。产物结构鉴定的核磁数据如下：

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：1.12(t，3H，CH₃，J＝8.0Hz)，1.29(t，3H，CH₃，J＝8.0Hz)，1.4(s，6H，CH₃)，1.67(s，6H，CH₃)，3.3(q，4H，CH₂，J＝8.0Hz)，5.86(bp，1H，CH)，5.95(d，1H，CH，J＝12.0Hz)，6.52(bp，1H，CH)，6.70(bp，2H，ArH)，6.89(d，1H，ArH，J＝8.0Hz)，7.02(t，1H，ArH，J＝8.0Hz)，7.11(t，2H，ArH，J＝8.0Hz)，7.19(s，1H，CH)，7.30(t，2H，ArH，J＝8.0Hz)，7.71(d，1H，CH，J＝12.0Hz)

(7)氯化1，5-二(1-N-乙基-3，3-二甲基-2-3氢-吲哚啉基)-3-(2，2-二氰基乙烯基)-1，3，5-戊三烯季铵盐菁染料(化合物7)的合成

0.98g化合物6(2mmol)溶于20mL的无水二氯甲烷中，然后将2，3-二氯-5，6-二氰基-1，4-对苯二醌(DDQ，0.452g，2mmol)加入上述溶液中，室温下搅拌，TLC薄层色谱监测反应完成，溶液从粉红色变成深蓝色，然后减压蒸馏除掉溶剂，饱和食盐水洗涤，然后二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，减压除掉溶剂得到的残余物通过硅胶柱色谱分离(采用99/1(v/v)的二氯甲烷/甲醇作为洗脱剂)得到具有金属光泽粉末0.56g，产率53.6％。产物结构鉴定的核磁及质谱数据如下：

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：1.54(t，6H，CH₃，J＝6Hz)，1.83(s，12H，CH₃)，4.59(q，4H，CH₂，J＝6.0Hz)，6.66(d，2H，CH，J＝14.8Hz)，7.34(d，2H，ArH，J＝8.0Hz)，7.39(d，2H，ArH，J＝7.2Hz)，7.46(t，4H，ArH，J＝7.2Hz)，8.03(s，1H，CH)，8.53(d，2H，CH，J＝14.8Hz)；

¹³C-NMR(100MHz，CDCl₃)：12.95，27.55，41.26，51.03，102.92，112.26，115.45，116.16，116.96，122.63，127.34，129.01，140.96，142.39，148.81，154.18，177.37

HRMS-ESI：m/z calcd M⁺ for C₃₃H₃₅N₄ ⁺，487.2862；found，487.2866

实施例2

化合物4和化合物7的光谱特征检测及分析

首先配制化合物4和7的二甲基亚砜母液，然后使用相应的色谱级溶剂进行稀释得到的，测试液的浓度是1μM。室温下测试在不同溶剂中的紫外吸收和荧光发射光谱，其结果分别如图1A和1B，并检测化合物4，化合物7和乙基-Cy5的光谱性能，其结果如表1。

从检测结果可知：与传统的五甲川菁染料相比(ethyl-Cy5)，作为荧光探针，化合物4和化合物7都有两组吸收和发射峰，它们分别位于400nm，610nm和456nm，650nm以及510nm，655nm和565nm，668nm。在乙醇中，化合物4、化合物7和乙基Cy5的荧光量子产率分别是0.0108，0.0048和0.27，前二者远低于传统Cy5的荧光量子产率(如表1)，所示并且这两种染料的荧光量子产率随溶剂极性变化较小，即染料受溶剂极性的影响很小，对溶剂不敏感。从结构上，相当于两个荧光染料叠加在一起，两组长波长的吸收和发射(610nm，650nm和655nm，668nm)分别对应于菁染料正常的吸收和发射峰；而两组短波长峰(400nm，460nm和510nm，565nm)的产生是由于中位共轭基团(醛基或者丙二腈乙烯基)的引入产生了一组新的电子跃迁态的，即短共轭链荧光团的跃迁产生，两个荧光染料之间在激发态发生分子内电荷的再分布，就可以用短波长的激发产生长波长的发射(结果见附图1和表1)，这样可以得到大的假斯托克斯位移(在乙醇中，假斯托克斯位移分别是254nm和158nm)。探针对环境粘度是非常敏感的，随着溶剂粘度的增加，染料的荧光强度迅速增加，但是紫外吸收光谱受到粘度影响不大。

表1化合物4和化合物7与传统乙基Cy5的光谱性能比较

表1中，^a是染料在不同溶剂中的最大吸收和发射波长(nm)；

^b是斯托克斯位移(nm)，Δλ₁＝λ_em1-λ_abs1，Δλ₂＝λ_em2-λ_abs2，Δλ₃＝λ_em2-λ_abs1；

^c是摩尔消光系数(×10⁴L/cm·mol)；

^d是选用罗丹名B在乙醇中的荧光量子产率为0.97作为参比标准，染料的吸收波长选用第一个吸收波长作为激发波长。

实施例3

化合物4和化合物7的粘度试验

分别配制浓度为1×10^-3M的化合物4和化合物7的DMSO溶液，精确量取10μL该溶液加入到10mL甘油-乙醇溶液中，超声10分钟，除掉气泡后静置1小时，在紫外分光光度仪和荧光光度仪上测量其吸收和发射光谱以及测试各粘度溶液染料的荧光寿命。所选用激发波长是376nm。所用仪器为紫外可见分光光度计，型号：Hp8453；荧光分光光度计，型号：FP-6500，荧光寿命测试仪：HoribaJobin Yvon Fluoromax-4p。

其中，甘油-乙醇溶液包括甘油、乙醇以及V_甘油∶V_乙醇分别是1∶9，2∶8，3∶7，4∶6，5∶5，6∶4，7∶3，8∶2，9∶1的两相混合溶液。

当上述配制好的溶液在一定温度下静置一段时间待气泡消除后，在紫外吸收光谱仪和荧光仪上测的各种体积比下化合物的紫外吸收光谱(如图2A)和荧光发射光谱(如图2B，2C)，从图1可以知道染料在不同种类的低粘度溶剂中的吸收和发射变化不大，说明染料对溶剂的极性不敏感。而当逐渐增加溶剂的粘度的时候，染料的紫外吸收也变化不大，但是荧光发射却随着粘度的增加明显增加，不管是在600nm处激发，还是400nm处激发，染料在650nm和456nm发射处的荧光强度增加倍数分别达到15倍和4倍(如图2D)；而且荧光强度的对数与溶液的对数之间保持较好的线性关系(如图3A)，符合

-Hoffmann公式，可以用来检测均匀溶剂中的粘度；另一方面650nm处的荧光强度与456nm处的荧光强度的比值的对数与溶剂粘度的对数之间也保持很好线性关系(如图3B)，可以用来检测生物环境(如细胞内)的粘度。

相比化合物4和乙基-Cy5的光谱性能，化合物7的最大吸收和发射波长都有红移，而且也是两组吸收和发射峰，其荧光量子产率在低粘度不同极性的溶剂中都很低，如表1所示，在小极性的二氯甲烷中，化合物7在不同发射峰处的荧光量子产率只有0.0016和0.006，而在大极性的水中在两个发射峰处的荧光量子产率分别是0.0006和0.0028，极性变化很多大，粘度变化不大，染料的荧光量子产率变化也不大，说明染料对溶剂的极性也不敏感。

化合物7在不同粘度的溶液中也得到与化合物4类似的结果，荧光增加很多，如图4所示，化合物7的紫外吸收随着溶液粘度的变化，在两吸收峰处的吸光度变化较小(图4A)，而其在发射峰处荧光强度随着溶液粘度的增加，很显著的增强(图4B)，而且在665nm处的荧光强度比565nm处的增加幅度大。在两发射峰处的荧光强度之比的对数值与溶液粘度对数值之间也很好的满足

-Hoffmann公式(图4C)，可以用来测试溶液中粘度值。化合物7在发射峰665nm处的荧光寿命也随着溶液的粘度很明显的增长(图5A)，寿命与溶液粘度的关系也较好的符合

-Hoffmann公式(图5B)，也就是说，化合物7也能采用两种模式来检测溶液的粘度，这与化合物4得到的结论是一致的。

化合物4和化合物7的荧光量子产率都很低，在生物方面产生低的本底荧光，由表1可知化合物4和化合物7对溶剂的极性不敏感。化合物4和化合物7的荧光发射强度对溶剂的粘度比较敏感。随着溶剂粘度的增加，探针的荧光发射强度迅速增加，采用长波长激发，探针的长波长处的发射强度随之增加，在短波长处激发，其在短波长的发射强度和长波长处的发射强度都随着增加，增加幅度分别是起始时的15和4倍。而且荧光强度的对数与溶液粘度的对数之间满足很好的线性关系符合

-Hoffmann公式(式1)：

LogI_f＝C+xlogη(式1)

式1中：I_f为染料的荧光强度；C为温度常数；x为染料的常数；η为溶剂的粘度。

因为有两组发射峰，而且随着粘度的增加，在各发射峰处的荧光增加倍数不相同，所以对两组发射峰处的荧光强度作比。发现两者的比值的对数与粘度的对数也是很好的线性关系，也很好的符合

-Hoffmann。因此，可以把化合物4和化合物7用作比例探针(结果见附图3和图4)。

在溶液中，如果染料的浓度不均匀，那么荧光强度也会受到影响，增加误差，影响到经测量的精确度。因此为了尽量排除这些原因引起的误差，采用比例的方法是能满足的要求的。荧光染料的荧光寿命的长短也是不受到染料浓度的影响的，也能达到相同的效果。根据Suhling等人的工作可知，根据染料在不同粘度环境中的荧光寿命是不同的，采用荧光寿命的方法可以对环境的粘度进行测试。

根据附图5和7的结果可知，在溶液中的粘度较低的情况下，染料4的荧光寿命增加是不明显的，一旦溶液的粘度达到较大后，染料的荧光寿命会很明显的增加，从纯乙醇中不足50ps增加到99％的甘油中的1450ps。而且荧光寿命的对数与溶液粘度的对数成线性关系，满足

-Hoffmann关系式，化合物7的荧光寿命与化合物4的变化规律是一致的，故化合物4和7都能用来检测染料的荧光寿命来测量溶液或者生物环境的粘度。

实施例4

化合物4和化合物7的细胞实验

激光共聚焦扫描显微镜下观察化合物对活细胞MCF-7的染色：

加配有化合物4和7浓度为5μM的PBS缓冲液12μL于培养好MCF-7细胞的六孔板中，在37℃，5％CO₂的细胞培养箱中孵育30min。然后，PBS震荡漂洗5min×3，再加入细胞培养基，激光共聚焦扫描显微镜(Leica，TCS-SP2，Germany)观察细胞形态。选取代表性区域，分别选用Cy5(633nm)通道激发传统Cy5和绿光514nm激发化合物7，用油镜(1000×)观察，重复三次。

图6和图9分别是化合物4和化合物7对活细胞MCF-7染色的荧光显微照片；如图可观察到传统Cy5和化合物4对MCF-7细胞质的特异性染色对比。所用仪器为激光共聚焦扫描显微镜，型号：TCS-SP2。激发光通道：分别选用Cy5(633nm)，绿光(543nm)，青光(488nm)和蓝光(388nm)。

染料直接染色：

将可传代MCF-7和Hela细胞接种于6孔板，37℃，5％CO₂条件下培养24小时，加入染料，终浓度为5μM，37℃孵育30min，吸掉培养基，PBS洗2遍，加入1200μL新鲜培养基，照荧光。

H₂O₂损伤：

将可传代MCF-7和Hela细胞接种于6孔板，37℃，5％CO₂条件下培养24小时，加入133.3μL H₂O₂，终浓度为1mM/L，37℃孵育2h，吸掉原培养基，用PBS洗2遍，加入1200μL新鲜培养基，加入染料，终浓度为5μM，37℃孵育30min，吸掉培养基，PBS洗2遍，加入1200μL新鲜培养基，照荧光。

乙醇固定：

将可传代MCF-7和Hela细胞接种于6孔板，37℃，5％CO₂条件下培养24小时，吸掉培养基，用PBS洗2遍，加入适量70％乙醇，37℃孵育30min，吸掉固定用乙醇，用PBS洗2遍，加1200μLPBS，加入染料，终浓度为5μM，37℃孵育30min，照荧光。

本专利所涉及的染料具有细胞膜的通透性，小分子染料具有活细胞膜渗透性。进入到细胞内后，探针在细胞不同位置分布，荧光强度不同程度的增强，实验结果见附图6，是化合物4在MCF-7细胞内的成像结果，由于染料有两组发射波长分别位于460nm和650nm，那么就采用双通道检测，短波长通道取(460±20)nm的蓝色通道(如图6A)；长波长则是取(650±20)nm的红色通道(如图6B)，两者的叠加图片呈粉红色(如图6C)，而对两通道的荧光强度做比值后，得到化合物4在MCF-7细胞内的比例成像图(如图6D)，根据图片能很清楚的看出，细胞内不同粘度位置的分布，达到对细胞内粘度分布比例成像的目的。

根据Suhling等人的工作，探针的荧光寿命对数与粘度对数是线性关系，很好的符合

-Hoffmann关系式，化合物4是可以用来对细胞内的粘度分布进行荧光寿命成像的。由附图8的结果可以看出，化合物4在MCF-7细胞内的分布可以通过荧光强度的图看出，整个细胞内都是有染料存在的，由荧光寿命成像的图(如图8)可以看出，化合物4在不同环境中的荧光寿命的不同的，也反映出细胞内不同位置的粘度不同，进而通过化合物4的在细胞内的荧光寿命成像清楚的表现出来。

通过上述结果可以看出，比例成像的结果和荧光寿命成像的结果是一致的，细胞内比值比较大的位置对应的荧光寿命也比较长，这也互相证明比例成像和荧光寿命成像的准确性。

以上主要针对化合物4讲述其对细胞的比例成像检测和荧光寿命成像检测，化合物7与化合物4具有同样的效果，也能采用双模式对细胞内的粘度分布进行检测成像。

根据附图9和附图10的结果可以看出。化合物7有两组发射波长分别位于565nm和665nm，采用双通道检测，绿色通道(565±20)nm和红色通道(665±20)nm.分别做了四组细胞，第一组是细胞与化合物7在一起孵育好了后直接在激光共聚焦显微镜下观察结果；第二组是染料与细胞培养好了后再向其中加入双氧水(1mM)再孵育半小时诱导细胞凋亡；第三组是直接使用无水乙醇将细胞杀死固定；第四组是将细胞与化合物7一起培养好了后，在室温下放置4小时后观察到的结果，实验结果见附图9。用Image Pro-plus软件将结果处理得到各组比例成像图片，如结果所示，第一组结果表明正常活细胞中的粘度较低，染料在细胞中呈现蓝色较多，比例值较小；当细胞被双氧水处理过细胞逐渐凋亡后，细胞内的颜色明显增加，比例值增加，细胞内的粘度也相应的增加了；细胞被固定后，细胞确定是死亡了，得到的化合物7的结果与第二组类似；而第四组结果是细胞处于凋亡过程中，探针的比例值也位于第一组第二组之间，是一种中间状态。故化合物7可用来检测细胞内的粘度变化和研究细胞凋亡过程。

Claims (2)

1.一类五甲川菁荧光染料在检测流体粘度中的应用，所述五甲川菁荧光染料具有如下结构通式I：

其中：

X为CHO或CHC(CN)₂；

R₁和R₂各自独立选自(CH₂)_nR₇；

R₅、R₆和R₇均为H；

Y^-为卤素负离子或者OTs^-；

n为0～18的整数。

2.权利要求1所述的应用，其特征在于所述的R₁和R₂为CH₃。

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