CN102702769B - 一类绿光荧光菁染料、制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一类绿光菁类荧光染料，具有如下结构通式Ⅰ，式中：X为C(CH₃)₂、O、S或Se；R₁和R₂各自独立地选自H、C_1-18烷基、OR₆、C_1-6烷基OR₆或卤素。R₃为N(R₅)(R₇)；R₄选自C_1-18烷基、苄基和取代苄基，所述的取代苄基由以下基团任意取代：C_1-18烷基、CN、COOH、NH₂、NO₂、OH、SH、C_1-6烷氧基、C_1-6烷基氨基、C_1-6酰氨基、卤素或C_1-6卤代烷基；R₅和R₇各自独立地选自H或C_1-18烷基；R₆为H或C_1-18烷基；Y^-为负离子。该荧光染料可用于DNA定量检测以及生物染色，应用于核酸标记、血细胞分析、临床医疗诊断、免疫分析检测等领域。

Description

一类绿光荧光菁染料、制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及精细化工领域中一类新的荧光染料、制备方法及其应用，特别是涉及一类单电荷含氮菁类荧光染料、其制备方法，以及利用该荧光染料、其缀合物或其组合物在生物方面的应用。

背景技术

DNA（脱氧核糖核酸）是一类带有遗传信息的生物大分子。生物体正常细胞均具有比较稳定的DNA二倍体含量，只有当发生癌变或具有恶性潜能的癌前病变时，才伴随细胞DNA含量的异常改变。因此对DNA的特异性识别和精确测量，尤其是在活细胞内的检测，在癌症的早期诊断中意义非常重大。利用荧光技术进行DNA的定量分析具有灵敏度高、响应快、仪器使用便捷等优点引起广大科研工作者的兴趣。目前，商品化的此类染料主要有菲啶类(EB、PI)、吖啶类(AO)、咪唑类(Hoechst、DAPI)和花菁家族类(Cy、TOTO、SYTO)等。然而，这些染料都各自存在着应用的局限性。其一，较大一部分染料与DNA结合后呈现荧光淬灭，如10,10’-二乙基-2,2’-二磺基-9,9’-双吖啶、藏红T、耐而蓝、甲基蓝等淬灭型DNA探针虽然报道检出限最低可达ng/mL级，但淬灭的荧光信号在荧光成像等可视化应用中实用价值不高。其二，有相当一部分荧光染料的激发光处在紫外光区，如能够专一识别脱氧核糖核酸(DNA)的荧光染料DAPI、Hoechst 33258，Hoechst 34580等，在紫外光激发下与DNA结合产生蓝色荧光。由于紫外光对细胞内的核酸、蛋白等组分会造成严重的损伤，因此这类荧光在荧光显微技术中的使用受到光激发时间的限制[Davis SK,Bardeen C,J.Photochem Photobiol2003;77:675–679]。此外，在紫外区进行荧光检测时，生物样品在这个区间的吸收使光进入生物组织内部变得困难，同时生物样品中某些成分的自发荧光形成很强的背景干扰，使检测效率大大降。其三，有相当一部分染料应用受限于固定细胞，如TOPRO、TOTO家族染料、溴乙锭(EB)、碘化丙啶(PI)等需要通过增大细胞膜的通透性或类似使膜崩解的方法才能对生物样品进行有效的荧光标记。然而，这种固定方法往往对细胞和生物组织真实形态的观察有负面影响[Kozubek S,Lukasova E,Amrichova J,Kozubek M,Liskova A,Slotova J.Anal Biochem2000;282:29-38]。同时，溴乙锭等吖啶，菲啶类染料有很大的毒性和致癌性。Invitrogen公司开发了可在溶液中定量超灵敏检测dsDNA的试剂盒Quant-iT PicoGreen（Ex/Em=502/523nm，检测范围：0.2-100ng/mL），但该染料结构尚不明确，价格也非常昂贵。因此，开发可同时满足激发和发射波长良好，对DNA有特异性并定量检测、及活细胞通透性的荧光探针是一项极具挑战性的工作。

在众多种类的荧光染料中，菁类荧光染料以其波长范围宽，摩尔消光系数大，荧光量子产率适中等优点，作为生物分子荧光探针、CD和VCD记录材料、感光材料光敏剂、光电转换材料等已被广泛的应用。其中喹啉类不对称菁类荧光染料与核酸有高度亲和力，而与其他生物大分子基本不结合的特异性使其在基因组学技术、核酸定量检测、血细胞分析等领域的应用中脱颖而出。该类化合物与核酸的结合方式包括静电吸引、碱基对嵌入及沟槽结合。具体的结合方式与结合能力取决于该标识物的结构及其与核酸浓度的比例。不对称菁类化合物中最典型的为TOTO及其类似物(YOYO)和衍生物类(TOPRPO)。TOTO(噻唑橙二聚体)、YOYO(恶唑黄二聚体)是由Glazer研究组开发的一类对核酸具有高度亲和力的多正电荷不对称菁类荧光染料，通过改变多亚甲基链的长度和两端的芳香母核(噻唑、恶唑、喹啉、吡啶和吲哚啉)的结构可以得到不同的异二聚体类似物和衍生物。这类染料在溶液中几乎无荧光，降低了检测过程中的荧光背景干扰，与核酸结合后荧光增强。Jason等用溶液粘度测定法和原子力显微镜解释了TOTO和YOYO与DNA的双嵌入作用[J.A.Bordelon,K.J.Feierabend,S.A.Siddiqui,L.L.Wright.J.Phys.Chem.B,2002,106,4838-3843]。Fürstenberg等利用超快速荧光转换和时间相关单光子计数法进一步阐述了荧光增强的动力学机理。[A.Fürstenberg,M.D.Julliard,T.G.Deligeorgiec,N.I.Gadjev.J.AM.CHEM.SOC.,2006,128,7661-7669]此类染料中的有些品种已经商品化了，如：SYTOX Blue，TOTO，POPO，BOBO，YO-PRO等。但这些商品化的染料大部分分子较大，结构复杂，属活细胞非通透性，只能应用于活体外核酸的识别与检测。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，在其基础上改进，提供了一类结构简单、灵敏度高、激发波长合适、且具有良好的细胞膜通透性的新化合物。

本发明的目的之一在于提供一类绿光菁类荧光染料，具有如下结构通式Ⅰ：

通式Ⅰ中

X为C(CH₃)₂、O、S或Se；

R₁和R₂各自独立地选自H、C_1-18烷基、OR₆、C_1-6烷基R₆或卤素。

R₃为N(R₅)(R₇)；

R₄选自C_1-18烷基、苄基和取代苄基，所述的取代苄基由以下基团任意取代：C_1-18烷基、CN、COOH、NH₂、NO₂、OH、SH、C_1-6烷氧基、C_1-6烷基氨基、C_1-6酰氨基、卤素或C_1-6卤代烷基；

R₅和R₇各自独立地选自H或C_1-18烷基；

R₆为H或C_1-18烷基；

Y^-为负离子。

本发明所述的绿光菁类荧光染料，其中所述的R₁和R₂各自独立选自H、C_1-18烷基、OR₆和卤素。优选R₁为H或Cl，R₂为H或甲氧基。

本发明所述的绿光菁类荧光染料，其中所述的R₄选自C_1-18烷基、苄基和取代苄基，取代苄基由以下基团任意取代：COOH、NH₂、OH、C_1-6烷氧基或卤素。优选R₄选自C_1-6烷基、苄基和卤素取代苄基。

本发明所述的绿光菁类荧光染料，其中所述的R₅和R₇各自独立地选自H或C_1-6烷基。

本发明所述的绿光菁类荧光染料，其中所述的Y^-为卤素离子、ClO₄ ^-、PF₆ ^-、BF₄ ^-、CH₃COO^-或OTs^-。

本发明另一方面提供本发明所述的绿光菁类荧光染料的制备方法，包括以下步骤：

1)式IIa或IIb的化合物分别与R₄Z反应，分别制备第一季铵盐中间体IIIa或IIIb，其中Z为卤素或OTs,Z^-为反应生成的卤素负离子或OTs^-，R₈为卤素：

反应温度为10-180℃，反应时间为4-48小时，反应溶剂选自二氯甲烷、氯仿、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、甲苯、二甲苯、邻二氯苯、以及其中任意两种或两种以上按照任意比例组成的混合溶剂，式IIa或IIb的化合物与R₄Z的投料摩尔比为1:1-1:10；

2）使式V的化合物与化合物R₃(CH₂)₄Z反应制得第二季铵盐中间体VI，其中Z为卤素或OTs,Z^-为反应生成的卤素负离子或OTs^-：

反应温度为10-180℃，反应时间为4-48小时，反应溶剂选自二氯甲烷、氯仿、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、甲苯、二甲苯、邻二氯苯、以及其中任意两种或两种以上按照任意比例组成的混合溶剂，式Ⅴ的化合物与化合物R₃(CH₂)₄Z的投料摩尔比为1:1-1:10；

3）将步骤（1）中得到的第一季铵盐中间体IIIa或IIIb与步骤（2）中得到的第二季铵盐中间体Ⅵ反应，得到式VII的化合物：

反应温度为5-50℃，反应时间为30分钟到24小时，反应溶剂选自二氯甲烷、氯仿、甲醇、乙醇、乙二醇单甲醚、以及其中任意两种或两种以上按照任意比例组成的混合溶剂，催化剂为有机碱，式IIIa或IIIb的化合物与式VI的化合物的投料摩尔比为1.5:1-1:1.5；

4）将步骤3）中得到的式VII的化合物与含Y^-的钠盐或钾盐进行负离子置换，得到式Ⅰ的化合物：

反应温度为60-140℃，反应时间为10分钟到2小时，反应溶剂为DMF、DMSO或其混合溶剂，含Y^-的钠盐或钾盐与式VII的化合物的投料摩尔比为1:1-10:1。

本发明再一方面的目的在于提供本发明所述的绿光菁类荧光染料在生物样品染色中的应用。进一步，本发明还提供一种生物样品的染色方法，包括将上述任一本发明的绿光菁类荧光染料与生物样品接触的步骤。

本发明所述的绿光菁类荧光染料在不存在核酸时具有较低的荧光背景，与核酸结合后具有较高的荧光量子产率，且对核酸以外的生物分子无亲和力或亲和力可忽略不计；具有一定水平的水溶性，同时具有良好的细胞膜通透性，能进入活细胞中染色；光谱范围合适，不造成细胞或组织损伤。该荧光染料可用于DNA定量检测以及生物染色，应用于核酸标记、血细胞分析、临床医疗诊断、免疫分析检测等领域。

附图说明

本发明附图8幅，其中：

图1是实施例3的化合物A和商品化染料溴乙锭(EB)在pH 7.4、浓度10mM的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐缓冲液中，与小牛胸腺DNA结合前后相对荧光强度比照图。横坐标为波长(nm)，纵坐标为相对荧光强度。所用仪器为紫外可见分光光度计，型号：Hp8453；荧光分光光度计，型号：FP-6500。化合物A和溴乙锭(EB)的浓度均为0.5μM，小牛胸腺DNA的浓度为50μM。

图2A是实施例4的化合物B在pH 7.4、浓度10mM的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐缓冲液中，随小牛胸腺DNA浓度不断增大其荧光强度变化图。横坐标为波长(nm)，纵坐标为相对荧光强度。图2B是实施例4的化合物B在pH 7.4、浓度10mM的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐缓冲液中，随小牛胸腺DNA浓度不断增大，化合物B最大荧光发射峰强度与小牛胸腺DNA浓度的线性关系图。横坐标为小牛胸腺DNA浓度(μM)，纵坐标为相对荧光强度。所用仪器为紫外可见分光光度计，型号：Hp8453；荧光分光光度计，型号：FP-6500。化合物B的浓度均为0.5μM。

图3是化合物A和商品化染料噻唑橙（TO）在pH为7.4和浓度10mM的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐缓冲液中，与小牛胸腺DNA结合前后荧光量子产率对比图。所用仪器为紫外可见分光光度计，型号：Hp8453；荧光分光光度计，型号：FP-6500。化合物A和商品化染料噻唑橙均为1.5μM，小牛胸腺DNA的浓度为150μM。

图4是化合物A和商品化染料噻唑橙（TO）分别在pH 7.4、浓度10mM的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐缓冲液中，与牛血清白蛋白和小牛胸腺DNA结合前后的荧光增强倍数的对比图。所用仪器为荧光分光光度计，型号：FP-6500。化合物A和商品化染料噻唑橙（TO）的浓度均为0.5μM，牛血清白蛋白和小牛胸腺DNA的浓度均为为20μg/ml。

图5A为实施例3的化合物A对HeLa活细胞(人宫颈癌细胞)染色的白场显微照片，图5B是化合物A对HeLa活细胞染色的荧光显微照片。化合物A的浓度为5μM。所用仪器为共聚焦激光扫描显微镜，型号：FV1000IX81，Japan。激发光通道：488nm。

图6A为实施例4的化合物B对MCF-7活细胞(人乳癌细胞)染色的白场显微照片，图6B是化合物B对MCF-7活细胞染色的荧光显微照片。化合物B的浓度为5μM。所用仪器为共聚焦激光扫描显微镜，型号：FV1000IX81，Japan。激发光通道：488nm。

图7A为实施例5的化合物C对HeLa活细胞(人宫颈癌细胞)染色的白场显微照片，图7B是化合物C对HeLa活细胞染色的荧光显微照片。化合物C的浓度为5μM。所用仪器为共聚焦激光扫描显微镜，型号：FV1000IX81，Japan。激发光通道：488nm。

图8A为实施例6的化合物D对MCF-7活细胞(人乳癌细胞)染色的白场显微照片，图8B是化合物D对MCF-7活细胞染色的荧光显微照片。化合物D的浓度为5μM。所用仪器为共聚焦激光扫描显微镜，型号：FV1000IX81，Japan。激发光通道：488nm

具体实施方式

除另有说明外，本文中使用的术语具有以下含义。

本文中使用的术语“烷基”包括直链烷基和支链烷基。如提及单个烷基如“丙基”，则只特指直链烷基，如提及单个支链烷基如“异丙基”，则只特指支链烷基。例如，“C_1-6烷基”包括C_1-4烷基、C_1-3烷基、甲基、乙基、正丙基、异丙基和叔丁基。类似的规则也适用于本说明书中使用的其它基团。

本文中使用的术语“卤素”包括氟、氯、溴和碘。

本文中使用的术语“苄基”是指-CH₂-Ph基团。用“任选取代”修饰“取代苄基”是指该苄基可被合适的取代基在任何合适的位置取代，取代方式可以是单取代或各取代基团相互独立的多取代。合适的取代基包括但不限于H、C_1-18烷基、CN、COOH、NH₂、NO₂、OH、SH、C_1-6烷氧基、C_1-6烷基氨基、C_1-6酰氨基、卤素或C_1-6卤代烷基等，只要最终形成的化合物具有本发明期望的性质。

本文中使用Y^-表示负离子，其可为任何合适的负离子，包括但不限于无机负离子或有机负离子，例如卤素离子、ClO₄ ^-、PF₆ ^-、BF₄ ^-、CH₃COO^-或OTs^-。

本发明提供的一类绿光菁类荧光染料，其结构通式I的化合物中，X优选为C(CH₃)₂、O或S；更优选X为C(CH₃)₂或S；最优选X为S。

本发明一个具体实施方式中，R₁和R₂各自独立选自H、C_1-18烷基、OR₆和卤素；优选的，R₁和R₂各自独立选自H、C_1-12烷基、C_1-12烷氧基和卤素；更优选地，R₁和R₂各自独立选自H、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基和卤素；最优地，R₁为H或Cl，R₂为H或甲氧基。

本发明一个具体实施方式中，R₄是C_1-18烷基；优选C_1-12烷基；更优选C_1-6烷基。

本发明一个具体实施方式中，R₄是取代苄基；优选苄基或由COOH、NH₂、OH、C_1-6烷氧基或卤素任意取代的苄基；最优选苄基或卤素取代苄基。

本发明一个具体实施方式中，R₃为N(R₅)(R₇)，其中R₅与R₇相同，均选自C_1-18烷基，优选C_1-12烷基；最优选C_1-6烷基。

本发明一个具体实施方式中，R₃为N(R₅)(R₇)，其中R₅与R₇不同，二者之一是H，另一个基团选自C_1-18烷基，优选C_1-12烷基；最优选C_1-6烷基。

Y^-为卤素离子、ClO₄ ^-、PF₆ ^-、BF₄ ^-、CH₃COO^-或OTs^-，优选卤素负离子。

最优选地，本发明所述的荧光染料，选自如下化合物：

另一个方面，本发明还提供了上述化合物的制备方法，所述方法包括：

分别制备第一季铵盐中间体和第二季铵盐中间体，其中第一季铵盐包括由喹啉取代化合物和4-氯喹啉取代物作为原料制备各自季铵盐，然后将第一季铵盐与第二季铵盐中间体在有机碱存在的情况下反应得最终化合物。具体合成方案如下所述。

首先是制备第一季铵盐中间体，即式IIa或IIb的化合物分别与R₄Z反应，分别制备第一季铵盐中间体IIIa或IIIb，其中Z为卤素或OTs,Z^-为反应生成的卤素负离子或OTs^-，R₈为卤素：

反应温度为10-180℃，反应时间为4-48小时，反应溶剂选自二氯甲烷、氯仿、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、甲苯、二甲苯、邻二氯苯、以及其中任意两种或两种以上按照任意比例组成的混合溶剂，式IIa或IIb的化合物与R₄Z的投料摩尔比为1:1-1:10；

在一个优选的实施方式中，反应温度为40-140℃，反应时间为6-36小时，反应溶剂为选自：氯仿、乙腈、甲苯、二甲苯、邻二氯苯或、以及其中任意两种或两种以上按照任意比例组成的混合溶剂，式IIa或IIb的化合物与R₄Z的摩尔比为1:2-1:6。

在一个更优选的实施方式中，反应温度为60-120℃，反应时间为8-24小时，反应溶剂为乙腈、甲苯、邻二氯苯或其中任意二或三种按照任意比例组成的混合溶剂，式IIa或IIb的化合物与R₄Z的摩尔比为1:2-1:5。

在最优选的实施方式中，反应温度为80-110℃，反应时间为8-14小时，反应溶剂为甲苯、邻二氯苯或其混合溶剂，式IIa或IIb的化合物与化合物R₄Z的摩尔比为1:3-1:5。

在具体实施方案中，R₈为Cl或与Z相同的卤素原子。

通过与制备式IIIa或IIIb化合物类似的方法，使具有通式V的化合物与化合物R₃(CH₂)₄Z反应，制得第二季铵盐中间体VI，其中Z为卤素或OTs,Z^-为反应生成的卤素负离子或OTs^-：式V中，R₁优选含取代基R₁的2-甲基苯并噻唑、含取代基R₁的2-甲基苯并恶唑、含取代基R₁的2-甲基苯并硒唑、或含取代基R₁的2,3,3-三甲基-3H-吲哚啉反应原料，

反应温度为10-180℃，反应时间为4-48小时，反应溶剂选自二氯甲烷、氯仿、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、甲苯、二甲苯、邻二氯苯、以及其中任意两种或两种以上按照任意比例组成的混合溶剂，反应原料式Ⅴ化合物与化合物R₃(CH₂)₄Z的投料摩尔比为1:1-1:10。

在一个优选实施方式中，反应温度为60-140℃，反应时间为6-36小时，反应溶剂选自氯仿、乙腈、甲苯、二甲苯、邻二氯苯、以及其中任意两种或两种以上按照任意比例组成的混合溶剂，式V化合物与化合物R₃(CH₂)₄Z的投料摩尔比为1:2-1:6。

在一个更优选的实施方式中，反应温度为80-120℃，反应时间为10-24小时，反应溶剂为乙腈、甲苯、邻二氯苯、以及其中任意两种或三种按照任意比例组成的混合溶剂，式Ⅴ化合物与化合物R₃(CH₂)₄Z的投料摩尔比为1:2-1:5。

在一个最优选的实施方式中，反应温度为90-120℃，反应时间为12-18小时，反应溶剂为甲苯、邻二氯苯或其混合溶剂，式Ⅴ化合物与化合物R₃(CH₂)₄Z的投料摩尔比为1:3-1:5。

所制备的第一季铵盐中间体Ⅲa或IIIb与第二季铵盐中间体Ⅵ在有机碱作用下反应得式Ⅶ的单电荷含氮菁类化合物：

反应温度为5-50℃，反应时间为30分钟到24小时，反应溶剂选自二氯甲烷、氯仿、甲醇、乙醇、乙二醇单甲醚、以及其中任意两种或两种以上按照任意比例组成的混合溶剂，催化剂为有机碱。所述有机碱优选二乙胺、正丙胺、三乙胺、吡啶、哌啶或其中任意两种或两种以上以任意比例组成的混合物。式Ⅲa或IIIb化合物与式VI化合物的投料摩尔比为1.5:1-1:1.5；

在一个优选实例中，反应温度为15-50℃，反应时间为1到20小时，反应溶剂选自二氯甲烷、氯仿、甲醇、乙醇，以及其中任意两种或两种以上按照任意比例组成的混合溶剂，催化剂为有机碱。所述有机碱优选正丙胺、三乙胺、吡啶或其中两种或三种的混合物。式Ⅲa或IIIb化合物与式VI化合物的投料摩尔比为1.2:1-1:1.5；

在一个更优选的实施方式中，反应温度为20-40℃，反应时间为3到16小时，反应溶剂为二氯甲烷、氯仿或其混合溶剂，催化剂为有机碱。所述有机碱优选三乙胺、吡啶或其混合物。式Ⅲa或IIIb化合物与式VI化合物的投料摩尔比为1.2:1-1:1.2；

在一个最优选的实施方式中，反应温度为20-30℃，反应时间为6到12小时，反应溶剂为二氯甲烷、氯仿或其混合溶剂，催化剂为有机碱。所述有机碱优选三乙胺。式Ⅲa或IIIb化合物与式VI化合物的投料摩尔比为1:1；

最后，根据需求，将化合物Ⅶ与含ClO₄ ^-、PF₆ ^-、BF₄ ^-或CH₃COO^-的钠盐或钾盐进行负离子置换，得到本发明的式Ⅰ化合物：

反应温度为60-140℃，反应时间为10分钟到2小时，反应溶剂为选自：DMF、DMSO或其混合溶剂，含ClO₄ ^-、PF₆ ^-、BF₄ ^-或CH₃COO^-的钠盐或钾盐与式Ⅶ化合物的投料摩尔比为1:1-10:1。

在一个优选实施方式中，反应温度为70-130℃，反应时间为15分钟到1.5小时，反应溶剂为DMF、DMSO或其混合溶剂。含ClO₄ ^-、PF₆ ^-、BF₄ ^-或CH₃COO^-的钠盐或钾盐与式Ⅶ化合物的摩尔比为1:1-7:1。

在一个更优选的实施方式中，反应温度为80-120℃，反应时间为20分钟到1小时，反应溶剂为DMF，含ClO₄ ^-、PF₆ ^-、BF₄ ^-或CH₃COO^-的钠盐或钾盐与式Ⅶ化合物的投料摩尔比为1:1-4:1。

在一个最优选的实施方式中，反应温度为90-110℃，反应时间为30分钟，反应溶剂为DMF，含ClO₄ ^-、PF₆ ^-、BF₄ ^-或CH₃COO^-的钠盐或钾盐与式Ⅶ化合物的投料摩尔比为1:1-2:1。

由本发明上述方法合成的式I化合物产物，可以采用核磁共振谱图或质谱来确认。

在本发明提供的上述通式Ⅰ化合物中，最主要和最重要的结构特征是：由原料式Ⅴ化合物制备第二季铵盐中间体Ⅵ时所引入的含氮取代基团(CH₂)₄R₃。

本发明还提供上述化合物的缀合物及包含上述化合物或其缀合物的组合物。

本发明还提供一种利用上述化合物、其缀合物或其组合物在生物方面的应用。

本发明的化合物用作荧光染料时具备的有益效果在于：

新化合物分子中引入含氮取代基，使染料与核酸的结合后荧光量子产率增大，提高了检测灵敏度。

新化合物分子引入的含氮取代基是非季胺化（非正电荷化）的，因此具有良好的细胞膜通透性，应用范围增大。

新化合物分子中引入含氮取代基，适当增大了分子极性，减小了对膜脂，蛋白等分子内部疏水区域的结合力，显现出对核酸的特异性结合。

新染料化合物一端引入喹啉杂环，与甲川链相同的对称苯并噻唑和吲哚啉类菁染料相比，相当于增大了共轭程度，其紫外吸收与荧光发射都发生了红移，最大荧光发射在530nm。

新化合物可应用普通的绿色半导体激光器作为光源，大大降低使用成本。

新化合物产品原料易得、结构简单，一般通过2到3步反应即可合成目标分子并且产率相对较高，易实现产业化。

本发明的这些特征和优点以及其他特征和优点在参考以下附图和本发明的具体实施方式之后将变得显而易见。

本发明化合物可以以本文中所述的盐形式直接用于DNA定量检测以及生物染色应用。另外，本发明化合物的衍生物也可以用于DNA定量检测以及生物染色应用，所述衍生物包括但不限于缀合物。

典型地，缀合物在荧光激活细胞分选仪(FACS)中使用。本文中使用的“缀合物”是指本发明荧光染料通过共价键与其它分子连接而形成的化合物。可与本发明荧光染料缀合的分子可为与细胞或细胞成分特异性结合的分子，包括但不限于抗体、抗原、受体、配体、酶、底物、辅酶等。通常，测试样品与荧光缀合物培养一段时间，使得该荧光缀合物与测试样品中的某些细胞或细胞成分特异性结合，该荧光缀合物与细胞或细胞成分的结合也可被称为染色。该染色步骤可依次进行多次，或用多种缀合物同时进行多种染色。染色完成后，样品在荧光激活细胞分选仪中进行分析，其中激发光源激发缀合物中的本发明荧光染料，而测定装置测定由激发的荧光染料产生的发射光。

本发明的组合物除包含式Ⅰ化合物或其缀合物外，还可包含用于生物应用时所需要的其它组分，例如溶剂、渗透压调节剂、pH调节剂、表面活性剂等。这些组分都是本行业内已知的。

本发明的组合物可以以水溶液形式存在，或者可以以临用前用水配制为溶液的其它合适形式存在。

在再一个方面，本发明还提供使用上述式I化合物、或其缀合物、或包含式Ⅰ化合物的组合物用于生物应用的方法，该方法包括使上述式Ⅰ化合物或其缀合物或包含式Ⅰ化合物的组合物与生物样品接触的步骤。本文中使用的术语“接触”可包括在溶液或固相中接触。

为了说明本发明的化合物在结构中引入含氮基团后对染料性能的优化改进，实施例7、8、9、10、11和比较例15中以商品化染料噻唑橙（TO）和溴乙锭(EB)作为参照物，进行对比说明。其中商品化染料噻唑橙（TO）和溴乙锭(EB)结构如下：

实施例1

第一季铵盐中间体1-乙基-4-碘喹啉季铵盐的合成：

将10mmol 4-氯喹啉和20mmol碘乙烷加入到100ml含20ml甲苯的圆底烧瓶中。在氮气保护下，加热回流持续反应10h后停止。混合物冷却至室温后过滤沉淀并用乙酸乙酯洗涤滤饼。干燥后得到黄色的固体粉末，粗收率98%。

实施例2

第二季铵盐中间体1-二乙胺丁基-2-甲基苯并噻唑季铵盐的合成：

将10mmol 2-甲基苯并噻唑和20mmol 1-二乙胺基-4-溴丁烷加入到100ml含20ml甲苯的圆底烧瓶中。在氮气保护下，加热回流持续反应18h后停止。混合物冷却至室温后过滤沉淀并用乙醚洗涤滤饼。干燥后得到白色的固体粉末，粗收率75%。

实施例3

化合物A的制备：

将1mmol的1-乙基-4-碘喹啉季铵盐与1mmol的1-二乙胺丁基-2-甲基苯并噻唑季铵盐加入到100ml含有20ml二氯甲烷的圆底烧瓶中。在氮气保护下，慢慢滴加10mmol三乙胺并与室温下搅拌12h后停止反应。将所得反应液倒入乙醚中析出橙红色固体染料，过滤，干燥。染料通过中性氧化铝层析柱分离，用二氯甲烷和甲醇混合溶剂作为洗脱液，收集橙色组分，收率67%。¹H-NMR(400MHz,DMSO,TMS):δ1.09(t,6H),1.58(t,3H),1.86(m,2H),1.95(m,2H),2.67(m,6H),4.51(t,3H),4.81(tetra,2H),6.73(s,1H),7.46-7.81(m,8H),8.55(d,1H),9.30(d,1H)。MS(TOF LD⁺)C₂₇H₃₄IN₃S m/z:432.3[M-I]⁺。

实施例4

化合物B的制备：

将1mmol的1-苄基-4-氯喹啉季铵盐与1mmol的1-丙胺丁基-2-甲基-5-氯苯并噻唑季铵盐加入到100ml含有20ml二氯甲烷的圆底烧瓶中。在氮气保护下，慢慢滴加10mmol三乙胺并与室温下搅拌10h后停止反应。将所得反应液倒入乙醚中析出橙红色固体染料，过滤，干燥。染料通过中性氧化铝层析柱分离，用二氯甲烷和甲醇混合溶剂作为洗脱液，收集橙色组分，收率55%。MS(TOF LD⁺)C₃₆H₄₁BrClN₃m/z:525.2[M-Br]⁺

实施例5

化合物C的制备：

将1mmol的喹啉季铵盐与1mmol的苯并噁唑季铵盐加入到100ml含有20ml氯仿的圆底烧瓶中。在氮气保护下，慢慢滴加10mmol三乙胺并与室温下搅拌12h后停止反应。将所得反应液倒入乙醚中析出橙红色固体染料，过滤，干燥。染料通过中性氧化铝层析柱分离，用二氯甲烷和甲醇混合溶剂作为洗脱液，收集橙色组分，收率19%。MS(TOF LD⁺)C₂₄H₂₈ClN₃O₂m/z:472.7[M-Cl]⁺

实施例6

化合物D的制备：

将1mmol的喹啉季铵盐与1mmol的苯并硒唑季铵盐加入到100ml含有20ml二氯甲烷的圆底烧瓶中。在氮气保护下，慢慢滴加10mmol三乙胺并与室温下搅拌10h后停止反应。将所得反应液倒入乙醚中析出橙红色固体染料，过滤，干燥。将染料溶于3ml DMF中，加入2mmolNaClO₄后于110℃搅拌反应30min。将所得反应液倒入乙醚中析出橙红色固体染料，过滤，干燥。染料通过中性氧化铝层析柱分离，用二氯甲烷和甲醇混合溶剂作为洗脱液，收集橙色组分，收率11%。MS(TOF LD⁺)C₃₆H₄₃ClN₄O₄Se m/z:606.1[M-ClO₄]⁺。

实施例7

化合物A和商品化染料溴乙锭(EB)与小牛胸腺DNA结合前后荧光发射光谱及相对荧光强度的测定：

配置浓度为1mM的化合物A的DMSO(二甲基亚砜)溶液和溴乙锭(EB)的水溶液，分别取1.5μL，再加pH 7.4、10mM的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐缓冲液稀释至3mL，置于比色皿中，测定其荧光强度。配置一定浓度的小牛胸腺DNA的水溶液，通过紫外吸收分光光度计测定其260nm处的吸光度值，标定其浓度为1.8mM。另分别取浓度为1mM的化合物A的DMSO(二甲基亚砜)溶液和溴乙锭(EB)的水溶液1.5μL于比色皿中，再分别向其中加入浓度为1.8mM的小牛胸腺DNA溶液85μL，最后加pH 7.4、10mM的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐缓冲液稀释至3mL，测定其荧光强度。相同条件下（相同底物浓度和DNA浓度），商品化染料溴乙锭(EB)，与小牛胸腺DNA结合后，相对荧光强度增加19(I/I₀=19.8/1.06=19)倍；而化合物A与小牛胸腺DNA结合后，相对荧光强度可增加304(I/I₀=332.1/1.09=304)倍。所用仪器为紫外可见分光光度计，型号：Hp8453；荧光分光光度计，型号：FP-6500。

实施例8

化合物B随小牛胸腺DNA浓度增大的荧光强度变化图以及最大荧光发射峰强度与小牛胸腺DNA浓度线性关系图的测定：

配置一定浓度的小牛胸腺DNA的水溶液，通过紫外吸收分光光度计测定其260nm处的吸光度值，标定其浓度为1.8mM。取100μL已标定为1.8mM的小牛胸腺DNA，加入290μL水后的稀释为0.5mM的小牛胸腺DNA水溶液。配置浓度为1mM的化合物B的DMSO (二甲基亚砜)溶液，取1.5μL，再加pH 7.4、10mM的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐缓冲液稀释至3mL，置于比色皿中，测定其荧光强度。随后，每次取0.6μL 0.5mM的小牛胸腺DNA水溶液于比色皿中，并将缓冲液搅拌均匀后，放置37°C环境中静置3min后，测定其荧光强度。最终，比色皿中小牛胸腺DNA的浓度为1μM。取每个小牛胸腺DNA浓度的最大荧光发射峰处（530nm）强度，作荧光强度与小牛胸腺DNA浓度的线性关系图（R=0.998）。所用仪器为紫外可见分光光度计，型号：Hp8453；荧光分光光度计，型号：FP-6500。

实施例9

化合物A和商品化染料噻唑橙（TO）与小牛胸腺DNA结合前后荧光量子产率的测定：

取一定量的浓度为1mM的化合物A和商品化染料噻唑橙（TO）溶液，加入到pH 7.4、10mM的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐的缓冲溶液中，使其满足经紫外可见分光光度计测定最大吸收值处于0.06~0.08之间。分别选定激发波长测定荧光强度。平行测定三次，算出荧光量子产率，取其平均值。以荧光素作为标准物(Φ_F=0.95,0.1M NaOH水溶液,15℃)计算，在缓冲溶液中，噻唑橙（TO）和化合物A的荧光量子产率都小于0.01，具有良好的低荧光背景。与相同浓度的小牛胸腺DNA(150μM)结合后，化合物A的荧光量子产率Φ_F=0.33；噻唑橙（TO）的荧光量子产率Φ_F=0.23；

实施例10

化合物A和商品化染料噻唑橙（TO）分别与小牛胸腺DNA和牛血清白蛋白(BSA)结合前后荧光强度的测定：

分别取3μL浓度为1mM化合物A和商品化染料噻唑橙（TO）的DMSO溶液，加pH 7.4、10mM的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐缓冲液稀释至3mL，置于比色皿中，测定其荧光强度。分别取3μL浓度为1mM的化合物A和商品化染料噻唑橙（TO）的DMSO溶液置于两个比色皿中，再分别加入浓度为30mg/mL的BSA溶液4μL，加pH 7.4、10mM的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐缓冲液稀释至3mL，测定其荧光强度。另分别取3μL浓度为1mM的化合物A和商品化染料噻唑橙（TO）的DMSO溶液置于两个比色皿中，再分别向其中加入浓度为600μg/mL的小牛胸腺DNA溶液200μL，最后加pH 7.4、10mM的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐缓冲液稀释至3mL，测定其荧光强度。相同条件下（相同底物浓度、BSA浓度和DNA浓度），已知商品化染料噻唑橙（TO）与小牛胸腺DNA结合后相对荧光强度增加173倍；与牛血清白蛋白(BSA)结合后相对荧光强度增加5.7倍。而化合物A与小牛胸腺DNA结合后相对荧光强度可增加304倍；与牛血清白蛋白(BSA)结合后相对荧光强度增加1.7倍。可以看出化合物A对DNA有良好的特异性结合。所用仪器为紫外可见分光光度计，型号：Hp8453；荧光分光光度计，型号：FP-6500。

实施例11

共聚焦激光扫描显微镜下观察化合物A对HeLa活细胞的染色：

加配有化合物A、浓度为1mM的PBS缓冲液10μL于培养好HeLa细胞的六孔板中，在37°C、5%CO₂的细胞培养箱中孵育30min。然后，PBS震荡清洗3次，再加入细胞培养基，共聚焦激光扫描显微镜观察细胞形态。选取代表性区域，488nm通道激发，用油镜(100×)观察，重复三次。图5A为化合物A对HeLa活细胞染色的白场显微照片，5B是化合物A对HeLa活细胞染色的荧光显微照片。如图可观察到化合物A对HeLa细胞核清晰染色。所用仪器为共聚焦激光扫描显微镜，型号：FV1000IX81，Japan。激发光通道：488nm。

实施例12

共聚焦激光扫描显微镜下观察化合物B对MCF-7活细胞的染色：

加配有化合物B、浓度为1mM的PBS缓冲液10μL于培养好MCF-7细胞的六孔板中，在37°C、5%CO₂的细胞培养箱中孵育30min。然后，PBS缓冲液震荡清洗3次，再加入细胞培养基，共聚焦激光扫描显微镜观察细胞形态。选取代表性区域，488nm通道激发，用油镜(100×)观察，重复三次。图6A为化合物B对MCF-7活细胞染色的白场显微照片，6B是化合物B对MCF-7活细胞染色的荧光显微照片。如图可观察到化合物B对MCF-7细胞核清晰染色。所用仪器为共聚焦激光扫描显微镜，型号：FV1000IX81，Japan。激发光通道：488nm。

实施例13

共聚焦激光扫描显微镜下观察化合物C对HeLa活细胞的染色：

加配有化合物C、浓度为1mM的PBS缓冲液10μL于培养好HeLa细胞的六孔板中，在37°C、5%CO₂的细胞培养箱中孵育30min。然后，PBS震荡清洗3次，再加入细胞培养基，共聚焦激光扫描显微镜观察细胞形态。选取代表性区域，488nm通道激发，用油镜(100×)观察，重复三次。图7A为化合物C对HeLa活细胞染色的白场显微照片，7B是化合物C对HeLa活细胞染色的荧光显微照片。如图可观察到化合物C对HeLa细胞核清晰染色。所用仪器为共聚焦激光扫描显微镜，型号：FV1000IX81，Japan。激发光通道：488nm。

实施例14

共聚焦激光扫描显微镜下观察化合物D对MCF-7活细胞的染色：

加配有化合物D、浓度为1mM的PBS缓冲液10μL于培养好MCF-7细胞的六孔板中，在37°C、5%CO₂的细胞培养箱中孵育60min。然后，PBS震荡清洗3次，再加入细胞培养基，共聚焦激光扫描显微镜观察细胞形态。选取代表性区域，488nm通道激发，用油镜(100×)观察，重复三次。图8A为化合物D对MCF-7活细胞染色的白场显微照片，8B是化合物D对MCF-7活细胞染色的荧光显微照片。如图可观察到化合物D对MCF-7细胞核清晰染色。所用仪器为共聚焦激光扫描显微镜，型号：FV1000IX81，Japan。激发光通道：488nm。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。作为荧光染料是本发明新化合物的一种用途，不能认定本发明的化合物仅用于荧光染料，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在基于本发明化合物用作荧光染料的相同作用机理的考虑下，还可以做出若干简单推理，得出本发明的化合物的其他应用用途，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一类绿光菁类荧光染料，具有如下结构通式Ⅰ：

通式Ⅰ中

X为C(CH₃)₂、O、S或Se；

R₁和R₂各自独立地选自H、C_1-18烷基、OR₆或卤素；

R₃为N(R₅)(R₇)；

R₄选自C_1-18烷基、苄基和取代苄基，所述的取代苄基由以下基团任意取代：C_1-18烷基、CN、COOH、NH₂、NO₂、OH、SH、C_1-6烷氧基、C_1-6烷基氨基、C_1-6酰氨基、卤素或C_1-6卤代烷基；

R₅和R₇各自独立地选自H或C_1-18烷基，并且R₅和R₇不同时为H；

R₆为H或C_1-18烷基；

Y^-为负离子。

2.权利要求1所述的荧光染料，其特征在于所述的R₁为H或Cl，R₂为H或甲氧基。

3.权利要求1所述的荧光染料，其特征在于所述的R₄选自C_1-18烷基、苄基和取代苄基，取代苄基由以下基团任意取代：COOH、NH₂、OH、C_1-6烷氧基或卤素。

4.权利要求3所述的荧光染料，其特征在于所述的R₄选自C_1-6烷基、苄基和卤素取代苄基。

5.权利要求1所述的荧光染料，其特征在于所述的R₅和R₇各自独立地选自H或C_1-6烷基。

6.权利要求1所述的荧光染料，其特征在于所述的Y^-为卤素离子、ClO₄ ^-、PF₆ ^-、BF₄ ^-、CH₃COO^-或OTs^-。

7.权利要求1所述的绿光菁类荧光染料的制备方法，包括以下步骤：

1)式IIa或IIb的化合物分别与R₄Z反应，分别制备第一季铵盐中间体IIIa或IIIb，其中Z为卤素或OTs,Z^-为反应生成的卤素负离子或OTs^-，R₈为卤素：

反应温度为10-180℃，反应时间为4-48小时，反应溶剂选自二氯甲烷、氯仿、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、甲苯、二甲苯、邻二氯苯、以及其中任意两种或两种以上按照任意比例组成的混合溶剂，式IIa或IIb的化合物与R₄Z的投料摩尔比为1:1-1:10；

2）使式V的化合物与化合物R₃(CH₂)₄Z反应制得第二季铵盐中间体VI，其中Z为卤素或OTs,Z^-为反应生成的卤素负离子或OTs^-：

反应温度为10-180℃，反应时间为4-48小时，反应溶剂选自二氯甲烷、氯仿、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、甲苯、二甲苯、邻二氯苯、以及其中任意两种或两种以上按照任意比例组成的混合溶剂，式Ⅴ的化合物与化合物R₃(CH₂)₄Z的投料摩尔比为1:1-1:10；

3）将步骤（1）中得到的第一季铵盐中间体IIIa或IIIb与步骤（2）中得到的第二季铵盐中间体Ⅵ反应，得到式VII的化合物：

反应温度为5-50℃，反应时间为30分钟到24小时，反应溶剂选自二氯甲烷、氯仿、甲醇、乙醇、乙二醇单甲醚、以及其中任意两种或两种以上按照任意比例组成的混合溶剂，催化剂为有机碱，式IIIa或IIIb的化合物与式VI的化合物的投料摩尔比为1.5:1-1:1.5；

4）将步骤3）中得到的式VII的化合物与含Y^-的钠盐或钾盐进行负离子置换，得到式Ⅰ的化合物：

反应温度为60-140℃，反应时间为10分钟到2小时，反应溶剂为DMF、DMSO或其混合溶剂，含Y^-的钠盐或钾盐与式VII的化合物的投料摩尔比为1:1-10:1。

8.权利要求1所述的绿光菁类荧光染料在生物样品染色中的应用。

9.一种生物样品的染色方法，包括将权利要求1-5中任意一项权利要求所述的化合物与生物样品接触的步骤。

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