CN103087545A - 一类以荧光素为母体的荧光染料、其制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

一类以荧光素为母体的荧光染料、其制备方法及应用，所述的以荧光素为母体的荧光染料，具有通式I（图1）的结构。这类化合物具有一定水平的水溶性，同时具有一定良好的细胞膜通透性。本发明的这类化合物同时还具有比较新颖的光谱特性，并将这类良好性质的荧光素衍生物的染料应用于荧光成像方面。

Description

一类以荧光素为母体的荧光染料、其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及一类以荧光素为母体的具有特殊性质的新型长波长荧光染料的制备方法及应用，以及利用该类荧光探针化合物在体外和体内检测牛血清蛋白，并将染料应用到细胞成像实验中。

背景技术

荧光染料作为功能性色素在科学技术的各个领域得到广泛应用，尤其在生命科学、临床医疗诊断、免疫分析检测等方面的研究在全世界备受瞩目。在众多的荧光染料中荧光素是一类被广泛应用的染料，这类染料具有大的摩尔消光系数、好的光稳定性、高的荧光量子产率等优点。

1871年荧光素首次被合成出来，然后成为一个重要的类型的荧光团，由于其优良的量子产率和耐光性，荧光素现在已经被广泛地应用于荧光生物探针。人们发现2',7'位置被氟或氯取代后的荧光素衍生物比起原来没有衍生化的母体来说，这类衍生物能更适合生物应用中，因为他们具有更低的pKa值和更好的耐光性能。这些衍生品以他们的发明家名字分别命名为Oregon Green，Tokyo Green，Pennsylvania Green和Pittsburgh Green。但直到现在，很少有“红色”的荧光素衍生物被研发出来，众所周知的是在红色发射光的区域的染料具有更高的应用价值，因为发射在600nm以上的染料具有更少的干涉散射光线和自体荧光的生物分子的干扰。

许多研究小组已经开发出基于2'，7'二氯荧光素荧光探针比如用荧光素作为检测锌离子、银离子、铜离子、汞离子、钯离子、臭氧、RNA和酶等等。但是，直到现在，大多数这些荧光化合物基于2'，7'二氯荧光素的苯环或3'，6'的位置构建派生出来的,而这些衍生物的光谱不能扩展到长波长区域。最近，Koide组找到一种通过在4'的位置引入一个烯丙基基团从而实现的光谱扩展的方法。据报道两个荧光素衍生物Pittsburgh Green和Pittsburgh Yellow-green发射峰值在水中分别为523nm，535nm。但这些已经被报道的结果表明要想有效地来实现荧光素延长吸收和发射波长到“红色”区域的方法是可以通过在4'，5'的位置衍生化。已经报道的文献中主要采用的是在4'，5'的位置通过曼尼希反应衍生化，但这种方法不是一种有效的延长吸收和发射光谱的有效方法，因此，为了获得“红色”的荧光素，需要提出新出合成方法来修饰荧光素，让其波长延长至“红色”区域。

发明内容

本发明首先提供一类以荧光素为母体的荧光染料，具有通式I的结构（图1）：

其中：

M选自H，K⁺，Na⁺，-R₇，-OR₇和-(CH₂)_n-O-R₇；R₇为C_1-18烷基，n为1-18的整数；

_R0和R₀’各自独立地选自H、F、Cl、Br和I；

R和R’各自独立地选自H、R₁、R₂、R₃、R₄、R₅和R₆；

X为C(CH₃)₂、O、S或Se；

Y^-为负离子。

本发明的上述荧光染料具有以下优点：光稳定性好，发射波长在近“红色”区域的基于荧光素母体的一类新型荧光染料，同时这些染料在生物应用方面具有一定的细胞膜通透性，长波长的特点使得光谱范围与生物样品的光谱范围有较大差异。具有上述特性的还包括上述荧光染料的缀合物及含有其的组合物，该荧光染料、其缀合物、组合物均可用于生物样品染色。

本发明另一方面目的在于提供所述的荧光染料的缀合物。

再一目的则在于提供一种用于生物样品染色的组合物，包含上述荧光染料或其缀合物。

另一方面，本发明提上述本发明的荧光染料的制备方法，包括如下步骤：

1)式II的化合物与乌洛托品化合物按照投料摩尔比1:1-1:20，在10-180℃条件下反应4-48小时，制备式III的化合物；

反应溶剂为三氟乙酸、二氯甲烷、氯仿、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、甲苯、二甲苯、邻-二氯苯或其混合物；

2)式III的化合物与式i、ii、iii、iv或v的化合物按投料摩尔比1:3-1:5在85-90℃条件下反应1-24h，制备式I的化合物；

反应溶剂为三氟乙酸、二氯甲烷、氯仿、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、甲苯、二甲苯、邻-二氯苯或其混合物。

本发明改进现有的荧光素光谱上的不足，设计并合成出长波长的荧光染料。该类长波长荧光染料具有光稳定性好的特点，这类化合物具有一定水平的水溶性，同时具有一定的细胞膜通透性。

附图说明

本发明附图7幅：

图1是本发明的以荧光素为母体的荧光探针的结构通式I。

图2是实施例2中表征本发明的荧光探针化合物A₁，以浓度为1mM的A₁-DMSO溶液3μL加入到的3mLpH值为7.40的PBS缓冲液中，然后在25℃下逐渐加入牛血清蛋白（BSA）加入测试体系中测试其荧光光谱变化。图2a为加入探针A₁后再加入BSA的荧光光谱变化图，横坐标为波长(nm)，纵坐标为相对荧光强度。荧光分光光度计，型号：FP-6500。

图3是实施例3合成的化合物A₂实施例2中表征本发明的荧光探针化合物A₁，以浓度为1mM的A₁-DMSO溶液3μL加入到的3mLpH值为7.40的PBS缓冲液中，然后在25℃下逐渐加入牛血清蛋白（BSA）加入测试体系中测试其荧光光谱变化。图3a为加入探针A₁后再加入BSA的荧光光谱变化图，横坐标为波长(nm)，纵坐标为相对荧光强度。荧光分光光度计，型号：FP-6500。

图4a为化合物A₁对活细胞MCF-7(人乳癌细胞)染色的白场显微照片，4b是化合物A₁对活细胞MCF-7染色的荧光显微照片,图片收集绿色波段500-540nm，4c是化合物A₁对活细胞MCF-7染色的荧光显微照片,图片收集绿色波段600-640nm，4d是化合物A₁对活细胞MCF-7染色的绿色荧光和红色荧光的叠加显微照片,所用仪器为共聚焦激光扫描显微镜，型号：Olympus。激发光通道：488nm。

图5a为化合物A₁对活细胞MCF-7(人乳癌细胞)染色的白场显微照片，5b是化合物A₂对活细胞MCF-7染色的荧光显微照片,图片收集绿色波段500-540nm，5c是化合物A₂对活细胞MCF-7染色的荧光显微照片,图片收集绿色波段600-640nm，5d是化合物A₂对活细胞MCF-7染色的绿色荧光和红色荧光的叠加显微照片,所用仪器为共聚焦激光扫描显微镜，型号：Olympus。激发光通道：488nm。

图6a为化合物A₁和另外在孵育体系中加入一定量的BSA对活细胞MCF-7(人乳癌细胞)染色的白场显微照片，6b是化合物A₁对活细胞MCF-7染色的荧光显微照片,图片收集绿色波段500-540nm，6c是化合物A₁对活细胞MCF-7染色的荧光显微照片,图片收集绿色波段600-640nm，6d是化合物A₁对活细胞MCF-7染色的绿色荧光和红色荧光的叠加显微照片,所用仪器为共聚焦激光扫描显微镜，型号：Olympus。激发光通道：488nm。

图7a为化合物A₂和另外在孵育体系中加入一定量的BSA对对活细胞MCF-7(人乳癌细胞)染色的白场显微照片，7b是化合物A₁对活细胞MCF-7染色的荧光显微照片,图片收集绿色波段500-540nm，7c是化合物A₁对活细胞MCF-7染色的荧光显微照片,图片收集绿色波段600-640nm，7d是化合物A₁对活细胞MCF-7染色的绿色荧光和红色荧光的叠加显微照片,所用仪器为共聚焦激光扫描显微镜，型号：Olympus。激发光通道：488nm。

具体实施方式

除另有说明外，本文中使用的术语具有以下含义。

本文中使用的术语“烷基”包括直链烷基和支链烷基，例如，“C_1-6烷基”包括C_1-4烷基、C_1-3烷基、甲基、乙基、正丙基、异丙基和叔丁基。类似的规则也适用于本说明书中使用的其它基团。

本文中使用的术语“卤素”包括氟、氯、溴和碘。

本文中使用Y^-表示负离子，其可为任何合适的负离子，包括但不限于无机负离子或有机负离子，例如卤素离子、ClO₄ ^-、PF₆ ^-、BF₄ ^-、CH₃COO^-或OTs^-。

本发明的一类以荧光素为母体的荧光染料，具有通式I的结构：

I在本发明的通式I化合物中，优选X为C(CH₃)₂、O或S；更优选X为C(CH₃)₂或S；最优选X为S。

本发明的式I的化合物中，R₀，R₀’各自独立地选自H或卤素；优选R₀，R₀’各自独立地选自H或F、Cl、Br；更优选R₀，R₀’各自独立地选自H或F、Cl；再优选R₀，R₀’选自H或Cl；最优选R₀与R₀’相同，为H或Cl。

M选自H，K⁺，Na⁺，-R₇，-OR₇和-(CH₂)_n-O-R₇；优选M选自H、-R₇，-OR₇和-(CH₂)_n-O-R₇；再更优选M选自H或C_1-18烷基；最优选M为H。其中所述的R₇为C_1-18烷基；优选R₇为C_1-6烷基；所述的n为整数，优选n为1-18的整数。

优选Y^-为卤素离子、ClO₄ ^-、PF₆ ^-、BF₄ ^-、CH₃COO^-或OTs^-；再更优选Y^-选自卤素离子、ClO₄ ^-、PF₆ ^-、BF₄ ^-、CH₃COO^-；再更优选Y^-选自卤素离子、ClO₄ ^-；最优选Y^-选自卤素溴离子。

本发明另一方面提供所述以荧光素为母体荧光染料的制备方法，所述方法包括如下步骤：分别制备中间体二元醛，然后将中间体中与化合物i、ii、iii、vi、v在有机碱（例如哌啶）的作用下反应得到所述化合物，具体合成方案包括如下步骤：

1)式Ⅱ的化合物与乌洛托品化合物按照投料摩尔比1:1-1:20，在10-180℃条件下反应4-48小时，制备式III的化合物；

反应溶剂为三氟乙酸、二氯甲烷、氯仿、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、甲苯、二甲苯、邻-二氯苯或其混合物；

在一个优选的实施方式中，反应温度为70-140℃，反应时间为2-36小时，反应溶剂选自三氟乙酸、二氯甲烷、氯仿、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、甲苯、二甲苯、邻-二氯苯或其混合物，式II的化合物与乌洛托品的反应摩尔比为1:1-1:15；

在一个更优选的实施方式中，反应温度为80-120℃，反应时间为3-24小时，反应溶剂选自三氟乙酸、乙酸乙酯、醋酸或其混合物，式II的化合物与乌洛托品的反应摩尔比为1:2-1:10；

在最优选的实施方式中，反应温度为90-100℃，反应时间为4-12小时，反应溶剂选自三氟乙酸，式II的化合物与乌洛托品的反应摩尔比为1:3-1:10；

2)式III的化合物与式i、ii、iii、iv或v的化合物按投料摩尔比1:3-1:5在85-90℃条件下反应1-24h，制备式I的化合物；

反应溶剂为三氟乙酸、二氯甲烷、氯仿、乙醇、甲醇、乙腈、乙酸乙酯、甲苯、二甲苯、邻-二氯苯或其混合物。

在一个优选的实施方式中，反应温度为50-180℃，反应时间为4-48小时，反应溶剂为选自：二氯甲烷、氯仿、乙醇、甲醇、乙腈、乙酸乙酯、甲苯、二甲苯、邻-二氯苯，氢氧化钠水溶液或它们的混合物，式Ⅱ化合物与乌洛托品化合物的投料摩尔比为1:1-1:30；

在一个更优选的实施方式中，反应温度为60-160℃，反应时间为2-36小时，反应溶剂选自乙醇、甲醇、乙腈、乙酸乙酯、甲苯、二甲苯、邻-二氯苯，氧化钠水溶液或它们的混合物，II与i、ii、iii、iv或v的化合物摩尔比为1:1-1:25；

进一步优选的实施方式中，反应温度为70-140℃，反应时间为3-24小时，反应溶剂选自乙醇、甲醇、乙腈、乙酸乙酯，氢氧化钠水溶液或其混合物，II与i、ii、iii、iv或v的化合物反应摩尔比为1:2-1:20；

最优选的实施方式中，反应温度为80-120℃，反应时间为4-12小时，反应溶剂选自甲醇，乙醇，氢氧化钠水溶液，II与i、ii、iii、iv或v的化合物的反应摩尔比为1:3-1:17；

对上述步骤2）的反应，更为具体地描述是：

a.将步骤1)中得到的二元醛中间体（式III的化合物）与式i的化合物缩合反应得到式IV：

b.将步骤1)中得到的二元醛中间体（式III的化合物）与式ii的化合物缩合反应得到式V的化合物：

c.将步骤1)中得到的二元醛中间体（式III的化合物）与式iii的化合物缩合反应得到式VI的化合物：

d.将步骤1)中得到的二元醛中间体（式III的化合物）与式iv的化合物缩合反应得到式VII的化合物：

e.将步骤1)中得到的二元醛中间体（式III的化合物）与式v的化合物缩合反应得到式VIII的化合物：

上述对本发明的以各种取代基的荧光素为母体的荧光探针制备方法的描述中，各个取代基（R₁、R₂、R₃、R₄和R₅）的定义及优选，均与本发明中对化合物的描述中的定义及优选相同。

对本发明采用上述方法合成的新型荧光素荧光探针化合物，采用核磁共振谱图或质谱来确认其结构，并且辅以碳谱、高分辨质谱测试来辅助确认其结构。

本发明所述的以荧光素为母体的荧光探针具备以下特点：

所述化合物部分分子的荧光发射波长是双发射，分别在525nm处和大于600nm处有发射峰，可用于比率荧光探针和细胞成像，避免生物自身的荧光背景干扰，同时比例型探针用于细胞成像能避免外在的环境因素对荧光强度的干扰；

所述化合物具有优异的光稳定性，应用于生物样品成像时具有低的生物光漂白性；

所述化合物在4’,5’位置引入不同取代基，提高了对牛血清蛋白的专一性、特异性识别；

所述新化合物产品毒副性小，原料易得，结构简单，易于制备，易产业化，通过2步反应即可。

本发明的这些特征和优点以及其他特征和优点在参考以下附图和本发明的具体实施方式之后将变得显而易见。

鉴于此，本发明所述的荧光素衍生物的荧光探针化合物可用于牛血清蛋白检测。所述组合物中应当包含有效量的本发明所提供的荧光素衍生物荧光探针化合物之一。另外，还可以包含生物样品染色所需要的其它组分，例如溶剂、pH调节剂等。这些组分都是本行业内已知的。上述组合物可以以水溶液形式存在，或者可以以临用前用水配制为溶液的其它合适形式存在。

本发明化合物可以用于生物样品的染色，所述化合物为荧光缀合物。典型地，缀合物在荧光激活细胞分选仪(FACS)中使用。本文中使用的“缀合物”是指本发明荧光素母体的染料通过双键与其它分子连接而形成的化合物。可与本发明荧光染料缀合的分子可为与细胞或细胞成分特异性结合的分子，包括但不限于抗体、抗原、受体、配体、酶、底物、辅酶等。通常，测试样品与荧光缀合物恒温孵育一段时间，使得该荧光缀合物与测试样品中的某些细胞或细胞成分特异性结合，该荧光缀合物与细胞或细胞成分的结合也可被称为染色。该染色步骤可依次进行多次，或用多种缀合物同时进行多种染色。染色完成后，样品在荧光激活细胞分选仪中进行分析，其中激发光源激发缀合物中的本发明荧光染料，而测定装置测定由激发的荧光染料产生的发射光。

本发明还提供使用上述本发明的荧光素衍生物的荧光探针化合物标记细胞样品的方法，该方法包括使所述化合物与生物样品接触的步骤。本文中使用的术语“接触”可包括在溶液中接触。

本发明的组合物可以以水溶液形式存在，或者可以以临用前用水配制为溶液的其它合适形式存在。

实施例1

制备探针化合物A₁

（1）中间体1的合成

将DCF(6.30g、15.75mmol,合成根据文献),乌洛托品(10.5g、75.1mmol)溶解在含有25毫升三氟乙酸的圆底烧瓶中。搅拌这种混合物，加热到90℃，继续搅拌24h。混合物变成粘稠状，用乙酸水溶液(10mL醋酸溶于200毫升水中)处理。然后混合物在常温搅拌过夜。固体沉淀，然后用布氏漏斗过滤，用水洗涤沉淀3次。抽干后在红外线灯下烘干，得到红色的固体(8.10g)。

（2）探针化合物A₁的合成

在氮气氛围下，将2.5mmol的哌啶(0.215g)加入溶解有DCF二元醛(0.32g，0.67mmol)和2-甲基苯并噻唑(339μL,2.66mmol)的无水乙醇(50mL)中，这种混合物在氮气条件下回流下24h。反应混合体系降温到室温。然后是在真空条件下蒸掉溶剂，剩下5mLEtOH在圆底烧瓶中，将剩余的少量乙醇溶液滴加到乙醚(200毫升)中。沉淀的固体用布氏漏斗过滤，初产品是用乙醚(50mL×3)洗涤。通过柱色谱法纯化后在硅胶(甲醇/二氯乙烷=1/10)，得得到黑红色固体(0.07g，0.097mmol，17.94%收率)，Rf＝0.30，(20%CH₃OH在二氯甲烷)。¹H NMR(400MHz,DMSO)δ8.43(1H,d,J 15.7),8.22(1H,d,J 7.7),8.14–7.99(2H,m),7.85(2H,d,J 17.3),7.84–7.68(4H,m),7.36(4H,dt,J 19.4,7.9),7.30–7.19(2H,m),6.89(1H,s),6.82(1H,s).¹³C NMR(100MHz,DMSO)δ172.49,168.75,153.85,153.27,133.50,128.61,127.90,126.76,125.65,124.23,122.48,121.53,120.92,110.08,109.36,64.60,40.38,38.92,38.71,30.98,29.70,28.67,20.10,18.28,12.96,12.57.MS(ESI+Tof)m/z Found 717.0094M-1,calculated 718.0191 forC₃₈H₂₀Cl₂N₂O₅S₂.

实施例2

制备探针化合物A₂：

（1）中间体1的合成

将DCF(6.30g、15.75mmol,合成根据文献),乌洛托品(10.5g、75.1mmol)溶解在含有25毫升三氟乙酸的圆底烧瓶中。搅拌这种混合物，加热到90℃，继续搅拌24h。混合物变成粘稠状，用乙酸水溶液(10mL醋酸溶于200毫升水中)处理。然后混合物在常温搅拌过夜。固体沉淀，然后用布氏漏斗过滤，用水洗涤沉淀3次。抽干后在红外线灯下烘干，得到红色的固体(8.10g)。

（2）探针化合物A₂的合成

在氮气氛围下，将2.5mmol的哌啶(0.215g)加入溶解有DCF二元醛(0.828g，1.82mmol)和2,6-二甲基-4-吡喃亚基丙二腈(0.828g，1.82mmol)的无水乙醇(65mL)中，这种混合物在氮气条件下回流下24h。反应混合体系降温到室温。然后是在真空条件下蒸掉溶剂，剩下5mLEtOH在圆底烧瓶中，将剩余的少量乙醇溶液滴加到乙醚(200毫升)中。沉淀的固体用布氏漏斗过滤，初产品是用乙醚(50mL×3)洗涤。通过柱色谱法纯化后在硅胶(甲醇/二氯乙烷=1/100-1/15)，得得到黑红色固体(0.065g，0.085mmol，6.1%收率)，Rf＝0.38，(20%CH₃OH在二氯甲烷)。¹HNMR(400MHz,DMSO)δ8.19(d,J=2.1Hz,1H),8.04(d,J=16.1Hz,2H),7.71(d,J=15.9Hz,2H),7.65(s,2H),7.29(d,J=2.9Hz,1H),6.82(s,2H),6.62(s,2H),6.46(s,2H),2.36(s,6H).¹³CNMR(100MHz,DMSO)δ172.72,164.09,162.41,156.52,154.91,131.05,129.69,128.71,127.88,117.99,115.85,115.68,110.49,109.54,105.97,104.98,54.98,19.76.MS(ESI+Tof)m/z Found763.0883M-1,calculated 764.0866 for C₄₂H₂₂Cl₂N₄O₇.

实施例3

制备探针化合物A₃

（1）中间体1的合成

将DCF(6.30g、15.75mmol,合成根据文献),乌洛托品(10.5g、75.1mmol)溶解在含有25毫升三氟乙酸的圆底烧瓶中。搅拌这种混合物，加热到90℃，继续搅拌24h。混合物变成粘稠状，用乙酸水溶液(10mL醋酸溶于200毫升水中)处理。然后混合物在常温搅拌过夜。固体沉淀，然后用布氏漏斗过滤，用水洗涤沉淀3次。抽干后在红外线灯下烘干，得到红色的固体(8.10g)。

（2）探针化合物A₃的合成

在氮气氛围下，将2.5mmol的哌啶(0.215g)加入溶解有DCF二元醛(0.321g，0.666mmol)和3-甲基-2甲基苯并噻唑季铵盐(0.339g，2.664mmol)的无水乙醇(50mL)中，这种混合物在氮气85℃条件下回流下1h。反应混合体系降温到室温。然后是在真空条件下蒸掉溶剂，剩下5mLEtOH在圆底烧瓶中，将剩余的少量乙醇溶液滴加到乙醚(200毫升)中。沉淀的固体用布氏漏斗过滤，初产品是用乙醚(50mL×3)洗涤。通过柱色谱法纯化后在硅胶(甲醇/二氯乙烷=1/100-1/5)，得得到红色固体(0.07g，0.097mmol，14.60%收率)，Rf＝0.25，(20%CH₃OH在二氯甲烷)。¹H NMR(400MHz,DMSO)δ8.97(d,J=14.8Hz,2H),8.52(d,J=14.8Hz,2H),8.26(d,J=7.8Hz,1H),8.19(d,J=8.5Hz,2H),7.91(t,J=7.5Hz,2H),7.82(dd,J=15.9,7.8Hz,4H),7.67(d,J=8.1Hz,2H),7.49(d,J=7.5Hz,1H),6.97(s,2H),4.24(s,6H).¹³C NMR(100MHz,DMSO)δ173.55,173.39,166.81,155.85,142.69,139.44,133.39,131.53,130.93,130.50,129.63,127.88,127.72,124.18,116.72,111.97,110.26,48.78,36.05,24.81.MS(ESI+Tof)m/z Found747.0600M+1,calculated 746.064 for C₄₀H₂₅Cl₂N₂O₅S₂。

实施例4

制备探针化合物A₄

（1）中间体1的合成

将DCF(6.30g、15.75mmol,合成根据文献),乌洛托品(10.5g、75.1mmol)溶解在含有25毫升三氟乙酸的圆底烧瓶中。搅拌这种混合物，加热到90℃，继续搅拌24h。混合物变成粘稠状，用乙酸水溶液(10mL醋酸溶于200毫升水中)处理。然后混合物在常温搅拌过夜。固体沉淀，然后用布氏漏斗过滤，用水洗涤沉淀3次。抽干后在红外线灯下烘干，得到红色的固体(8.10g)。

（2）探针化合物A₃的合成

在氮气氛围下，将2.5mmol的哌啶(0.215g)加入溶解有DCF二元醛(0.456g，0.001mmol)和过量的苯乙酮(0.339g，2.664mmol)的无水乙醇(50mL)中，0.5g氢氧化钠是溶解在5mL水中，然后将氢氧化钠水溶液一滴一滴地加到反应混合物中，在氮气室温条件下搅拌24h。反应混合体系降温到室温。然后是在真空条件下蒸掉溶剂，剩下5mLEtOH在圆底烧瓶中，将剩余的少量乙醇溶液滴加到乙醚(200毫升)中。沉淀的固体用布氏漏斗过滤，初产品是用乙醚(50mL×3)洗涤。通过柱色谱法纯化后在硅胶(甲醇/二氯乙烷=1/100-1/5)，得得到红色固体(0.07g，0.097mmol，14.60%收率)，R_f＝0.25，(20%CH₃OH在二氯甲烷)。¹H NMR(400MHz,DMSO)δ8.88(d,J=12.6Hz,2H),8.53(d,J=10.2Hz,2H),8.27(d,J=5.5Hz,1H),7.99(d,J=2.2Hz,4H),7.87–7.68(m,2H),7.60–7.46(m,6H),6.90(s,2H),4.28(s,1H).¹³C NMR(101MHz,DMSO)δ190.54,173.75,156.49,139.76,135.67,134.83,132.73,131.57,130.80,130.27,129.76,129.11,128.75,127.45,122.06,111.07,109.62,56.81,18.95,0.24.MS(ESI+Tof)m/z Found659.2010M-1,calculated 660.070 for C₃₈H₂₂Cl₂O₇.

实施例5

探针化合物A₁对牛血清蛋白的特异性检测实验

化合物A₁与牛血清蛋白结合荧光发射光谱的测定：配置浓度为1mM的化合物A₁的DMSO(二甲基亚砜)溶液，取3μL，再加pH7.36、20mM的磷酸盐缓冲液稀释至3mL，置于比色皿中，测定其荧光强度。配置一定浓度的牛血清蛋白的水溶液，标定其浓度为10mg/mL。另分别取浓度为1mM的化合物A₁的DMSO(二甲基亚砜)溶液3μL于比色皿中，再分别向其中加入浓度为10mg/mL的牛血清蛋白溶液，最后加pH7.36、20mM的磷酸盐缓冲液稀释至3mL，测定其不同浓度下的荧光强度。相对荧光强度以线性关系比率增加，图2a为加入探针A₁后再加入牛血清蛋白的荧光光谱变化图，图2b为牛血清蛋白浓度和A₁荧光强度之间的线性关系图，所用仪器为紫外可见分光光度计，型号：Hp8453；荧光分光光度计，型号：FP-6500。

实施例6

探针化合物A₂对牛血清蛋白的特异性检测实验

化合物A₂与牛血清蛋白结合荧光发射光谱的测定：配置浓度为1mM的化合物A₂的DMSO(二甲基亚砜)溶液，取3μL，再加pH7.36、20mM的磷酸盐缓冲液稀释至3mL，置于比色皿中，测定其荧光强度。配置一定浓度的牛血清蛋白的水溶液，标定其浓度为10mg/mL。另分别取浓度为1mM的化合物A₂的DMSO(二甲基亚砜)溶液3μL于比色皿中，再分别向其中加入浓度为10mg/mL的牛血清蛋白溶液，最后加pH7.36、20mM的磷酸盐缓冲液稀释至3mL，测定其不同浓度下的荧光强度。相对荧光强度以线性关系比率增加，图3a为加入探针A₁后再加入牛血清蛋白的荧光光谱变化图，图3b为牛血清蛋白浓度和A₁荧光强度之间的线性关系图，所用仪器为紫外可见分光光度计，型号：Hp8453；荧光分光光度计，型号：FP-6500。

实施例7

共聚焦激光扫描显微镜下观察化合物A₁对活细胞MCF-7的染色：加配有化合物A₁、浓度为10μM的PBS缓冲液12μL于培养好MCF-7细胞的培养皿中，在37℃、5% CO₂的细胞培养箱中孵育120min。然后，PBS震荡漂洗5min×3，再加入细胞培养基，共聚焦激光扫描显微镜(Olympus)观察细胞形态。选取代表性区域，488nm通道激发，用油镜(100×)观察，重复三次。图3a为化合物A₁对活细胞MCF-7染色的白场显微照片，4b是化合物A₁对活细胞MCF-7染色的绿色通道荧光显微照片，4c是化合物A₁对活细胞MCF-7染色的红色通道荧光显微照片,4d是化合物A₁对活细胞MCF-7染色的绿色通道与红色通道荧光叠加显微照片。如图可观察到化合物A₁对MCF-7细胞染色。所用仪器为共聚焦激光扫描显微镜，型号：Olympus。激发光通道：488nm。

实施例8

共聚焦激光扫描显微镜下观察化合物A₂对活细胞MCF-7的染色：加配有化合物A₂、浓度为10μM的PBS缓冲液12μL于培养好MCF-7细胞的培养皿中，在37℃、5% CO₂的细胞培养箱中孵育120min。然后，PBS震荡漂洗5min×3，再加入细胞培养基，共聚焦激光扫描显微镜(Olympus)观察细胞形态。选取代表性区域，488nm通道激发，用油镜(100×)观察，重复三次。图5a为化合物A₂对活细胞MCF-7染色的白场显微照片，5b是化合物A₂对活细胞MCF-7染色的绿色通道荧光显微照片，5c是化合物A₂对活细胞MCF-7染色的红色通道荧光显微照片,5d是化合物A₁对活细胞MCF-7染色的绿色通道与红色通道荧光叠加显微照片。如图可观察到化合物A₁对MCF-7细胞染色。如图可观察到化合物A₂对MCF-7细胞染色。所用仪器为共聚焦激光扫描显微镜，型号：Olympus。激发光通道：488nm。

实施例9

共聚焦激光扫描显微镜下观察化合物A₁对活细胞MCF-7的染色：加配有化合物A₁、浓度为10μM和40μL浓度为10mg/mL的BSA的PBS缓冲液12μL于培养好MCF-7细胞的培养皿中，在37℃、5% CO₂的细胞培养箱中孵育120min。然后，PBS震荡漂洗5min×3，再加入细胞培养基，共聚焦激光扫描显微镜(Olympus)观察细胞形态。选取代表性区域，488nm通道激发，用油镜(100×)观察，重复三次。图6a为化合物A₁对活细胞MCF-7染色的白场显微照片，6b是化合物A₁对活细胞MCF-7染色的绿色通道荧光显微照片，6c是化合物A₁对活细胞MCF-7染色的红色通道荧光显微照片,6d是化合物A₁对活细胞MCF-7染色的绿色通道与红色通道荧光叠加显微照片。如图可观察到化合物A₁对MCF-7细胞染色。如图可观察到化合物A₁对MCF-7细胞染色。所用仪器为共聚焦激光扫描显微镜，型号：Olympus。激发光通道：488nm。

实施例10

共聚焦激光扫描显微镜下观察化合物A₂对活细胞MCF-7的染色：加配有化合物A₂、浓度为10μM和40μL浓度为10mg/mL的BSA的PBS缓冲液12μL于培养好MCF-7细胞的培养皿中，在37℃、5% CO₂的细胞培养箱中孵育120min。然后，PBS震荡漂洗5min×3，再加入细胞培养基，共聚焦激光扫描显微镜(Olympus)观察细胞形态。选取代表性区域，488nm通道激发，用油镜(100×)观察，重复三次。图7a为化合物A₂对活细胞MCF-7染色的白场显微照片，图7b是化合物A₂对活细胞MCF-7染色的绿色通道荧光显微照片，图7c是化合物A₂对活细胞MCF-7染色的红色通道荧光显微照片，图7d是化合物A₁对活细胞MCF-7染色的绿色通道与红色通道荧光叠加显微照片。如图可观察到化合物A₁对MCF-7细胞染色。如图可观察到化合物A₂对MCF-7细胞染色。所用仪器为共聚焦激光扫描显微镜，型号：Olympus。激发光通道：488nm。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。作为荧光染料是本发明新化合物的一种用途，不能认定本发明的化合物仅用于荧光染料，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在基于本发明化合物用作荧光染料的相同作用机理的考虑下，还可以做出若干简单推理，得出本发明的化合物的其他应用用途，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一类以荧光素为母体的荧光染料，具有通式I的结构：

其中：

M选自H，K⁺，Na⁺，-R₇，-OR₇和-(CH₂)_n-O-R₇；R₇为C_1-18烷基，n为1-18的整数；R₀和R₀’各自独立地选自H、F、Cl、Br和I；

R和R’各自独立地选自H、R₁、R₂、R₃、R₄、R₅和R₆；

X为C(CH₃)₂、O、S或Se；

Y^-为负离子。

2.权利要求1所述的荧光染料，其特征在于，所述的R₀和R₀’各自独立地选自H、F和Cl。

3.权利要求1所述的荧光染料，其特征在于，所述的R和R’各自独立地选自R₃、R₄、R₅和R₆。

4.权利要求1所述的荧光染料，其特征在于：所述的Y-选自卤素离子、ClO₄ ^-、PF₆ ^-、BF₄ ^-、CH₃COO^-和OTs^-。

5.权利要求1~4中任一权利要求所述的荧光染料，其特征在于，所述的M选自H，K⁺，Na⁺。

6.权利要求5所述的荧光染料，其特征在于，所述的R₀和R₀’相同，选自H和Cl。

7.权利要求6所述的荧光染料，其特征在于，所述的R和R’相同。

8.权利要求1所述的荧光染料的缀合物。

9.权利要求1所述的荧光染料的制备方法，包括如下步骤：

1)式Ⅱ的化合物与乌洛托品化合物按照投料摩尔比1:1-1:20，在10-180℃条件下反应4-48小时，制备式III的化合物；

反应溶剂为三氟乙酸、二氯甲烷、氯仿、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、甲苯、二甲苯、邻-二氯苯或其混合物；

2)式III的化合物与式i、ii、iii、iv或v的化合物按投料摩尔比1:3-1:5在85-90℃条件下反应1-24h，制备式I的化合物；

反应溶剂为三氟乙酸、二氯甲烷、氯仿、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、甲苯、二甲苯、邻-二氯苯或其混合物。

10.一种用于生物样品染色的组合物，包含权利要求1所述的荧光染料或权利要求8所述的荧光染料缀合物。

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