CN102040857A

CN102040857A - 一种赤藓红标准物质及其制备和应用

Info

Publication number: CN102040857A
Application number: CN201010541419XA
Authority: CN
Inventors: 马康
Original assignee: National Institute of Metrology
Current assignee: National Institute of Metrology
Priority date: 2010-11-11
Filing date: 2010-11-11
Publication date: 2011-05-04
Anticipated expiration: 2030-11-11
Also published as: CN102040857B

Abstract

本发明提供一种可用作标准物质的赤藓红产品，还提供了通过凝胶过滤色谱来制备这种赤藓红产品的方法，此外还提供了这种赤藓红产品用作标准物质的用途。

Description

一种赤藓红标准物质及其制备和应用

技术领域

本发明属于分析化学领域，具体来说，本发明提供了一种赤藓红标准物质以及这种赤藓红标准物质的制备方法和应用。

背景技术

近年来，食品安全问题风波不断，化学添加剂超标或质量等问题的频频发生，造成了重大人身伤亡和财产损失，危害了人们的身心健康，使食品安全问题愈加成为全社会关注的热点。因此，防止食品污染、控制食品质量是预防疾病、保障人民身体健康的重要措施。

赤藓红(Erythrosine)，化学名为2，4，5，7-四碘荧光素，又名樱桃红、食用红色14号、红色3号、食用赤色3号。赤藓红的性状为红至红褐色均匀粉末或颗粒，无臭。耐热(105℃)、耐还原性好，但耐光、耐酸性差，在酸性溶液中可发生沉淀，碱性条件下较稳定。对蛋白质染着性好，易溶于水呈樱桃红色，可溶于乙醇，甘油和丙二醇，不溶于油脂。

赤藓红可作食用色素，为常用食品添加剂，用于高糖果汁(味)饮料、碳酸饮料、配制酒、糖果、糕点上彩装等色素。各国对用于食品添加物的赤藓红相关指标作了相应的规定。我国《食品添加剂使用卫生标准》(GB2760-1996)规定：青梅最大使用量0.05g/kg；用于红绿丝、染色樱桃罐头(系装饰用)最大使用量0.10g/kg。赤藓红用于食品添加物的相关指标如表1。表1赤藓红用于食品添加物的相关指标

由于赤藓红具有一定的致畸性，应严格控制其在食品中的用量，因此为赤藓红含量测定制备相应的标准物质尤为必要。

由于绝大多数定量分析方法都是基于直接或间接与已知值比较而进行的，因此提供具有已知组成和性质的参考样品(即标准物质)供准确校正对于定量分析来说是非常必要的，这些标准物质在一种或多种性质方面具有高度一致的值。与常规的实验室试剂不同，在同一标准物质样品内部各部分之间以及同批次标准物质的不同样品之间具有高度一致性，从而使得这些标准物质能够用于在分析过程中校准分析仪器以及分析方法等。

标准物质通常要求高纯度，其组成与化学式高度一致并且化学稳定。由于对标准物质的这种严格要求，标准物质的制备一般需要在高度受控的条件下制造，以达到这种高纯度，并尽可能避免所含杂质对后续测定的影响。因此，标准物质的制备比常规分析化学试剂往往要复杂得多，经常需要多种高精度的分离纯化操作步骤(如HPLC等)，同时也造成其高的制造成本。

现有技术中尽管已经有赤藓红标准物质供应，但并未公开这些赤藓红标准物质的制备方法。可以想象，与大多数标准物质一样，这些赤藓红标准物质也都是通过复杂和高成本的多步骤高精度分离纯化方法而制得的。因此，仍需要一种能够通过简单方法制备的赤藓红标准物质。

发明内容

发明人意外地发现，利用商业供应的赤藓红产品作为起始原料，简单地通过凝胶过滤色谱分离就能够得到足以用作标准物质的赤藓红产品。本发明正是基于这种意外发现而完成的。

因此，在第一方面，本发明提供一种可用作标准物质的赤藓红产品，其含有纯度＞99％的赤藓红。

在一个实施方案中，所述赤藓红产品使用商业供应的赤藓红作为原料通过凝胶过滤色谱分离而制得。本领域公知的是，凝胶过滤(gel filtration chromatography)又称为体积排阻色谱(size exclusion chromatography)或分子筛色谱(molecular sieve chromatography)。

在一个具体实施方案中，所述凝胶过滤色谱使用的凝胶填料具有疏水基团。优选地，所述凝胶过滤色谱填料选自Sephadex LH系列(由GE HealthCare商业供应)以及TSK-GEL Alpha系列(由Tosoh Biosciences商业供应)。更优选地，所述凝胶过滤色谱填料选自Sephadex LH-20和TSK-GEL Alpha-4000。最优选地，所述凝胶过滤色谱填料是Sephadex LH-20。

在另一个具体实施方案中，所述凝胶过滤色谱使用水或醇水混合物作为洗脱剂。在一个优选的具体实施方案中，使用水作为洗脱剂。在另一个具体实施方案中，当使用醇水混合物作为洗脱剂时，所述醇可以是甲醇或乙醇，优选地所述混合物的醇水比为(0～1)∶(10～9)。

在另一个具体实施方案中，所述商业供应的赤藓红是食品添加剂级的赤藓红。有众多厂商可以商业供应这种赤藓红色素作为食品添加剂，例如上海染料研究所、天津市染料化学第二厂、上海嘉汇精细化工有限公司等。

另一方面，本发明提供由上述赤藓红产品制备而成的赤藓红溶液，其可以作为溶液标准物质来使用。考虑到不同分析方法和分析仪器中使用不同的溶剂体系，所述赤藓红溶液可以根据实际需要制备在各种溶剂中。

在一个具体实施方案中，所述赤藓红溶液中的溶剂选自水、醇及其混合物。在另一个具体实施方案中，所述赤藓红溶液是水溶液、甲醇溶液或乙醇溶液。在一个优选实施方案中，所述赤藓红溶液是水溶液。

此外，在另一方面中，本发明提供一种制备赤藓红标准物质的方法，其包括1)提供商业供应的赤藓红作为原料，和2)通过凝胶过滤色谱分离赤藓红，从而获得可用作标准物质的赤藓红。

在一个实施方案中，所述方法使用食品添加剂级的赤藓红作为起始原料。

在另一个实施方案中，所述方法使用的凝胶填料具有疏水基团。优选地，所述凝胶过滤色谱填料选自Sephadex LH系列(由GE HealthCare商业供应)以及TSK-GELAlpha系列(由Tosoh Biosciences商业供应)。更优选地，所述凝胶过滤色谱填料选自Sephadex LH-20和TSK-GEL Alpha-4000。最优选地，所述凝胶过滤色谱填料是Sephadex LH-20。

在另一方面中，本发明提供由此获得的赤藓红产品作为标准物质的用途。在一个实施方案中，所述赤藓红标准物质用于校准仪器。在另一个实施方案中，所述赤藓红标准物质用于待测样品中赤藓红含量的定量分析。

需要指出的是，本文中只是结合各个具体实施方案对本发明的技术特征进行了描述，然而这些技术特征并不限于这些具体实施方案。除非特别指出，本发明还包括所有上述技术特征在各种实施方案中的任意组合。

附图说明

图1示出了实施例1所得诱惑红产品在254nm下的HPLC谱图以及谱图分析结果。

图2示出了实施例1所得诱惑红纯品在540nm下的HPLC谱图以及谱图分析结果。

图3示出了实施例2中对赤藓红粗品中痕量杂质在254nm下的HPLC分析结果。

图4A-C示出了实施例1所得赤藓红纯品的ESI-MS图及其结构推断。

图5示出了实施例1所得赤藓红纯品的¹H-NMR谱图。

图6示出了由ESI-MS和¹H-NMR分析结果而推断的赤藓红结构。

图7示出了使用sepaxAmethyst-C18(150×4.6mm 5μm)色谱柱对赤藓红粗品的HPLC分析结果。

图8示出了使用SHIMADZU SHIM-PACK VP-ODS(150×4.6mm4.6μm)色谱柱对赤藓红粗品的HPLC分析结果。

具体实施方式

商业供应的赤藓红粗品中含有多种与赤藓红结构非常相似的杂质，它们的化学性质与赤藓红本身也非常相似(参见第2页表1)。通过常规分离纯化方法很难将这些杂质与赤藓红分离开。

发明人为制备赤藓红标准物质进行了大量实验研究，在此过程中，发明人意外地发现，用商业供应的赤藓红粗品作为原料通过凝胶过滤色谱可以获得可用作标准物质的赤藓红产品。经过HPLC检测，这种赤藓红产品的纯度大于99％，而作为原料的赤藓红粗品纯度仅仅为≥85％，并且还含有多种与赤藓红具有相似结构和性质的杂质(参见表1)。

尽管并不限于这种理论解释，基于对本发明意外结果的分析，发明人认为，本发明的分离方法中利用了凝胶过滤和反相色谱两方面的分离机理。通过凝胶过滤可以将赤藓红与其它分子量差异较大的杂质分离开，同时反相色谱分离过程基于赤藓红与杂质分子的极性差异将赤藓红与杂质分子分离开。因此，本发明利用带有疏水基团的凝胶过滤色谱填料，同时利用至少上述两种分离机理，将赤藓红与杂质分子分离开来，从而获得了可用作标准物质的赤藓红产品。

市场上有多家厂商提供带有疏水基团的凝胶过滤色谱填料。作为本领域常用的这类填料的实例，GE HealthCare公司商业供应Sephadex LH系列填料，其中又以Sephadex LH-20填料更常用。此外，Tosoh Biosciences公司也提供带有疏水基团的凝胶过滤色谱填料，其以TSK-GELAlpha系列填料商业供应，例如其中包括常用的TSK-GELAlpha-4000填料。

下面将结合附图以实施例来举例说明本发明，然而这些实施例仅仅是为了解释本发明的技术方案，它们并不能理解为限制本发明的保护范围。

实施例

除非特别指出，以下实施例按照本领域技术人员已知的常规方法进行，所用试剂使用本领域在相应分析和制备中常用级别的试剂。除非特别指出，本文中所述百分含量为质量百分比。

仪器和试剂

质谱仪：Finigan LCQ Advantage ion trap mass spectrometer(Thermo Finigan，San Jose，CA，USA)。

核磁共振谱仪：Inova-500核磁共振仪，使用TMS为内标。

HPLC：岛津10A高效液相色谱仪。

甲醇购于Fisher公司，色谱级；水为去离子水；醋酸铵为分析纯，购自北京化工厂。

实施例1.赤藓红标准物质的制备

称取100g Sephadex LH-20加入300ml色谱级甲醇溶胀15min，待凝胶充分溶胀后进行装柱(约2米长)，并用去离子水和色谱级甲醇交替清洗凝胶，重复3次。

称取约2g的赤藓红粗品(食品添加剂级，来自上海染料研究所)，置三角瓶中用30ml水溶解后过滤，滤液进行色谱柱分离纯化，采用去离子水作为流动相，共接收17个流份，分别标号为CXH-1～CXH-17，其中CXH-1接液200ml，CXH-2～CXH-4均接液30ml，CXH-5～CXH-10均接液50ml，CXH-11～CXH-17均接液100ml。流动相改为甲醇时接收4个流份，分别标号为CXH-18～CXH-21，CXH-18和CXH-19接液100ml，CXH-20和CXH-21接液200ml。此时，色谱柱中的样品被全部洗脱。将所有流份进行冷冻干燥，并分别对干燥后的样品进行液相色谱分析。

对所有流分进行HPLC检测，其中检测条件为：色谱柱：SHIMADZUSHIM-PACK VP-ODS(150×4.6mm 4.6μm)，流速：0.5ml/min，检测波长：540nm和254nm，柱温：30℃，进样量：5μl。

发明人意外地发现，其中第7至10流分含有纯度达到99％以上的赤藓红，经真空冷冻干燥机进行冷冻干燥，得到纯度为99％以上的干燥赤藓红标准物质(如图1和2所示)。

发明人还意外地发现，对于含有较低纯度赤藓红的其它流分，还可以通过再次进行上述凝胶过滤色谱得到进一步纯化，从而获得更多的纯度为99％以上的赤藓红。

实施例2.赤藓红痕量杂质的HPLC分析

将赤藓红中的痕量杂质进行HPLC分析，其分析结果见图3。从图中可以看出，赤藓红粗品中的痕量杂质在液相中分离效果较好，各个峰之间基本上达到了基线分离，有利于进行进一步的结构分析。

从以上实施例1和2的HPLC分析结果来看，我们对赤藓红样品进行了有效的纯化，其在检测波长为254nm和540nm的情况下均达到了99％以上的纯度。

实施例3.赤藓红的结构鉴定

将由实施例1制备的赤藓红纯品分别用电喷雾离子化质谱(ESI-MS)和核磁共振(¹H-NMR)进行结构鉴定，如图4和图5所示。

ESI-MS中给出了m/z：835[M-2Na+H]^-、663、537、508、381五个负离子峰，分别表示该化合物脱去一个结晶水和两个钠离子后产生835的负离子峰，接着脱去一个碘和羧基后得到663的峰，再脱去一个碘得到537的峰，381为508脱去一个碘后得到的峰。

从¹H-NMR进行分析可知，δ6.93(1H，s)和δ7.77(1H，s)为H-3’和H-6’，δ7.697为H-1和H-8，δ7.529和δ7.635为H-4’和H-5’。

从以上分析数据可以看出，该化合物的结构如图6，确定为赤藓红的结构。

实施例4.赤藓红标准物质的定值方法选择

4.1供试品溶液配制

精密称取实施例1制备的赤藓红纯品10.00mg置于10mL容量瓶中，加水适量使溶解并稀释至刻度，得浓度为1.00mg/mL的赤藓红溶液，供确定色谱分离条件以及定值用。

4.2色谱条件确定

4.2.1流动相的选择

分别考察了甲醇：0.02mol/L乙酸铵水溶液(65∶35)和甲醇：0.02mol/L乙酸铵水溶液(35∶65)两种流动相，由于甲醇：0.02mol/L乙酸铵水溶液(35∶65)流动相系统分析过程中没有峰出现，因此选择了甲醇：0.02mol/L乙酸铵水溶液(65∶35)作为流动相。

4.2.2色谱柱的选择：

分别考察了sepax Amethyst-C18(150×4.6mm 5μm)色谱柱和SHIMADZU SHIM-PACK VP-ODS(150×4.6mm 4.6μm)色谱柱，在使用sepax Amethyst-C18(150×4.6mm 5μm)色谱柱(如图7)条件下，杂质峰没有达到最佳的分离效果，而是堆积在一起，因此为了更好的对主成分纯度进行分析，最终选择了SHIMADZU SHIM-PACK VP-ODS(150×4.6mm 4.6μm)色谱柱(如图8)。

通过比较上述不同条件下的分析结果，最终确定了以下的色谱条件，确保了杂质不被包含在基线或主成分中，同时也保证杂质与主体达到分离的要求。具体条件如下：色谱柱：SHIMADZU SHIM-PACK VP-ODS(150×4.6mm 4.6μm)，流速：0.5ml/min，检测波长：540nm，柱温：30℃，进样量：5μl。

4.2.3供试品溶解溶剂的选择

称取2份赤藓红样品，分别加甲醇、水进行溶解。按照确定的HPLC条件分析，结果显示这两种溶剂对HPLC的分析结果无明显差异。为了方便将测试样品回收，因此选择水作为配制供试品溶液的溶剂。

实施例5.赤藓红定值试验

5.1赤藓红纯品的均匀性检查

从实施例1所制备赤藓红纯品的不同部位抽取5份样品，分别加水配成1mg/mL的溶液，每一份重复测量4次，其测量结果作为瓶间均匀性检验结果。再取5份样品中的任意一份，重复测量4次，其测量结果作为瓶内均匀性检验的结果。将瓶内与瓶间的检验结果用统计方法(F检验)进行统计学计算，判断其均匀性，检验结果见表2。由检验结果可知，实施例1制备的赤藓红纯品均匀性良好。表2赤藓红的均匀性检验结果(％)

5.2赤藓红溶液的室温放置稳定性检查

任意取以上制备的赤藓红样品溶液，避光放置于室温下。在七天后进行测定，每一点重复测量3次，其测量结果作为室温放置稳定性检验结果。检验结果见表3。由检验结果可知，本发明的赤藓红溶液避光室温放置一周内稳定。表3赤藓红的室温放置稳定性检验结果(％)

从以上HPLC结果分析来看，我们对商业供应的赤藓红粗品进行了有效的分离纯化，其在检测波长为254nm和540nm的情况下均达到了99％以上的纯度，且样品均匀性和稳定性较好，可作为标准物质使用。

总结与讨论

从以上各个分析结果可以看出，我们从商业供应的赤藓红粗品通过凝胶过滤色谱进行了有效的分离纯化，最终得到了纯度＞99％的赤藓红纯品，并对赤藓红进行了结构测定和相关的一些含量测定，实验结果证明这种制备赤藓红标准物质的方法稳定、可靠、可重复性强。

Claims

1.一种可用作标准物质的赤藓红产品，其含有纯度＞99％的赤藓红。

2.权利要求1的赤藓红产品，其使用商业供应的赤藓红作为原料通过凝胶过滤色谱分离而制得。

3.权利要求2的赤藓红产品，其中所述凝胶过滤色谱使用SephadexLH系列或TSKgel Alpha系列填料，优选地使用Sephadex LH-20或TSKgel Alpha-4000填料，更优选地使用Sephadex LH-20填料。

4.权利要求2的赤藓红产品，其中所述商业供应的赤藓红是食品添加剂级的赤藓红。

5.一种可用作标准物质的赤藓红溶液，其由权利要求1-4中任一项所述的赤藓红标准物质制得。

6.一种制备赤藓红标准物质的方法，其包括

1)提供商业供应的赤藓红作为原料，和

2)通过凝胶过滤色谱分离赤藓红，从而获得可用作标准物质的赤藓红。

7.权利要求6的方法，其中所述凝胶过滤色谱使用Sephadex LH系列或TSKgel Alpha系列填料，优选地使用Sephadex LH-20或TSKgelAlpha-4000填料，更优选地使用Sephadex LH-20填料。

8.权利要求6的方法，其中所述商业供应的赤藓红是食品添加剂级的赤藓红。

9.权利要求1-5中任一项所述的赤藓红标准物质作为标准物质的用途。