CN106645518B - 一种蜂胶原胶中氯霉素残留量的测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种蜂胶中氯霉素残留量的测定方法。用叔丁基甲醚溶解样品，加氢氧化钠除杂质，加正己烷降低氯霉素的溶解度，再用乙酸钠缓冲液反萃氯霉素，反萃溶液调成碱性后用乙酸乙酯萃取，氮气吹干浓缩后用水复溶，液相色谱‑串联质谱仪检测，内标法定量。本发明的样品前处理方法，回归方程相关系数达到0.99以上，测定低限为0.3μg/kg，在0.3μg/kg～3μg/kg添加浓度水平上的回收率为80％～110％，实验室内相对标准偏差≤15％。本发明方法充分应用氯霉素在各溶剂间溶解度的差异，解决了蜂胶样品的溶解、氯霉素的提取和干扰物的净化等问题。操作简便，灵敏度高，抗干扰能力强，定性定量准确。

Description

一种蜂胶原胶中氯霉素残留量的测定方法

技术领域

本发明属于兽药残留检测技术领域，具体涉及蜂胶原胶中氯霉素残留量的测定方法。

背景技术

蜂胶是蜜蜂从植物芽孢或树干上采集的树脂，将其混入其上颚腺、蜡腺的分泌物加工而成的一种具有芳香气味的胶状固体物。蜂胶植物来源广泛，化学成分复杂，已从中检测出二十余类、三百多种天然成分，其中包括一百多种类黄酮类化合物、一百多种芳香类化合物，还有丰富的有机酸、萜烯类物质、维生素、木脂体、酶类、矿物元素、氨基酸、多糖等具有生物活性的天然成分。蜂胶化学成分复杂，要检测其中的氯霉素残留量，不仅对仪器灵敏度、重现性与选择性的要求非常高，更关键的问题在于需要良好的样品前处理手段来提取和净化目标化合物。目前动物肌肉与内脏、水产品、乳制品、蜂蜜和蜂王浆等动物源食品中氯霉素残留量的检测方法已比较完善，国家标准、行业标准和相关文献均可参考，但均不适用于蜂胶中氯霉素残留量的检测。对蜂胶样品而言，可供参考的文献非常少，蜂胶的溶解、氯霉素的提取和干扰杂质的去除，均是难点所在，可以说目前没有较为理想的样品处理方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种蜂胶中氯霉素残留量的测定方法，解决蜂胶的溶解性、有效除去杂质、完整提取其中的氯霉素三者之间的矛盾。

为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种蜂胶原胶中氯霉素的残留量的测定方法，其步骤为：采用叔丁基甲醚溶解蜂胶样品，先加氢氧化钠溶液去除黄酮类等杂质，醚层加正己烷降低氯霉素的溶解度，再用乙酸钠缓冲液反萃氯霉素，反萃溶液调成碱性后用乙酸乙酯萃取，氮气吹干浓缩后用水复溶解，液相色谱-串联质谱仪检测，内标法定量。

进一步地，所述的测定方法的步骤为：称取样品1g，于离心管中，加20ng/mL氯霉素同位素内标标准工作液30μL，加叔丁基甲醚8mL，涡旋3min，使蜂胶充分溶解，加1％氢氧化钠溶液10mL，涡旋2min，8000r/min离心5min，上层叔丁基甲醚移入另一离心管，先加0.2mol/L乙酸钠溶液10mL，再加正己烷7mL，涡旋2min，4000r/min离心5min，下层乙酸钠溶液移入另一离心管，上层再加0.2mol/L乙酸钠溶液5mL反萃一次，4000r/min离心5min，合并两次乙酸钠溶液反萃液，用氨水调pH至10±0.2，加乙酸乙酯10mL，涡旋3min，4000r/min离心5min，上清液移入试管中，45℃氮吹浓缩至干；吹干的玻璃试管中加水1mL溶解待测化合物，旋涡2min，滤膜过滤，供液相色谱-串联质谱测定。

所述内标法定量的标准曲线的制备方法为：精密量取20ng/mL氯霉素标准工作液和20ng/mL内标标准工作液适量，用水稀释，配制成氯霉素浓度为0、0.1、0.5、1.0、2.0和5.0μg/L，氘代氯霉素浓度为0.3μg/L的系列标准溶液，供液相色谱-串联质谱仪测定；以氯霉素和氘代氯霉素的特征离子质量色谱峰面积比为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线，求回归方程和相关系数。

所述液相色谱的色谱条件为：色谱柱：Atlantis T₃，4.6mm×100mm，粒径3μm；流动相：体积比65％的甲醇－体积比35％的水；流速：0.3mL/min；柱温：40℃；进样量：20μL。

所述的质谱条件为：离子源：电喷雾离子源；扫描方式：负离子扫描；检测方式：多反应监测；喷雾电压：-4000V；雾化气：10；气帘气：10；碰撞气：10；辅助加热气温度：500℃；去集簇电压：-32V；聚焦电压：-75V；入口电压：-6V；碰撞池出口电压：-10V；驻留时间：0.1s；定性、定量离子对和碰撞能量见表1。

表1.定性、定量离子对和碰撞能量

所述的测定方法的定性方法为：通过样品色谱图的保留时间与相应标准品的保留时间、色谱峰的特征离子与相应浓度标准溶液色谱峰的特征离子相对照定性；试料与标准品保留时间的相对偏差不大于5％；试料特征离子的相对丰度与浓度相当标准溶液的相对丰度一致，相对丰度偏差不超过下表2的规定，则可判断试样中存在相应的被测物。

表2.相对离子丰度的允许偏差范围

相对离子丰度％	＞50	＞20～50	＞10～20	≤10
					允许的相对偏差％	±20％	±25	±30	±50

所述的测定方法的定量方法为：取样品溶液和标准溶液，按内标法以峰面积比计算；标准溶液及试料溶液中的氯霉素和氘代氯霉素的响应值均应在仪器检测的线性范围之内；

标准曲线校准：由求得a和b，则

试料中氯霉素残留量按式(2)计算：

式中：

A_s____标准溶液中氯霉素的峰面积；

A'_is____标准溶液中内标氘代氯霉素的峰面积；

c_s____标准溶液中氯霉素的浓度，单位为纳克每毫升；

c'_is____标准溶液中内标氘代氯霉素的浓度，单位为纳克每毫升；

c____样品溶液中氯霉素的浓度，单位为纳克每毫升；

c_is____试料溶液中内标氘代氯霉素的浓度，单位为纳克每毫升；

A____样品中氯霉素的峰面积；

A_is____样品中内标氘代氯霉素的峰面积；

X____供试样品中氯霉素的残留量，单位为微克每千克；

V____溶解残余物的体积，单位为毫升；

m____供试样品质量，单位为克；

D____稀释倍数。

本公式中稀释倍数为2；计算结果需扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。

有益效果：

目前，经过文献检索，得到两篇文章。对比文件1：中国蜂业2010,61(9)《高效液相色谱串联质谱测定蜂胶中的氯霉素药物残留量》；对比文件2：色谱2012,30(3)《高效液相色谱-串联质谱法测定蜂胶中的氯霉素》。对比结果见下表3。

表3：本申请与对比文件方法对比结果

由表3可知：蜂胶检测中最难的就是用什么溶剂溶解，溶解后的氯霉素又如何分离出来，蜂胶所含成分众多，因此，对检测的干扰特别大。按照对比文件1或对比文件2的方法，基本上无法检测。因为对比文件中，溶解蜂胶之后，接着就加水或酸稀释，其目的是把氯霉素提取出来，但是，这样操作的话，蜂胶马上就沉淀出来，形成的包裹体把氯霉素也包在里面，根本没提取出来，后面的所有步骤都不起作用了。本专利申请的方法，采用不同的溶剂液液萃取，杂质去除了，氯霉素始终留在溶解度高的那层溶剂里，条件比较温和。溶剂选择的难度在于：就只能选择强碱、乙醇和醚这几种。其中，强碱破坏氯霉素，乙醇溶解后氯霉素和杂质不好分离，醚溶解后其实也很难把氯霉素分离出来。本专利中的方法，除了最后都是用乙酸乙酯萃取氯霉素之外，前面的提取和除杂质方法都跟对比文件完全不同。检测图谱的效果图对比非常明显。

因此：本发明公开了一种蜂胶中氯霉素残留量的测定方法。采用叔丁基甲醚溶解蜂胶样品，先加氢氧化钠溶液去除黄酮类等杂质，醚层加正己烷降低氯霉素的溶解度，再用乙酸钠缓冲液反萃氯霉素，反萃溶液调成碱性后用乙酸乙酯萃取，氮气吹干浓缩后用水复溶解，液相色谱-串联质谱仪(HPLC-MS/MS)检测，内标法定量。本发明提供了蜂胶中氯霉素残留量检测的样品前处理方法，回归方程相关系数达到0.99以上，测定低限为0.3μg/kg，在0.3μg/kg～3μg/kg添加浓度水平上的回收率为80％～110％，实验室内相对标准偏差≤15％。本发明方法充分应用氯霉素在各溶剂间溶解度的差异，解决了蜂胶样品的溶解、氯霉素的提取和干扰物的净化等问题。前处理操作简便，灵敏度高，抗干扰能力强，定性定量科学准确。

附图说明

图1氯霉素标准溶液特征离子质量色谱图(0.3μg/L)，(320.9>257.0)；

图2氯霉素标准溶液特征离子质量色谱图(0.3μg/L)，(320.9>152.0)；

图3氯霉素同位素内标标准溶液特征离子质量色谱图(0.3μg/L)，(326.0/157.0)；

图4蜂胶空白样品特征离子质量色谱图，(320.9>257.0)；

图5蜂胶空白样品特征离子质量色谱图，(320.9>152.0)；

图6蜂胶空白样品特征离子质量色谱图，(326.0/157.0)；

图7蜂胶空白添加氯霉素样品特征离子质量色谱图(0.3μg/kg)，(320.9>257.0)；

图8蜂胶空白添加氯霉素样品特征离子质量色谱图(0.3μg/kg)，(320.9>152.0)；

图9蜂胶空白添加氯霉素样品特征离子质量色谱图(0.3μg/kg)，(326.0/157.0)；

图10对比文件1蜂胶空白添加氯霉素样品特征离子质量色谱图(0.3μg/kg)，(320.9>257.0)；

图11对比文件1蜂胶空白添加氯霉素样品特征离子质量色谱图(0.3μg/kg)，(320.9>152.0)；

图12对比文件1蜂胶空白添加氯霉素样品特征离子质量色谱图(0.3μg/kg)，(326.0/157.0)；

图13对比文件2蜂胶空白添加氯霉素样品特征离子质量色谱图(0.3μg/kg)，(320.9>257.0)；

图14对比文件2蜂胶空白添加氯霉素样品特征离子质量色谱图(0.3μg/kg)，(320.9>152.0)；

图15对比文件2蜂胶空白添加氯霉素样品特征离子质量色谱图(0.3μg/kg)，(326.0/157.0)。

具体实施方式

以下进一步描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明，而不构成对其权利的限制。

实施例1

1原理

蜂胶样品用叔丁基甲醚溶解，加氢氧化钠溶液去除黄酮类等杂质，醚层加正己烷降低氯霉素的溶解度，再用乙酸钠缓冲液反萃氯霉素，反萃溶液调成碱性后用乙酸乙酯萃取，氮气吹干浓缩后用水复溶解，液相色谱-串联质谱仪检测，内标法定量。

2试剂和材料

以下所用的试剂，除特别注明外均为分析纯试剂；水为符合GB/T 6682规定的一级水。

2.1氯霉素标准品：含量≥98％。

2.2氯霉素同位素内标物标准品：氘代氯霉素(D₅-氯霉素)100μg/mL，溶剂为乙腈。

2.3甲醇：色谱纯，Fisher公司。

2.4叔丁基甲醚：色谱纯，Fisher公司。

2.5乙酸乙酯。

2.6正己烷。

2.7 1％氢氧化钠溶液：称取1g氢氧化钠，加水溶解并定容至100mL。

2.8 0.2mol/L乙酸钠溶液：称取1.64g无水乙酸钠，加水溶解定容至100mL，用乙酸调pH至5.2±0.1。

2.9 100μg/mL氯霉素标准贮备液：精密称取氯霉素10mg，于100mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，配制成浓度为100μg/mL的氯霉素标准贮备液。

2.10 1μg/mL氯霉素标准中间液：精密量取100μg/mL的氯霉素标准贮备液1.00mL，于100mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配制成浓度为1μg/mL的氯霉素标准中间液。3.2.1120ng/mL氯霉素标准工作液：精密量取1μg/mL氯霉素标准中间液1.00mL，于50mL量瓶中，用水稀释至刻度，配制成浓度为20ng/mL的氯霉素标准工作液。

2.11 1μg/mL氯霉素同位素内标标准中间液：精密量取100μg/mL的氘代氯霉素标准液100μL，于10mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配制成浓度为1μg/mL的氯霉素同位素内标标准中间液。

2.12 20ng/mL氯霉素同位素内标标准工作液：精密量取1μg/mL的氯霉素同位素内标标准中间液1.00mL，于50mL量瓶中，用水稀释至刻度，配制成浓度为20ng/mL的氯霉素同位素内标标准工作液。

3仪器和设备

3.1液相色谱-串联质谱仪：UFLC-XR岛津液相色谱仪；API 3000三重四极杆串联质谱仪，ESI源，AB Sciex公司。

3.2分析天平：感量0.00001g，Sartorius公司。

3.3天平：感量0.01g，Sartorius公司。

3.4旋涡振荡器：MS 3basic，IKA公司。

3.5离心机：3-30K，SIGMA公司。

3.6氮吹仪：Biotage Turbo Vap

3.7滤膜：0.22μm，尼龙膜。

4试料的制备与保存

4.1试料的制备

取蜂胶样品空白，－18℃冰箱冷冻1小时，取出后立刻敲碎。

——取敲碎后的供试样品，作为供试样品。

——取敲碎后的空白样品，作为空白样品。

——取敲碎后的空白样品，添加适宜浓度的标准工作液，作为空白添加样品。

4.2试料的保存

－18℃以下保存。

5测定步骤

5.1提取与净化

称取样品1g±0.01g，于50mL离心管中，加20ng/mL氯霉素同位素内标标准工作液30μL，加叔丁基甲醚8mL，涡旋3min，使蜂胶充分溶解，加1％氢氧化钠溶液10mL，涡旋2min，8000r/min离心5min，上层叔丁基甲醚移入另一洁净50mL离心管，先加0.2mol/L乙酸钠溶液10mL，再加正己烷7mL，涡旋2min，4000r/min离心5min，下层乙酸钠溶液移入另一洁净50mL离心管，上层再加0.2mol/L乙酸钠溶液5mL反萃一次，4000r/min离心5min，合并两次乙酸钠溶液反萃液，用氨水调pH至10±0.2，加乙酸乙酯10mL，涡旋3min，4000r/min离心5min，上清液移入玻璃试管中，45℃氮吹浓缩至干。吹干的玻璃试管中加水1mL溶解待测化合物，旋涡2min，滤膜过滤，供液相色谱-串联质谱测定。

5.2标准曲线的制备

精密量取20ng/mL氯霉素标准工作液和20ng/mL内标标准工作液适量，用水稀释，配制成氯霉素浓度为0、0.1、0.5、1.0、2.0和5.0μg/L，氘代氯霉素浓度为0.3μg/L的系列标准溶液，供液相色谱-串联质谱仪测定。以氯霉素和氘代氯霉素的特征离子质量色谱峰面积比为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线，求回归方程和相关系数。

5.3测定

5.3.1液相色谱条件

5.3.1.1色谱柱：Atlantis T₃(4.6mm×100mm，粒径3μm)。

5.3.1.2流动相：甲醇－水(65+35，体积比)。

5.3.1.3流速：0.3mL/min。

5.3.1.4柱温：40℃。

5.3.1.5进样量：20μL。

5.3.2质谱条件

5.3.2.1离子源：电喷雾离子源。

5.3.2.2扫描方式：负离子扫描。

5.3.2.3检测方式：多反应监测。

5.3.2.4喷雾电压：-4000V。

5.3.2.5雾化气：10。

5.3.2.6气帘气：10。

5.3.2.7碰撞气：10。

5.3.2.8辅助加热气温度：500℃。

5.3.2.9去集簇电压：-32V。

5.3.2.10聚焦电压：-75V。

5.3.2.11入口电压：-6V。

5.3.2.12碰撞池出口电压：-10V。

5.3.2.13驻留时间：0.1s。

5.3.2.14定性、定量离子对和碰撞能量见表1。

表1定性、定量离子对和碰撞能量

5.3.3测定法

5.3.3.1定性测定

通过样品色谱图的保留时间与相应标准品的保留时间、色谱峰的特征离子与相应浓度标准溶液色谱峰的特征离子相对照定性。试料与标准品保留时间的相对偏差不大于5％；试料特征离子的相对丰度与浓度相当标准溶液的相对丰度一致，相对丰度偏差不超过表2的规定，则可判断试样中存在相应的被测物。

表2相对离子丰度的允许偏差范围

相对离子丰度％	＞50	＞20～50	＞10～20	≤10
					允许的相对偏差％	±20％	±25	±30	±50

5.3.3.2定量测定

取样品溶液和标准溶液，按内标法以峰面积比计算。标准溶液及试料溶液中的氯霉素和氘代氯霉素的响应值均应在仪器检测的线性范围之内。

5.4空白试验

除不加样品外，采用完全相同的步骤进行平行操作。

5.5结果计算和表述

标准曲线校准：由求得a和b，则

试料中氯霉素残留量按式(2)计算：

式中：

A_s____标准溶液中氯霉素的峰面积；

A'_is____标准溶液中内标氘代氯霉素的峰面积；

c_s____标准溶液中氯霉素的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)；

c'_is____标准溶液中内标氘代氯霉素的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)；

c____样品溶液中氯霉素的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)；

c_is____试料溶液中内标氘代氯霉素的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)；

A____样品中氯霉素的峰面积；

A_is____样品中内标氘代氯霉素的峰面积；

X____供试样品中氯霉素的残留量，单位为微克每千克(μg/kg)；

V____溶解残余物的体积，单位为毫升(mL)；

m____供试样品质量，单位为克(g)；

D____稀释倍数。

本公式中稀释倍数为2。

注：计算结果需扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。

5.6检测方法灵敏度、准确度和精密度

5.6.1灵敏度

定量限的确定，是根据信噪比(S/N)的值来确定的。在空白蜂胶中添加0.3μg/kg的氯霉素标准溶液，测定其信号与噪声的比值，当S/N≥10时且回收率和相对标准偏差均符合残留检测方法要求时的浓度为定量限。

实验结果：本方法的定量限为0.3μg/kg。

5.6.2准确度

准确称取1.0g空白样品于50mL离心管中，加入己知浓度的系列标准工作液，制成含氯霉素浓度分别为0.3、0.6、3.0μg/kg的组织样品，每个浓度做6个平行，按样品前处理过程处理后测定，计算加标回收率。

实验结果：本方法在0.3μg/kg～3μg/kg添加浓度水平上的回收率为80％～110％。

5.6.3精密度

准确称取1.0g空白试料于50mL离心管中，加入己知浓度的系列标准工作液，制成含氯霉素浓度分别为0.3、0.6、3.0μg/kg的组织样品，每个浓度做6个平行，按样品前处理过程处理后测定，计算室内相对标准偏差。

实验结果：本方法的实验室内相对标准偏差≤15％。

6结果

应用本方法检测了蜂胶原胶样品共100个，按上述测定步骤处理样品，在上述测定条件下采用LC-MS/MS进行检测，其中有6个检出氯霉素，含量分别为1.3、2.1、2.5、3.6、14和46μg/kg，其余样品含量结果均小于0.3μg/kg。

Claims (6)

1.一种蜂胶原胶中氯霉素残留量的测定方法，采用叔丁基甲醚溶解蜂胶样品，先加氢氧化钠溶液去除黄酮类等杂质，醚层加正己烷降低氯霉素的溶解度，再用乙酸钠缓冲液反萃氯霉素，反萃溶液调成碱性后用乙酸乙酯萃取，氮气吹干浓缩后用水复溶解，液相色谱-串联质谱仪检测，内标法定量，其特征在于样品处理具体步骤为：称取样品1g，于离心管中，加20ng/mL氯霉素同位素内标标准工作液30μL，加叔丁基甲醚8mL，涡旋3min，使蜂胶充分溶解，加1％氢氧化钠溶液10mL，涡旋2min，8000r/min离心5min，上层叔丁基甲醚移入另一离心管，先加0.2mol/L乙酸钠溶液10mL，再加正己烷7mL，涡旋2min，4000r/min离心5min，下层乙酸钠溶液移入另一离心管，上层再加0.2mol/L乙酸钠溶液5mL反萃一次，4000r/min离心5min，合并两次乙酸钠溶液反萃液，用氨水调pH至10±0.2，加乙酸乙酯10mL，涡旋3min，4000r/min离心5min，上清液移入试管中，45℃氮吹浓缩至干；吹干的玻璃试管中加水1mL溶解待测化合物，旋涡2min，滤膜过滤，供液相色谱-串联质谱测定。

2.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于：所述内标法定量的标准曲线的制备方法为：精密量取20ng/mL氯霉素标准工作液和20ng/mL内标标准工作液适量，用水稀释，配制成氯霉素浓度为0、0.1、0.5、1.0、2.0和5.0μg/L，氘代氯霉素浓度为0.3μg/L的系列标准溶液，供液相色谱-串联质谱仪测定；以氯霉素和氘代氯霉素的特征离子质量色谱峰面积比为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线，求回归方程和相关系数。

3.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述液相色谱的色谱条件为：色谱柱：Atlantis T₃，4.6mm×100mm，粒径3μm；流动相：体积比65％的甲醇－体积比35％的水；流速：0.3mL/min；柱温：40℃；进样量：20μL。

4.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于：所述的质谱仪的质谱条件为：离子源：电喷雾离子源；扫描方式：负离子扫描；检测方式：多反应监测；喷雾电压：-4000V；雾化气：10；气帘气：10；碰撞气：10；辅助加热气温度：500℃；去集簇电压：-32V；聚焦电压：-75V；入口电压：-6V；碰撞池出口电压：-10V；驻留时间：0.1s；定性、定量离子对和碰撞能量：氯霉素的定性离子对为m/z 320.9>152.0和m/z 320.9>257.0，其中m/z 320.9>152.0为定量离子对，碰撞能量分别为-25V和-17V；氘代氯霉素的定性离子对和定量离子对为m/z 326.0/157.0，碰撞能量为-25V。

5.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于：所述的测定方法的定性方法为：通过样品色谱图的保留时间与相应标准品的保留时间、色谱峰的特征离子与相应浓度标准溶液色谱峰的特征离子相对照定性；试料与标准品保留时间的相对偏差不大于5％；试料特征离子的相对丰度与浓度相当标准溶液的相对丰度一致；相对离子丰度大于50％时，容许偏差为±20％；相对离子丰度大于20％小于等于50％时，容许偏差为±25％；相对离子丰度大于10％小于等于20％时，容许偏差为±30％；相对离子丰度小于等于10％时，容许偏差为±50％；相对丰度偏差不超过以上允许偏差范围，则可判断试样中存在相应的被测物。

6.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于：所述的测定方法的定量方法为：取样品溶液和标准溶液，按内标法以峰面积比计算；标准溶液及试料溶液中的氯霉素和氘代氯霉素的响应值均应在仪器检测的线性范围之内；

标准曲线校准：由求得a和b，则

试料中氯霉素残留量按式(2)计算：

式中：

A_s————标准溶液中氯霉素的峰面积；

A'_is————标准溶液中内标氘代氯霉素的峰面积；

c_s————标准溶液中氯霉素的浓度，单位为纳克每毫升；

c'_is————标准溶液中内标氘代氯霉素的浓度，单位为纳克每毫升；

c————样品溶液中氯霉素的浓度，单位为纳克每毫升；

c_is————试料溶液中内标氘代氯霉素的浓度，单位为纳克每毫升；

A————样品中氯霉素的峰面积；

A_is————样品中内标氘代氯霉素的峰面积；

X————供试样品中氯霉素的残留量，单位为微克每千克；

V————溶解残余物的体积，单位为毫升；

m————供试样品质量，单位为克；

D————稀释倍数；

本公式中稀释倍数为2；计算结果需扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。